Un modèle murin du Groupe B Streptococcus Vaginal Colonisation

L’objectif global de ce modèle animal est d’établir la colonisation du streptocoque du groupe B, ou SGB, du tractus vaginal murin. Cette méthode peut nous aider à comprendre des questions clés sur la colonisation par le streptocoque du groupe B, telles que les facteurs bactériens importants pour la colonisation, ainsi que l’impact des réponses de l’hôte sur la persistance vaginale. Le principal avantage de cette technique est que l’inoculation, généralement, entraîne une colonisation supérieure à 90 % sans l’utilisation d’anesthésie, d’immunosuppresseurs ou d’agents épaississants.

Commencez par vortex 0,5 milligramme de bêta-œstradiol, par souris, dans un tube conique de 15 millilitres jusqu’à ce que tous les grumeaux soient éliminés et que le bêta-œstradiol apparaisse sous forme de poudre fine. Ensuite, filtrez 100 microlitres d’huile de sésame, par souris, dans le tube à travers une passoire de 0,45 micron, et vortex à nouveau le tube. Lorsque l’hormone est distribuée sous forme de suspension homogène dans toute l’huile, aspirez le réactif dans une nouvelle seringue de 10 millilitres et fixez-y une aiguille de calibre 18 et d’un pouce.

Combinez 100 microlitres de suspension dans une seringue à tuberculine d’un millilitre par souris et équipez chaque seringue à tuberculine d’une aiguille stérile d’un demi-pouce de calibre 26. Ensuite, délivrez 100 microlitres de bêta-œstradiol dans le quadrant inférieur gauche ou droit de la cavité péritonéale de chaque animal. Le même jour que l’injection, cultivez une culture liquide de cinq millilitres pendant la nuit de la souche GBS d’intérêt dans un bouillon Todd Hewitt, ou THB, à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, sous-cultivez le SGB à un volume de un à 10 dans du THB frais pour une incubation de deux à trois heures à 37 degrés Celsius, jusqu’à ce que les bactéries atteignent la phase mi-logarithmique. Ensuite, transférez la sous-culture dans un tube conique stérile de 15 millilitres et centrifugez les cellules bactériennes. Remettre en suspension la pastille dans 200 microlitres de PBS stérile.

Ensuite, portez le volume total de la suspension à un millilitre de PBS pour 10 souris, pour atteindre une OD600 de 0,4 dans un nouveau tube de culture de cinq millilitres. Transférez la culture dans un nouveau tube de 15 millilitres et granulez à nouveau les bactéries. Ensuite, remettez en suspension les cellules dans PBS à un dixième du volume d’origine.

Réservez 50 microlitres de bactéries pour la dilution en série et le placage sur gélose THB, afin de déterminer l’UFC exacte de l’inoculum. Ensuite, aspirez 10 microlitres de GBS dans une pointe de pipette de 200 microlitres de chargement de gel, et fixez manuellement la peau lâche au niveau de la peau du cou, du premier animal, entre le pouce et l’index, suivie d’une immobilisation de la queue. Insérez la pointe de la pipette à 5 à 10 millimètres dans la lumière vaginale et distribuez tout le volume de l’inoculum.

Ensuite, relâchez immédiatement la peau et soulevez la queue pour élever l’extrémité arrière de l’animal, tout en faisant marcher les pattes avant sur une surface dure. Après une minute, inspectez visuellement l’ouverture vaginale pour détecter tout reflux d’inoculum. Juste avant l’écouvillonnage, pré-mouillez le coton dans du PBS et immobilisez l’une des souris comme nous venons de le démontrer.

Insérez l’écouvillon à 10 millimètres dans la lumière vaginale et tournez-le doucement quatre fois dans le sens des aiguilles d’une montre et quatre fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre, tout en appliquant une légère pression sur la paroi vaginale. Placez l’écouvillon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de PBS, et faites tourbillonner le tube et l’écouvillon pendant environ 15 secondes pour libérer les bactéries des fibres de coton. Ensuite, diluez en série chaque échantillon dans du PBS et mettez en boîte 20 microlitres de un à 10 à travers une à 10 000 dilutions sur une plaque de gélose différentielle, préparée selon les instructions du fabricant, pour une incubation à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Les colonies de SGB apparaîtront de couleur rose vif ou mauve. Pour recueillir le lavage vaginal, utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres de gel pour distribuer 20 microlitres de PBS dans la lumière vaginale. Pipetez doucement tout le volume de haut en bas quatre fois dans la lumière.

Puis, à l’aide de la même astuce, prélevez l’intégralité du volume. Pour l’analyse du liquide de lavage en aval, versez le lavage dans un tube de microcentrifugation de 0,7 millilitre. Pour l’homogénéisation de la dissection tissulaire, vaporisez l’abdomen ventral d’un animal euthanasié avec de l’éthanol à 70 % et utilisez des ciseaux stériles pour ouvrir la cavité abdomino-pelvienne.

Déplacez les intestins de manière à ce que l’appareil reproducteur soit exposé. Ensuite, coupez les deux cornes utérines, mi-longues, entre le corps utérin et les ovaires. À l’aide de ciseaux et de pinces, séparez la graisse viscérale, les membranes et la vessie de l’appareil reproducteur, en déplaçant les tissus vers la queue.

Ensuite, coupez transversalement le vagin aussi près que possible de la vulve, pour séparer l’appareil reproducteur du corps. Transférez l’appareil reproducteur intact dans une boîte de Pétri stérile et utilisez une nouvelle lame de rasoir pour séparer l’utérus du col de l’utérus en une seule coupe transversale. Séparez le col de l’utérus du vagin avec une autre incision transversale.

Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, transférez chacun des tissus dans des tubes individuels, pré-pesés, de deux millilitres contenant 500 microlitres de PBS et de billes d’homogénéisation. Pesez chaque tube de 2 millilitres pour déterminer le poids des tissus. Ensuite, fermez hermétiquement les tubes à bouchon à vis et homogénéisez les tissus, pendant une minute, à la vitesse maximale, dans un homogénéisateur de tissus.

Pour quantifier la charge bactérienne, diluer en série 25 microlitres d’homogénat de tissu et mettre un à 10 à travers une à 10 000 dilutions sur des plaques de gélose différentielle, pour une incubation de 24 heures, à 37 degrés Celsius. Pour stocker des échantillons pour la quantification de la citokine, congelez les homogénats à moins 20 degrés Celsius. Dans ces images, les quatre étapes du cycle de l’œstrus de la souris, telles que déterminées par le liquide de lavage vaginal humide, sont démontrées.

Les souris inoculées au stade pro-œstrus ont été colonisées par le SGB plus longtemps que tout autre stade de l’œstrus, en particulier celles qui étaient en diestrus au moment de l’inoculation. L’œstrus soutenu favorise la persistance de GBS A909 chez les souris CD-1, avec une colonisation de 90 % observée deux semaines après l’inoculation. Dans une expérience typique avec une dose de bêta-œstradiol avant l’inoculation, seulement 40 à 50 % des souris ont été colonisées une semaine après l’inoculation, avec un SGB moyen récupéré qui imite le pourcentage de colonisation.

Démontrer que le maintien d’un œstrus continu favorise la persistance vaginale du SGB chez la majorité des souris CD-1. GBS A909 persiste dans le tractus vaginal chez les souris CD-1 consanguines et les souris FVB consanguines pendant environ une semaine. Alors que la majorité des souris consanguines BALB/c et C57BL/6 sont colonisées au bout d’une semaine pendant un mois ou plus.

La visualisation du SGB positif à la GFP chez les animaux inoculés démontre la présence du SGB adhérant à l’épithélium vaginal murin et à proximité d’autres flores vaginales indigènes. Il est important d’éviter le reflux, lors de l’inoculation, pour s’assurer que toutes les souris soient colonisées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures, selon le nombre d’animaux.

Ce modèle permet aux chercheurs dans le domaine des interactions hôte/pathogène d’explorer la capacité des bactéries, comme le streptocoque du groupe B, à coloniser l’appareil reproducteur féminin. Cette procédure peut être utilisée pour tester de nouveaux composés ou des traitements probiotiques afin de répondre à des questions supplémentaires sur les interventions thérapeutiques.