Name: Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Apprenez la transduction rétrovirale des cellules T auxiliaires murines pour étudier les mécanismes de différenciation et les voies régulatrices impliquées dans la fonction immunitaire.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques (BBSRC) (BB/H018573/1) et une subvention de BD Biosciences.

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Les auteurs n’ont aucun intérêt conflictuel dans la publication de ce travail.

Rétrovirale surexpression de gènes à médiation est un moyen puissant pour analyser la fonction des cellules T auxiliaires, comme le développement et la fonction est souvent déterminée par le niveau des régulateurs clés de l&#39;expression. Cependant, une interprétation prudente des résultats est nécessaire parce que les niveaux d&#39;expression significativement supérieurs à ceux du gène endogène peuvent introduire de nombreux artefacts. Par conséquent, cette technique devrait être combinée avec d&#39;autres pour vérifier la pertinence de la fonction. Par exemple, la surexpression devrait être complété par une expression réduite en utilisant des ARNsi ou KOs géniques si disponible. Avec miARN, nous complétions expériences de surexpression avec ceux de blocage en utilisant des virus qui surexprimés miARN artificiel ciblant les sites qui ont agi comme des inhibiteurs compétitifs pour un miRNA 15. les cellules transduites rétroviraux peuvent également être utilisés dans des dosages biochimiques impliquant l&#39;ARN et l&#39;analyse des protéines. Toutefois, une limitation majeure de ces expériences est l&#39;efficacité de la résolution de transductionUlting dans une population mixte de cellules transduites et non transduites. Par conséquent, ces essais seront très probablement besoin de tri de la GFP + population. Enfin, tests in vitro de différenciation doivent être combinées avec des expériences in vivo, et une façon d&#39;y parvenir est par le transfert adoptif des cellules T transduites à des souris et à la suite de leur différenciation et leur effet sur la réponse immunitaire. L&#39;une des principales limitations de ce système est la taille du génome de l&#39;ARN qui peut être encapsidé dans la capside rétrovirale. Dans notre expérience, la taille de l&#39;insert maximum pour MIG système rétroviral qui donne une bonne production de virus est de 3-3,5 kb. Par conséquent, les gènes plus grands ne peuvent pas être analysés avec ce système, car ils donnent des titres viraux pauvres. Cependant, la plupart des gènes sont plus petites que cette dimension si ce système est utile pour une grande variété d&#39;études génétiques. Avec une transduction rétrovirale, plusieurs variantes dans le cadre de ces protocols ont été utilisés. De nombreux chercheurs ont utilisé des lignées cellulaires d&#39;encapsidation qui expriment de manière stable les gènes rétroviraux (par exemple , référence 16). Cependant, nous avons obtenu les titres les plus élevés en utilisant des cellules HEK 293T standard par co-transfection du vecteur de virus auxiliaire pCL-Eco. L&#39;isolement des cellules auxiliaires T naïfs peut également être réalisée par le tri, plutôt que le bourrelet et la séparation des cellules protocole de colonne magnétique de cellules, mais cela nécessite un accès à un trieur de cellules, et les coûts pour le temps de tri sont généralement plus élevées que les réactifs de perles. Enfin, il existe des variations sur les conditions d&#39;activation utilisées pour différencier les cellules T auxiliaires dans les différents sous-ensembles. Par exemple, la stimulation du TCR des cellules trop longtemps avant l&#39; exposition Treg conditions induisant peut inhiber leur induction 16. Cela peut être un problème parce que l&#39;expression rétrovirale nécessite la division cellulaire induite par la stimulation des cellules. Néanmoins, nous avons trouvé efficace induction Treg utilisant ce protocole avec O / N activation avant la transduction rétrovirale. Au sein de ces protocoles, l&#39;application réussie nécessite plusieurs facteurs. préparations de retrovirus à titre élevé ont besoin transfection efficace des cellules HEK 293T d&#39;ADN afin de haute qualité et précisément préparé 2x HBS sont importants. En outre, la densité cellulaire des cellules HEK 293T doit être d&#39;environ 50% au point de transfection parce que la bonne expression de l&#39;ADN transfectées exige que les cellules sont en pleine croissance, et cela va être inhibée si les cellules sont trop rares ou dense. Les cellules à la densité optimale pendant la transfection devraient atteindre la confluence à un moment donné au cours des étapes de collecte de virus, mais ils vont continuer à produire des stocks de virus à titre élevé tout au long de la dernière collection. Une différenciation efficace des cellules T auxiliaires nécessite une bonne qualité de la cellule afin d&#39; assurer que les cellules sont isolées à la pureté illustrée sur la figure 1. De même, la qualité des cellules est dépendante de la souris from laquelle ils ont été isolés. Pour ces études, nous avons utilisé 6-8 semaines C57BL / 6 de souris. souris âgées peuvent avoir des cellules moins naïfs, et d&#39;autres souches peuvent différer dans leur différenciation. Par exemple, des souris BALB / c sont plus sujettes à Th2 que C57BL / 6 17 manière indiquée ci - dessus, C57BL / 6 cellules T peuvent être difficiles à induire une réponse Th2. En outre, l&#39;une des conditions de différenciation peut varier légèrement d&#39;un laboratoire à, et l&#39;effet de la surexpression du gène ne peuvent apparaître dans des conditions sous-optimales afin concentrations de cytokine dans les différentes conditions de polarisation peuvent avoir besoin d&#39;être titrée. Enfin, les effets du gène surexprimé ou les conditions de polarisation sur la prolifération cellulaire peuvent influencer l&#39;efficacité de transduction de sorte que les effets de mesure du gène d&#39;intérêt peuvent nécessiter d&#39;optimiser le temps et la concentration des réactifs de polarisation. Optimisation de tous ces facteurs devrait conduire à des résultats d&#39;information avec ce système.

La réponse immunitaire doit être fortement régulée pour éliminer les infections mais prévenir les attaques sur les tissus du soi qui conduisent à l’auto-immunité. Les lymphocytes T auxiliaires jouent un rôle essentiel dans la régulation de la réponse immunitaire, et beaucoup d’efforts ont été entrepris pour comprendre leur développement et leur fonction (illustrés dans plusieurs revues récentes 1-3). Cependant, de nombreuses questions subsistent et de nombreuses approches ont été utilisées pour étudier les mécanismes contrôlant le développement et la fonction des lymphocytes T auxiliaires. Celles-ci vont de l’utilisation de systèmes de culture cellulaire in vitro à des animaux entiers. Les systèmes de culture cellulaire, en particulier ceux qui utilisent des lignées cellulaires, offrent l’avantage d’être faciles à utiliser et de pouvoir générer une grande quantité de matériel pour effectuer des analyses biochimiques sophistiquées. Cependant, ils souffrent de leur capacité limitée à reproduire les conditions réelles qui se produisent dans une réponse immunitaire. En revanche, les expériences sur l’ensemble de l’animal offrent l’avantage de la pertinence, mais elles peuvent souffrir de difficultés de manipulation et de la capacité d’effectuer des contrôles précis, en plus de leurs coûts élevés et de leurs implications éthiques. Néanmoins, la grande majorité des études sur les lymphocytes T auxiliaires nécessitent encore aujourd’hui l’utilisation d’expériences sur des animaux entiers impliquant des lymphocytes T primaires en raison de l’incapacité des lignées cellulaires à reproduire les étapes exactes se produisant chez l’animal entier. Par conséquent, il est essentiel d’utiliser des approches rentables et très informatives. 
La génétique est un outil puissant pour étudier le développement et la fonction des lymphocytes T auxiliaires, mais les méthodes traditionnelles impliquant l’inactivation de gènes ou les transgènes prennent du temps et coûtent cher, de sorte qu’elles sont souvent hors de portée des petits laboratoires. Cependant, la transduction rétrovirale offre une approche génétique puissante, rapide et rentable pour étudier les mécanismes de produits géniques spécifiques. Par conséquent, il est couramment utilisé dans les articles étudiant le développement et la fonction des lymphocytes T auxiliaires. 
Nous avons optimisé une procédure de transduction rétrovirale des lymphocytes T auxiliaires. Il utilise le vecteur d’expression rétrovirale pMIG (virus des cellules souches murines-Site d’entrée ribosomique interne-Protéine fluorescente verte), dans lequel le gène d’intérêt peut être cloné et donc exprimé à partir de la répétition terminale longue (LTR) du rétrovirus 4. De plus, en aval du gène d’intérêt inséré se trouve une séquence d’entrée interne du ribosome (IRES) suivie du gène de la protéine fluorescente verte (GFP), de sorte que les cellules transduites peuvent facilement être suivies par leur expression de la GFP. Le vecteur était à l’origine dérivé des vecteurs du virus des cellules souches murines (MSCV), qui contiennent des mutations dans les sites de liaison des répresseurs dans les LTR, les rendant résistants au silençage et donc, donnant une expression élevée dans de nombreux types de cellules, y compris les lymphocytes T auxiliaires 5,6. La production de rétrovirus à titre élevé nécessite un protocole de transfection transitoire simple de cellules 293T du rein embryonnaire humain (HEK) avec le vecteur MIG et un vecteur viral auxiliaire qui exprime les gènes rétroviraux GAG, Pol et Env. Pour cela, le vecteur de virus auxiliaire pCL-Eco 7 fonctionne bien pour produire des rétrovirus incompétents à réplication de titre élevé. 
Ici, ces protocoles pour la production rétrovirale et la transduction des lymphocytes T murins primaires sont décrits en plus de certains de nos résultats utilisant cette approche pour étudier la régulation des miARN de l’expression génique contrôlant la différenciation des lymphocytes T auxiliaires. Les miARN sont de petits ARN d’une longueur d’environ 22 nucléotides qui régulent post-transcriptionnellement l’expression des gènes en ciblant les séquences homologues dans les protéines, en codant pour les ARN messagers et en supprimant la traduction et l’induction Instabilité du message 8,9. Les miARN jouent un rôle essentiel dans la régulation des gènes du développement. Ils sont essentiels dans les premiers stades du développement, car les embryons qui ne peuvent pas produire de miARN meurent à un stade très précoce 10. De plus, les miARN sont importants plus tard dans le développement de nombreux tissus. On pense qu’ils fonctionnent en affinant l’expression des gènes nécessaires aux programmes de développement 1. Dans les lymphocytes T auxiliaires, les miARN jouent plusieurs rôles et sont nécessaires au développement régulateur des lymphocytes T (Treg) 11-14. Nous avons utilisé la transduction rétrovirale comme moyen de disséquer les mécanismes de régulation des miARN de la différenciation des Treg 15. Grâce à de telles études, d’importants miARN individuels ont été déterminés par surexpression médiée par rétroviral. Par la suite, des gènes pertinents régulés par ces miARN ont été identifiés afin de comprendre les voies moléculaires régulées par les miARN dans la différenciation des lymphocytes T auxiliaires.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MIG vecteur</td><td>Addgene</td><td>Plasmide 9094</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco vecteur</td><td>Addgene</td><td>Plasmide 12371</td><td></td></tr><tr><td>Passoire cellulaire</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Perles magnétiques souris CD4 kit de cellules&nbsp ;</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>Perles de streptavidine&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de séparation cellulaire MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de séparation cellulaire LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 MAb&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>clone 7D4</td></tr><tr><td>CD62L Bioténylé MAb&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553149</td><td>clone MEL-14</td></tr><tr><td>Polybrene (bromure d’hexadiméthrine)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>clone 145-2C11&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>clone 37.51&nbsp ;</td></tr><tr><td>Clone 559062 anti-IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>11B11</td></tr><tr><td>Clone 559065 anti-IFN-gamma</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>XMG1.2</td></tr><tr><td>Clone 554425 anti-IL-2</td><td>BD BiosciencesJES6-5H4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-12 recombinant p70</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 recombinant</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>TGF-bêta recombinant</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td>Le paraformaldéhyde est toxique, il faut donc faire preuve de prudence lors de la manipulation.</td></tr><tr><td>Foxp3 set de tampons de coloration</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4&nbsp ; FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>clone GK1.5&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td><td>clone 53-6.7&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp ; clone HIS19</td></tr><tr><td>Anti-CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp ; clone PC61.5&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>clone MEL-14&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>clone IM7&nbsp ;</td></tr><tr><td>FITC anti-IFN-gamma&nbsp ;</td><td>Clone eBiosciences</td><td>11-7311-81</td><td>XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>Clone 554435 BD Biosciences</td><td></td><td>11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PE ou APC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>clone RM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559502</td><td>clone TC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp ; APC ou PE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp ;</td><td>clone FJK-16s</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose/Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, acide libre</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sigma disodique</td><td></td><td>D2900000</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; CaCl2&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

rétrovirale transduction des cellules t auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper Le développement et la fonction des lymphocytes T doivent être étroitement régulés pour induire une réponse immunitaire appropriée qui élimine des agents pathogènes spécifiques tout en prévenant l’auto-immunité. De nombreuses approches impliquant différents organismes modèles ont été utilisées pour comprendre les mécanismes contrôlant le développement et la fonction des lymphocytes T auxiliaires. Cependant, les études utilisant des modèles murins se sont avérées très informatives en raison de la disponibilité des systèmes génétiques, cellulaires et biochimiques. Une approche génétique chez la souris utilisée par de nombreux laboratoires implique la transduction rétrovirale des lymphocytes T auxiliaires primaires. Il s’agit d’une approche puissante en raison de sa relative facilité, ce qui la rend accessible à presque tous les laboratoires possédant des compétences de base en biologie moléculaire et en immunologie. Par conséquent, la fonction de plusieurs gènes de type sauvage ou mutants peut facilement être testée dans les lymphocytes T auxiliaires afin de comprendre leur importance et leurs mécanismes d’action. Nous avons optimisé cette approche et décrivis ici les protocoles de production de rétrovirus à titre élevé, d’isolement des lymphocytes T auxiliaires murins primaires, et de leur transduction par les rétrovirus et de la différenciation vers les différents sous-ensembles auxiliaires. Enfin, l’utilisation de cette approche est décrite dans la découverte des mécanismes utilisés par les microARN (miARN) pour réguler les voies contrôlant le développement et la fonction des lymphocytes T auxiliaires.

Le succès de ce système expérimental nécessite des populations très pures de cellules T et préparations de retrovirus à titre élevé. Les résultats représentatifs sont présentés ici à titre d&#39; exemples d&#39;expériences réussies. La figure 1 montre la pureté typique des populations pré- et post-sélectionnés à chaque étape du protocole d&#39;isolement des cellules T auxiliaires naïves. La figure 2 et 3 illustrent l&#39;analyse de la production de retrovirus par l&#39; expression de la GFP dans les cellules HEK 293T transfectées (figure 2) et les cellules T transduites (figure 3). L&#39; efficacité de la transfection des cellules HEK 293T peuvent varier considérablement avec les différentes constructions rétrovirales, mais souvent ne correspond pas avec le niveau de production de retrovirus observée avec le nombre de cellules GFP + T. En outre, le nombre de cellules GFP + T peut varier en fonction des conditions de polarisation. En outre, le mean niveau d&#39;expression de la GFP et le gène inséré peut varier en fonction du nombre de copies de virus intégré, l&#39;effet du site d&#39;intégration sur la transcription, et des mécanismes de régulation post-transcriptionnel qui affectent la transcription virale. Enfin, la figure 4 montre des résultats typiques que nous avons observés avec la différenciation des cellules T auxiliaires lorsque les miRNAs miR-15b / 16 sont surexprimés. Ces résultats montrent une partie de la variabilité qui peut se produire au sein d&#39;une expérience individuelle des effets tellement vrais doivent être étayées par une analyse statistique de plusieurs expériences répétées en utilisant différentes préparations de cellules T auxiliaires. Dans ces expériences, les réponses Th2 peuvent être difficiles à observer dans la / 6 ligne C57BL utilisé ici parce qu&#39;ils sont sujets à des réponses Th1. De même, l&#39;IL-9 coloration peut être difficile à détecter dessus du fond. Par conséquent, il est impératif d&#39;effectuer des contrôles d&#39;isotype et mettre en place une compensation adéquate pour garantir un bon gating de l&#39;expression des cytokines. Dans nos résultats , nous avons découvert que miR-15b / 16 améliore iTreg l&#39; induction par inhibition de la voie de signalisation par suppression de l&#39;expression des composants et Rictor mTOR 15 mTOR. miR-15b / 16 peut parfois influencer Th0, Th1, et la différenciation Th17 dans des expériences individuelles, mais il n&#39;y a pas d&#39;effet significatif lorsqu&#39;il a examiné dans plusieurs expériences répétées. En revanche miR-15b / 16 surexpression ne supprime de manière significative la différenciation Th9 (voir référence 18). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Figure 1. pureté typique de cellules T auxiliaires à chaque étape de l&#39; isolement. D&#39;écoulement représentant cytométrie résultats des antigènes indiqués sont présentés à partir de la porte de cellules vivantes désignées dans le Scatter Forward (FSC) et Side Scatter (SSC) parcelles. Sélection négative (A) avant et après-CD4. Les profils d&#39;expression de CD4,CD8a et MHCII sont présentés. Ces exemples illustrent l&#39;enrichissement des cellules T auxiliaires et de la perte de lymphocytes T cytotoxiques et du CMH de classe II des cellules exprimant. Une bonne purification devrait aboutir à ~ 90% de cellules T CD4 + à ce stade. (B) sélection de CD25. Sur la gauche sont les profils d&#39;expression de CD4, CD8a et MHCII, et à droite sont les CD4 et l&#39;expression de CD25 profils pré et post-sélection. À ce stade , &gt; 95% des cellules CD25 sélectionnées négativement devrait être CD4 + CD25 -. (C) CD62L sélection. les profils d&#39;expression de CD4, CD8A et CMHII sont indiqués sur la gauche. Sur la droite, les profils d&#39;expression pour CD62L et CD44 sont présentés pour les cellules sélectionnées pré et post-CD62L ainsi que CD4 et CD62L profil d&#39;expression des cellules de poste sélectionné. Après la sélection CD62L pratiquement toutes les cellules de mémoire (CD44 +) sont éliminés en laissant une population fortement enrichie de cellules T auxiliaires naïves , qui contient 10-15% des cellules effectrices (CD62L faible). Pour tousprofils FACS, paramètres équivalents et des échelles pour un paramètre spécifique ont été maintenues tout au long. Les nombres représentent le pourcentage de cellules dans une population fermée. La légère diminution de la taille des cellules après la sélection initiale est probablement due à une contrainte mécanique pendant le protocole. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse des cellules HEK 293T transfectées avec un retrovirus. L&#39; expression de GFP dans les cellules est représenté HEK 293T qui étaient soit non transfectées ou transfectées et analysé après la collecte de surnageant de culture virale. l&#39;analyse de la GFP a été effectuée sur des cellules vivantes de la porte sur le FSC et l&#39;intrigue SSC dans le premier panneau. Les nombres représentent le pourcentage de cellules GFP + dans la région fermée. Typique tl&#39; efficacité de ransfection varient entre 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Expression de la GFP Figure 3. L&#39; analyse des cellules T auxiliaires de type retrovirus transduites. Est représenté dans les cellules T auxiliaires rétroviraux transduites après différenciation dans Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 et Treg conditions de polarisation pendant trois jours. L&#39;analyse a été fermée sur des cellules vivantes et activées indiquées dans le panneau FSC / SSC. Les efficacités de transduction peuvent varier entre 10 à 75% en fonction de la construction et des conditions de polarisation. De même, l&#39;intensité de fluorescence moyenne d&#39;expression de la GFP peut varier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 4. Effet de miR-15b / 16 surexpression sur la différenciation des cellules T helper dans différentes conditions de polarisation. Les profils de cytokine représentatifs sont présentés sur la GFP + population de cellules à partir de la figure 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tableau 1:. Les tampons utilisés dans ces protocoles <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau comme une feuille</a> de <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">calcul Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Auxiliaireconditions de polarisation des lymphocytes T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> recombinant-IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> Le TGF-β recombiné </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> Le TGF-β recombiné </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-6 recombinante </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> Le TGF-β recombiné </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-2 recombinante </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tableau 2: sous - ensemble de cellules conditions de polarisation T auxiliaires.

De nombreux systèmes expérimentaux ont été utilisés pour comprendre les mécanismes qui régulent la croissance et la fonction des lymphocytes T dans une réponse immunitaire. Ici, une approche génétique en utilisant la transduction rétrovirale est décrite, qui est économique, efficace du temps, et surtout, très instructif pour identifier les voies de régulation.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

L'objectif général de ce protocole est d'isoler des cellules T auxiliaires primaires murines et de les transduire avec des constructions d'expression rétrovirales pour un gène d'intérêt. De nombreux systèmes expérimentaux ont été utilisés pour comprendre les mécanismes régulant le développement et la fonction des cellules T lors d'une réponse immunitaire. Nous décrivons ici une approche génétique utilisant la transduction rétrovirale, qui est économique, efficace en termes de temps et particulièrement informative pour identifier les voies régulatrices.Nous avons utilisé cette technique pour analyser la fonction des microARN, qui sont des régulateurs importants de l'expression des gènes. Grâce à la transduction rétrovirale, nous avons pu tester la fonction de microARN individuels et la différenciation des cellules T auxiliaires. Mon collaborateur, Oliver Garden, démontrera l'isolement des cellules T primaires, et je démontrerai la transduction rétrovirale.24 heures avant la transfection, diviser une plaque de cellules confluentes à un ratio de 1:10 dans une plaque de 10 centimètres, afin que les cellules soient environ à 50 % de confluence le lendemain. Environ une heure avant la transfection, retirer le milieu des cellules et ajouter soigneusement 9 millilitres de milieu frais pour cellules HEK293 T, afin d'empêcher les cellules de se détacher de la plaque. Dans un tube rond de 6 millilitres ou un tube conique de 15 millilitres, ajouter 5 microgrammes d'ADN rétroviral, 5 microgrammes d'ADN de virus auxiliaire et de l'eau jusqu'à un volume total de 420 microlitres.Ensuite, ajoutez 80 microlitres de chlorure de calcium 2,5 M pour obtenir un volume final de 500 microlitres. Puis, ajoutez lentement 500 microlitres de HBS 2x goutte à goutte au mélange d'ADN, tout en vortexant doucement, afin que la solution soit continuellement homogénéisée et que les précipités de phosphate de calcium se forment sous forme de cristaux de taille uniforme. Par la suite, transférez le mélange d'ADN au phosphate de calcium dans une hotte de culture tissulaire.Ajouter lentement le mélange aux cellules, tout en agitant doucement et constamment la plaque, avant de replacer les cellules dans l’incubateur. Pour recueillir le virus le lendemain, retirer le milieu et ajouter 10 millilitres de milieu frais HEK293 T, en prenant soin de ne pas détacher les cellules de la plaque. Le soir, ajouter 3,5 millilitres de milieu frais HEK293 T et incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 12 heures.Après environ 12 heures, récupérez le milieu et ajoutez à nouveau 3,5 millilitres de milieu frais pour cellules HEK293 T. Répétez la collecte du milieu deux fois supplémentaires, à des intervalles d'environ 12 heures, ce qui permet d'obtenir environ 10 millilitres de stock viral. Dans cette procédure, ajoutez la rate et les ganglions lymphatiques dans le tamis à cellules, puis macérez-les à l’aide de l’extrémité du piston d’une seringue de 5 millilitres.Après cela, rincez-les avec un à deux millilitres de milieu R10. Transférez ensuite les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et complétez le volume à 14 millilitres avec du milieu R10. Centrifugez les cellules à 600 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, éliminer le surnageant en le versant d'un seul mouvement propre, afin d'éviter de perturber le culot cellulaire. Puis, ajouter deux millilitres de tampon froid de lyse des érythrocytes aux cellules. Mélanger, puis placer les cellules sur de la glace pendant 3,5 minutes en effectuant un mélange doux en continu.Ensuite, ajoutez 12 millilitres de milieu R10 et centrifugez immédiatement à 600 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Effectuez les étapes de lavage deux fois supplémentaires avec le milieu R10 afin d'éliminer tout résidu de tampon de lyse des globules rouges des cellules, et évitez ainsi la mort des lymphocytes. À cette étape, répartissez huit à dix fois dix puissance 7 cellules par tube conique, puis centrifugez-les à 600 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Éliminer le surnageant d’un seul mouvement net, afin de ne pas perturber le culot cellulaire. Ensuite, reprendre les cellules dans 100 microlitres de FBS inactivé par la chaleur. Puis, ajouter 100 microlitres de mélange d'anticorps aux cellules et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, avec un mélange doux sur un rouleau.Après cela, re-suspendre les billes dans le flacon en vortexant pendant plus de 30 secondes. Transférer ensuite les billes dans un tube conique de 15 millilitres et ajouter 2 millilitres de milieu R10 par millilitre de billes. Placer le tube dans l'aimant pendant une minute.Ensuite, jetez le surnageant et resuspendez les billes dans quatre millilitres de milieu R10. Lavez les cellules à la fin de l'incubation avec l'anticorps en ajoutant 10 millilitres de milieu R10 par tube, puis centrifugez à 600 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Versez le surnageant d'un seul mouvement propre afin d'éviter de perturber le culot cellulaire, puis resuspendez les cellules dans 1 millilitre de milieu R10.Ensuite, ajoutez 2 millilitres des billes lavées dans le tube contenant les cellules traitées par l'anticorps et incubez pendant 30 minutes à quatre degrés celsius, avec un mélange doux sur un rouleau. Puis, redispensez le mélange cellules-billes en pipetant doucement cinq fois avant de placer le tube dans l'aimant à billes pendant deux minutes. Transférez le surnageant contenant les cellules sélectionnées négativement dans un nouveau tube, puis répétez une fois supplémentaire la sélection négative.Dans cette procédure, centrifuger les cellules T positives pour CD4 à 600 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et re-suspendre dans 150 à 200 microlitres de milieu R10 par dix puissance huit cellules. Ensuite, ajouter deux microlitres d'anticorps monoclonaux biotinylés CD25 en stock aux cellules et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec un mélange doux sur un rouleau. Par la suite, laver les cellules en ajoutant 10 millilitres de tampon de colonne de séparation cellulaire, puis centrifuger à 600 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, retirez autant de surnageant que possible et resuspendez les cellules dans un volume final d'environ 90 microlitres par 10 puissance 7 cellules. Ajoutez ensuite 20 microlitres de billes de streptavidine par 10 puissance 7 cellules, et mélangez en tapotant doucement. Incubez ensuite pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Pendant l'incubation des cellules, préparez les colonnes MS. À la fin de l'incubation, lavez les cellules en ajoutant 10 millilitres de tampon pour colonne de séparation des cellules et en centrifugeant à 600 ×g pendant cinq minutes à 4 °C. Resuspendez les cellules dans 500 microlitres de tampon pour colonne de séparation des cellules, par 10⁸ cellules.Ensuite, appliquer 500 microlitres de suspension cellulaire sur la colonne et recueillir l'écoulant. Faire passer à nouveau l'écoulant sur la colonne une deuxième fois et recueillir une fois de plus l'écoulant. Puis rincer la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de colonne pour la séparation des cellules, et ajouter chaque fraction d'écoulant aux cellules négatives pour CD25 recueillies.Effectuez le lavage, la liaison aux billes de streptavidine et la préparation de la colonne de séparation cellulaire comme mentionné précédemment, mais utilisez cette fois la colonne LS. Cette fois, jetez l’écoulement et éluéz les cellules de la colonne à l’aide du piston fourni. Pendant l’isolement des lymphocytes T naïfs, recouvrez une plaque de culture tissulaire 24 puits d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28 dilués dans du DPBS, puis incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius.Immédiatement avant la culture des cellules, lavez la plaque avec 250 microlitres de DPBS par puits afin d'éliminer l'anticorps non lié. Ensuite, retirez le DPBS et ajoutez 1 millilitre de cellules T CD4 positives naïves dans du milieu R10 pendant la nuit. Le jour suivant, centrifugez les cellules à 900 fois G pendant 10 minutes à 30 degrés Celsius.Ensuite, recueillir le milieu et ajouter 1 millilitre de surnageant de culture viral préparé selon le protocole de production du virus. Ajouter ensuite 1 microlitre de polybrene à 8 milligrammes par millilitre et 10 microlitres d’HEPES à 1 molaire, afin de faciliter la capture du virus avant de centrifuger les cellules à 900 ×g pendant 90 minutes à 30 degrés Celsius. Pour différencier les cellules, retirer soigneusement le surnageant de culture viral et ajouter 1 millilitre du milieu préalablement recueilli, car il contient l’IL2 et d’autres facteurs de croissance des lymphocytes T.Ensuite, ajoutez les réactifs indiqués dans le tableau 2 du manuscrit accompagnant, et cultivez les cellules pendant trois à quatre jours afin de différencier les cellules en sous-ensembles spécifiques. Cette figure montre la pureté typique des populations avant et après sélection à chaque étape du protocole d'isolement des cellules T auxiliaires naïves. Les profils d'expression de CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L et CD44 illustrent la perte des cellules de la classe 2 du CMH, ainsi que des cellules T cytotoxiques, régulatrices et mémoires.Cela donne une population composée à plus de 95 % de cellules T CD4 positives, dont environ 85 à 90 % sont naïves et les 10 à 15 % restants sont des cellules effectrices. Sur cette figure, l'expression de la GFP est montrée dans des cellules HEC293 T, soit non transfectées, soit transfectées, et analysées après la collecte des surnageants viraux. L'analyse de la GFP a été réalisée sur des cellules vivantes issues du portail défini sur le tracé FSE et SSE.Les rendements de transfection typiques varient entre 30 % et 90 %. Ici, l'expression de la GFP est montrée dans des cellules T auxiliaires transduites par un rétrovirus après différenciation dans des conditions de polarisation Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 et Treg pendant trois jours. Les rendements de transduction varient entre 10 % et 75 % selon le construit et les conditions de polarisation. Voici les profils représentatifs de cytokines lors de la différenciation des cellules T auxiliaires dans différentes conditions de polarisation.Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent constituer un moyen puissant d'analyser la fonction des gènes ainsi que le développement et la fonction des cellules T auxiliaires. N'oubliez pas que la qualité des résultats dépend de celle des cellules et des réactifs. Il est donc essentiel d'optimiser les protocoles de transduction ainsi que l'isolement et la différenciation des cellules T auxiliaires.

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Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

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