détection de la Trypanosoma brucei Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

L’objectif global de cette méthode est d’isoler les trypanosomes exprimant une variante particulière de la glycoprotéine de surface ou VSG du reste de la population et d’identifier les parasites qui sont passés de la VSG dominante de départ à n’importe quelle autre VSG. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie des trypanosomes, telles que : quels sont les facteurs ou les événements qui influencent la commutation VSG dans une population de parasites. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est plus rapide que les méthodes publiées précédemment et permet de quantifier facilement le passage à des cellules sans commutation.

Lorsque le laboratoire a commencé à travailler sur la variation antigénique, le premier problème était de savoir comment détecter les commutateurs rares. Ce genre de problème avait en fait été résolu en immunologie il y a un certain nombre d’années, grâce à l’utilisation du tri cellulaire activé par magnétisme pour enrichir les cellules négatives pour un trait particulier. Transférer le processus de non-sélection à la variation antigénique semblait être une idée vraiment prometteuse.

Pour commencer, les trypanosomes sanguins de la souche Lister 427 doivent être cultivés à une densité de 0,5 à 100 000 par millilitre. Aliquote a 50 fois 10 à l’échantillon de six cellules dans un tube de 15 millilitres, puis centrifugeuse. Enregistrez une fois 10 dans les six cellules et cultivez pour être utilisé plus tard comme témoins d’anticorps positifs et négatifs.

Pipetez la majeure partie du surnageant, laissant environ 750 microlitres dans le tube. Transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Enfin, centrifugez les cellules à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes à 2800 fois g.

Et puis pipetez tout le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 150 microlitres de milieu de culture, plus l’anticorps glycoprotéique de surface anti-variant primaire ou l’anticorps anti-VSG à la dilution appropriée. Ensuite, faites vortex les cellules à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Laver avec 800 à 1000 microlitres de milieu de culture à froid. Centrifugez les cellules à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes à 5200 fois g. Après avoir aspiré le surnageant, laver les cellules avec un millilitre de milieu de culture et centrifuger à nouveau.

Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de milieu de culture. Ajoutez 110 microlitres de microbilles de tri cellulaire activées magnétiquement du type approprié pour l’anticorps primaire. Bien mélanger en pipetant de haut en bas, puis de vortex.

Pendant que les cellules tourbillonnent, installez une colonne de séparation activée magnétiquement. Placez un tube de 15 millilitres en dessous pour recueillir le milieu d’amorçage. Ajoutez deux millilitres de milieu de culture pour amorcer la colonne.

Ensuite, retirez l’échantillon du vortex et ajoutez 800 à 1000 microlitres de milieu de culture froid. Centrifugez l’échantillon, puis retirez le surnageant pour éliminer l’anticorps non lié. Lavez les cellules granulées avec un millilitre de milieu de culture et centrifugez-les à nouveau.

Cette fois, aspirez le surnageant mais laissez 100 microlitres dans le tube. Agitez vigoureusement le tube de centrifugation jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension. Ajoutez un millilitre de milieu de culture et pipetez de haut en bas pour remettre complètement les cellules en suspension.

Retirez le tube conique de 15 millimètres utilisé pour collecter le fluide d’amorçage et remplacez-le par un nouveau tube conique de 15 millilitres pour recueillir le flux contenant les parasites commutés. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne amorcée. Recueillez l’écoulement dans un tube de 15 millilitres en dessous, ce qui prend généralement six à sept minutes pour un millilitre de milieu plus des trypanosomes.

Ensuite, lavez la colonne deux fois avec un millilitre de milieu de culture et recueillez le flux dans le même tube. Divisez le flux, qui doit totaliser environ trois millilitres, en deux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, placez les tubes sur de la glace.

Ajoutez trois millilitres de milieu de culture dans la colonne et plongez la colonne dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Cela permettra d’obtenir les cellules qui expriment la VSG dominante de départ. Retirez 300 microlitres de ce matériau élué et conservez-le sur de la glace, le reste peut être jeté.

Pour créer un contrôle positif, prélevez environ 100 000 cellules de la culture initiale de cellules et pipetez-les dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Répétez cette opération pour créer un contrôle négatif. Centrifuger les échantillons à flux continu et l’échantillon témoin positif.

Ensuite, retirez et jetez le surnageant. Remettre en suspension les cellules témoins positives dans 100 microlitres de milieu de culture avec un anticorps anti-VSG primaire marqué au fluorophore à la dilution appropriée. Ensuite, remettre en suspension une pastille à écoulement continu dans 100 microlitres de milieu de culture avec un anticorps anti-VSG primaire marqué au fluorophore à la dilution appropriée.

Utilisez la suspension pour ensuite remettre en suspension le granulé dans le deuxième tube d’écoulement, ce qui donne un tube de piscine. Bien mélanger en pipetant de haut en bas. Vortex les cellules puis ajoutez 800 à 1000 microlitres de milieu de culture froid.

Centrifugez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes à 5200 fois g, puis jetez le surnageant pour éliminer tout anticorps non lié. Lavez les cellules avec un millilitre de milieu de culture, puis centrifugez-les. Les témoins positifs et négatifs et les cellules éluées préalablement stockées sur la glace.

Jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 148,5 microlitres de milieu de culture aux échantillons. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de billes de comptage absolues, suivis de 1,5 microlitres de solution de coloration à l’iodure de propidium.

Remettre en suspension les granulés de contrôle positif et négatif avec 175 microlitres de milieu de culture. Les échantillons peuvent maintenant être analysés sur le cytomètre en flux. Ces graphiques de cytométrie en flux montrent les résultats de la séparation cellulaire des populations de trypanosomes induites pour créer une cassure de l’ADN double brin par rapport aux cellules non induites.

Les panneaux de gauche montrent la diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale, ce qui permet d’élucider les cellules vivantes par rapport aux cellules mortes et les billes ajoutées à l’échantillon. Des portes peuvent ensuite être générées qui les déterminent en fonction des caractéristiques de diffusion. Les panneaux de droite n’affichent que les cellules qui pourraient être classées comme actives sur la base des portes de diffusion générées dans les panneaux de gauche.

Le VSG de départ dominant dans ce cas était le VSG deux. Les cellules qui se colorent positivement pour l’iodure de propidium sont des cellules mortes. Et ceux-ci sont visibles dans les régions Q un et Q deux du graphique.

Les cellules qui se colorent positivement pour le VSG dominant et négativement pour le PI tombent dans la région Q trois et sont des contaminants. Enfin, les cellules de Q quatre sont des cellules vivantes qui se colorent négativement pour le VSG dominant qui sont considérées comme des commutateurs. Ce graphique montre les fréquences de commutation observées calculées des populations de trypanosomes avec et sans cassures induites.

Le niveau de commutation stochastique in vitro est assez faible. Alors que l’induction d’une cassure entraîne un nombre significativement plus élevé de cellules, le passage au VSG non dominant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures environ.

Lors de cette procédure, il est important de garder les échantillons froids et de remettre les granulés en suspension de manière adéquate, surtout avant de les isoler sur la colonne. Après cette procédure, d’autres méthodes comme le séquençage de l’ARN peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les VSG exprimés dans une population de commutation. Ces méthodes sont généralement utilisées pour mesurer la commutation VSG, elles peuvent également être utilisées pour l’isolement et la quantification de parasites exprimant toute protéine de surface d’intérêt.