Name: Manipulation neuropharmacologiques de Restrained et vol libre abeilles, Apis mellifera (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Découvrez les méthodes d'administration de médicaments chez Apis mellifera, y compris les injections thoraciques et ocellaires ainsi que la volatilisation. Ces techniques permettent d'étudier la neurobiologie des comportements sociaux chez cet organisme non modèle.

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Ce projet a été financé par DP0986021 de subvention ARC et 585442 subvention NHMRC. ABB est soutenu par une bourse ARC Future Fellowship (FT140100452). JAP est soutenu par une bourse iMQRES décernée par l’Université Macquarie et par un DAAD-Doktorandenstipendium décerné par l’Office allemand d’échanges universitaires. JMD est soutenu par le CNRS et l’Université Paul Sabatier.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites ci-dessus permettent un traitement simple, efficace et robuste soit en vol libre ou les abeilles attelés. Ces méthodes sont compatibles avec de nombreux paradigmes expérimentaux et les questions biologiques (tableau 1). Toutes les méthodes de vol libre peut facilement être appliqué pour les abeilles attelés. L&#39;inverse est moins de succès, cependant, puisque la retenue temporaire et les méthodes de traitement invasives peuvent souvent compromettre la capacité de vol des abeilles...

Depuis Karl von Frisch élucidé leur langue de danse 1, les abeilles sont restés une espèce d&#39;étude populaire pour les chercheurs dans le comportement des animaux et de la neurobiologie. Ces dernières années , une myriade de nouvelles disciplines ont vu le jour à l&#39;intersection de ces deux domaines, et plusieurs autres disciplines (par exemple, la biologie moléculaire, la génomique et l&#39;informatique) se sont posés à côté d&#39; eux. Cela a conduit à un développement rapide de nouvelles théories et des modèles pour comprendre comment le comportement résulte de l&#39;activité au sein des systèmes nerveux. En raison du mode de vie unique, riche répertoire comportemental, et la facilité de manipulation expérimentale et pharmacologique, les abeilles sont restés à l&#39;avant-garde de cette révolution. Les abeilles sont utilisées pour étudier les questions neurobiologiques de base telles que celles d&#39; apprentissage sous - jacente et de la mémoire 2,3, la prise de décision 4, olfactive 5 ou traitement visuel 6. Au cours des dernières années, le députéey abeille a même été utilisé comme modèle pour l&#39; étude des sujets généralement réservés pour la recherche médicale, tels que les effets des drogues toxicomanogènes 7 - 11, le sommeil 12, le vieillissement 13, ou les mécanismes sous - jacents anesthésie 14. Contrairement aux modèles génétiques classiques organismes (par exemple, D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), il existe très peu d&#39; outils génétiques disponibles pour manipuler les fonctions neurales dans les abeilles, bien que cela soit en train de changer 15. Au lieu de cela, des études d&#39;abeilles ont surtout compté sur des manipulations pharmacologiques. Cela a été un grand succès; toutefois, la diversité de la recherche d&#39;abeilles est telle que toute une gamme de procédés pour une administration pharmacologique sont nécessaires. La recherche avec des abeilles mellifères aborde très diverses questions, est étudiée par des chercheurs de différentes disciplines et d&#39;horizons, et utilise une variété d&#39;approches expérimentales. Beaucoup reseles questions arc exigent des abeilles à être soit en vol libre, interagir librement dans leur colonie, ou les deux. Cela peut rendre difficile de garder la trace des animaux de laboratoire individuels, et rend retenue ou cathétérisme irréalisable. Pour tenir compte de la diversité de la recherche du miel d&#39;abeille, une variété de méthodes d&#39;administration de médicaments sont nécessaires, permettant une administration robuste et flexible tout en assurant que les profils pharmacocinétique et pharmacodynamique, invasivité de la méthode, et sa fiabilité, conviennent le paradigme en question. En raison de ces divers besoins, la plupart des groupes de recherche ont mis au point leurs propres méthodes d&#39;administration de médicaments uniques. Jusqu&#39;à présent, cela a été une force de la communauté de recherche des abeilles; elle a conduit au développement de réseaux de méthodes permettant l&#39;administration du même médicament dans des circonstances différentes. Notre but ici est de ne pas développer une seule méthode normalisée pour les manipulations pharmacologiques des abeilles, mais plutôt de mettre en évidence les méthodes quise sont avérés particulièrement efficaces, et aider les chercheurs à adopter ces. Nous discutons des principes de base de la façon dont ils travaillent, ainsi que leurs avantages et leurs inconvénients.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>Tout fournisseur fera</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma-Aldrich</td><td>P9333&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49159</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cire de protection</td><td>Dentaurum</td><td>124-305-00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>diméthylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>95 % Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>23 G Aiguille NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Forsceps très fin</td><td>Dumont</td><td>0208-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>Électrode extracteur</td><td>SRI</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet Microinjecteur</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.01</td><td></td></tr><tr><td>Eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219274</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulateur manuel</td><td>Brinkmann Instrumentenbau</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur électronique</td><td>Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td><td>Unité junior Stéréomicroscope XYZ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Fer à souder</td><td>Weller</td><td>WESD51</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10 000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10 000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22912</td><td></td></tr><tr><td>petite boîte de Pétri</td>Huile minérale <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube à centrifuger</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr> pince <tr><td></td><td>Australian Entomological Supplies Porte-lame</td><td></td><td></td></tr><tr><td>et brise-lames</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E130</td><td></td></tr><tr><td>Lame</td> <td>de rasoir à double tranchant en plumesThermoFisher Scientific</td><td>50-949-135</td><td></td></tr><tr><td>Fil</td><td></td><td></td> Nichrome <td>N’importe quel fournisseur fera</td></tr><tr><td>Fils électriques N’importe</td><td></td><td></td><td>quel fournisseur fera Peinture</td></tr><tr><td>pour modèle</td><td>Tamiya USA</td><td>Dépend de la couleur</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur répétitif</td><td>Hamilton company</td><td>PB-600-1</td><td></td></tr><tr><td>Seringue en verre</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>système de visualisation par fluorescence</td><td>Nightsea</td><td>SFR-GR</td><td></td></tr><tr><td>réticule</td><td>ProSciTech</td><td>S8014-24</td><td></td></tr><tr><td>microcapillaire avec support</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td></td><td></td> liquide <td>Tout fournisseur fera</td></tr><tr><td>Thermocouple</td><td>Digitech</td><td>QM-1324</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

manipulation neuropharmacologiques de restrained et vol libre abeilles,<em&gt; apis mellifera</em

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Les abeilles démontrent les capacités d&#39;apprentissage étonnantes et le comportement social de pointe et de la communication. En outre, leur cerveau est petit, facile à visualiser et à étudier. Par conséquent, les abeilles ont longtemps été un modèle privilégié parmi les neurobiologistes et neuroethologists pour étudier les bases neurales du comportement social et naturel. Il est important, cependant, que les techniques expérimentales utilisées pour étudier les abeilles ne pas interférer avec les comportements à l&#39;étude. À cause de cela, il a été nécessaire de développer une gamme de techniques pour la manipulation pharmacologique des abeilles. Dans cet article, nous démontrons des méthodes pour traiter les abeilles sobres ou en vol libre avec une large gamme d&#39;agents pharmacologiques. Ceux-ci comprennent à la fois des méthodes non invasives telles que les traitements oraux et topiques, ainsi que des méthodes plus invasives qui permettent l&#39;administration de médicaments précis, soit de manière systémique ou localisée. Enfin, nous discutons des avantages et des inconvénients de chaque méthode et de décrireobstacles et la meilleure façon de les surmonter communs. Nous concluons par une discussion sur l&#39;importance d&#39;adapter la méthode expérimentale aux questions biologiques plutôt que l&#39;inverse.

Une sélection de résultats représentatifs pour les méthodes décrites ci-dessus sont présentés, principalement pour démontrer que les méthodes permettent aux agents pharmacologiques pour atteindre le cerveau et influent sur le comportement des abeilles. Effets spécifiques sur les processus du cerveau peuvent être facilement obtenues après l&#39;injection thorax. Parce q...

Ce manuscrit décrit plusieurs protocoles pour l&#39;administration d&#39;agents pharmacologiques pour les abeilles, y compris des méthodes non invasives simples pour les abeilles en vol libre, ainsi que des variantes plus invasives qui permettent le traitement des abeilles sobres localisé précis.

Manipulation neuropharmacologiques de Restrained et vol libre abeilles,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

L'objectif général de ces procédures est d'administrer de manière fiable et robuste des agents pharmacologiques au système nerveux central d'abeilles ou d'insectes similaires. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la sociobiologie, de la neuroéthologie et de l'apiculture, par exemple en explorant les mécanismes neurologiques du comportement social. Le principal avantage de ces techniques réside dans la possibilité d'étudier la neurobiologie chez des organismes non modèles, comme l'abeille, pour lesquels les outils génétiques sont actuellement limités.La procédure sera démontrée par Jenny Plath, une étudiante diplômée du laboratoire de neuro-éthologie de l'Université Macquarie. Les médicaments peuvent être administrés par voie orale ou par injection. Les injections peuvent être réalisées dans le thorax, dans l'ocelle ou dans le tractus oculaire. Les injections dans l'ocelle permettent d'acheminer des médicaments vers l'ensemble de la tête, tandis que les injections dans le tractus oculaire ciblent des régions spécifiques du cerveau. Pour toutes les injections, fabriquez un microscalpel en cassant l'angle d'un rasoir à double tranchant à l'aide d'un porte-lame. Fixez le fragment de lame au porte-lame de manière à former un bon scalpel doté d'une pointe bien aiguisée.Pour une injection thoracique, disséquer un trou de deux millimètres juste au-dessus du scutellum, à côté du processus postérieur de l'aile du thorax d'une abeille. Éviter de couper trop profondément, car cela pourrait endommager les muscles du vol, et faire attention d'éviter les charnières des ailes. Idéalement, ne couper que trois côtés afin que le lambeau de cuticule puisse être replié par la suite pour refermer le site de la blessure.Injectez maintenant le médicament dans le thorax. Ensuite, replacez le lambeau de cuticule par-dessus le trou ; après dix heures, il se réattachera et s'obturera. Pour accéder au cerveau, fixez la tête d'une abeille sanglée en remplissant l'interstice du cou avec de la cire dentaire réchauffée à la main, afin d'éviter d'endommager les récepteurs olfactifs des antennes ou d'autres cellules pouvant être importantes pour le comportement de l'abeille.L'antenne peut également être fixée avec de la cire dentaire. Ensuite, à l'aide du microscalpel, retirer soigneusement la lentille de l'ocelle médian en insérant la pointe du microscalpel sous la lentille et en détachant délicatement celle-ci de la capsule céphalique. Pour que le médicament pénètre dans toute la capsule céphalique, déposer soigneusement le médicament dans l'orifice de l'ocelle et attendre qu'il s'imprègne. Alternativement, des sous-régions du cerveau peuvent être ciblées par injection via le tractus ocellaire, par exemple en injectant 250 nanolitres de produit à une profondeur de 50 micromètres pour atteindre les structures cérébrales adjacentes à l'ocelle. Ensuite, retirez la cire dentaire et laissez l'abeille se reposer un moment avant de poursuivre la procédure expérimentale. Pour préparer les aiguilles d'injection, tirez des tubes en verre d'un millimètre de diamètre afin d'obtenir une pointe d'environ 0,5 centimètre de long.Ensuite, sous un microscope stéréo, cassez les extrémités afin d'obtenir une ouverture d'environ 10 à 15 micromètres de diamètre externe. Cette mesure peut être effectuée à l'aide d'une échelle graduée sur une micrométrique. Chargez maintenant une aiguille d'injection avec la solution du médicament.Ensuite, sur le système d'injection, fixez l'aiguille de microinjection chargée sur le micromanipulateur. Testez le système d'injection dans de l'huile minérale et étalonnez-le pour délivrer une giclée de 0,5 à deux nanolitres, selon la taille de la structure cérébrale visée. À l’aide d’un réticule, mesurez le diamètre des gouttelettes afin de calculer leur volume.Pour fixer la tête d'une abeille harnachée, utilisez de la cire dentaire douce, comme précédemment. Ensuite, pratiquez une ouverture dans la partie antérieure de la capsule céphalique à l'aide d'un microscalpel en effectuant trois incisions : une juste en dessous de l'ocelle médian ; une au niveau de la bordure de l'œil droit ou gauche ; et une au-dessus des pédoncules anténaires. Utilisez un morceau de cire dentaire pour maintenir le lambeau ouvert en place.Ensuite, repousser délicatement les glandes et la trachée à l'aide de pinces fines et pratiquer une petite rupture dans la néurilemme au-dessus de la structure cérébrale ciblée. Insérer maintenant la pointe de la pipette en verre dans la région cérébrale souhaitée, idéalement perpendiculairement à la surface du cerveau et à la profondeur requise pour atteindre la structure ciblée. Puis injecter le bolus de médicament.Lorsque l'on cible des régions cérébrales appariées, effectuez une injection dans chaque hémisphère afin d'affecter les deux hémisphères. Si un colorant fluorescent est injecté avec le bolus, les régions superficielles du cerveau peuvent être observées à l'aide d'une lumière fluorescente. D'autres régions peuvent être examinées ultérieurement par microscopie confocale.Après l'injection, remettez en place le lambeau de cuticule et scellez la coupure en faisant fondre un cristal d'eicosane d'environ un millimètre de diamètre sur la cuticule à l'aide d'un fil fin fixé à un fer à souder microscopique. Cela réduira considérablement la mortalité. Pour administrer un produit aussi volatil qu'à partir d'un filament de nichrome chauffé, préparez-le dissous dans de l'éthanol pur.Percez soigneusement des trous dans le couvercle d'un tube de 50 millimètres et faites passer les deux fils électriques à travers ces trous. Pour créer un filament, enroulez étroitement un fil de nichrome autour d'un clou, fixez le fil de nichrome à deux fils électriques, puis retirez le clou. Ensuite, fixez les fils et scellez les trous avec du silicone.Connectez maintenant les fils à une source d'alimentation. Utilisez un thermocouple pour mesurer la température du filament. Pour étalonner l'appareil, pipetez soigneusement deux microlitres de solution de médicament sur le filament et laissez l'éthanol s'évaporer complètement à température ambiante.Faites varier la tension dans le courant afin que le bolus de médicament se volatilise dans les dix secondes suivant l'application du courant. Le médicament ne doit pas être détruit par décomposition thermique. Un précipité peut généralement être observé sur le filament sec s'il est examiné attentivement.Pour administrer les médicaments à une abeille, introduisez une abeille en vol libre ou harnachée dans le tube et fixez soigneusement le couvercle en laissant les fils à l'extérieur. Ensuite, allumez la source d'alimentation pendant 10 secondes et attendez encore 50 secondes afin que le composé volatilisé soit entièrement absorbé par l'abeille avant de retirer celle-ci. Des effets spécifiques sur les processus cérébraux peuvent être facilement obtenus après une injection dans le thorax.Par exemple, des bloqueurs de la transcription ont été administrés à l'aide de cette technique afin d'identifier les phases de la mémoire nécessitant une expression génique. Des effets sélectifs et dépendants du temps sur les tâches de mémoire ont été obtenus. La diffusion de molécules dans l'hémolymphe de la tête entraîne des effets rapides et dépendants de la dose, obtenus par injection dans l'ocelle.À certaines concentrations de dose, des allatostatines diffusément concentrées ont réduit la performance dans un test d'apprentissage olfactif. Pour tester les propriétés spatiales et temporelles de régions cérébrales spécifiques, des abeilles fixées ont été entraînées selon un paradigme de conditionnement olfactif à la réponse de prolongation de l'antenne (PER), puis injectées avec de la procaïne dans les calices du corps mushroom ou dans les lobes verticaux. Lorsque les abeilles ont été soumises à un test de rappel, la performance n'a été altérée que chez les abeilles ayant reçu une injection bilatérale.Dans une arène comportant plusieurs distributeurs, des abeilles ont été délicatement capturées lorsqu'elles s'apprêtaient à quitter un distributeur contenant du saccharose à une molaire. Les abeilles capturées ont reçu un traitement de 100 microgrammes de cocaïne sous forme de base libre volatilisée, ce qui a entraîné une augmentation de la recherche de nourriture aux distributeurs à demi-molaire, mais pas à ceux à deux molaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment administrer des substances aux abeilles en vol libre ou immobilisées, soit par injection, soit par voie volatilisée.Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent facilement être appliquées à un grand nombre d'abeilles en quelques heures. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la conditionnement de l'extension du proboscis, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la neurobiologie de l'apprentissage et de la mémoire.

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Manipulation neuropharmacologiques de Restrained et vol libre abeilles,

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