Analyse des protéines d'importation dans les chloroplastes isolés de plantes stressées

L’objectif général de cette méthodologie est d’étudier l’importation de protéines codées par noyau dans les chloroplastes, avec un accent particulier sur les effets du stress. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des chloroplastes, telles que la façon dont l’importation de protéines de chloroplaste est réglementée. Un avantage particulier de cette technique est qu’elle permet d’évaluer les effets du stress sur l’importation de protéines chloroplastiques.

Bien que cette méthode ait été mise au point pour être utilisée avec la plante modèle Arabidopsis thaliana, elle pourrait être modifiée et adaptée pour être utilisée avec d’autres systèmes, comme les plantes cultivées. La démonstration de la procédure sera assurée par Qihua Ling, un post-doctorant de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez d’abord les plantes d’Arabidopsis comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement.

Ensuite, lorsque les plantes ont huit jours, effectuez un traitement contre le stress. Grattez doucement les plantes de la plaque de gélose à la main et placez-les dans un flacon stérilisé de milieu MS liquide contenant le facteur de stress. Selon la nature de l’expérience, il pourrait également être nécessaire de placer des plantes supplémentaires dans un flacon similaire sans facteur de stress comme témoin.

Couvrez l’embouchure des flacons avec du papier d’aluminium stérilisé et laissez les plantes pousser pendant deux jours supplémentaires sur un agitateur orbital avec une légère agitation. Préparez un gradient de densité continu en mélangeant d’abord 13 millilitres de Percoll, 13 millilitres de tampon d’isolement de deux x chloroplastes et cinq milligrammes de glutathion dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez le mélange.

Après la centrifugation, manipulez le tube avec précaution pour ne pas perturber la pente et gardez-le sur de la glace pour l’utiliser plus tard. Ensuite, transférez 100 millilitres de tampon d’isolement de chloroplaste par condition dans un bécher d’un litre. Retirez les plants du milieu liquide en les basculant dans un tamis.

Transférez-les ensuite dans le bécher contenant le tampon d’isolement des chloroplastes. Rincez le mouchoir avec le tampon pour éliminer tout milieu résiduel, puis remplacez le tampon par 100 millilitres de tampon d’isolement frais. Pour le premier tour d’homogénéisation, transférez le tissu végétal dans un bécher de 50 millilitres à la main, en laissant le tampon précédent s’écouler entre vos doigts.

Placez ensuite la sonde de l’homogénéisateur de tissus dans le tissu et homogénéisez avec deux impulsions d’une à deux secondes chacune. Filtrez l’homogénat à travers deux couches de tissu filtrant dans un tube à centrifuger de 250 millilitres. Terminez en pressant doucement le chiffon.

Conservez le filtrat et transférez le tissu végétal dans le bécher de 50 millilitres. Ensuite, placez un deuxième tampon d’isolement de chloroplaste de 20 millilitres dans le bécher de 50 millilitres et ajoutez tout tissu restant qui n’a pas été utilisé lors du premier tour d’homogénéisation. Répétez les étapes d’homogénéisation et de filtration quatre fois de plus.

Centrifuger l’homogénat accumulé à 1 000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Videz le surnageant immédiatement après la centrifugation en prenant soin de ne pas déranger le granulé. Placez le tube sur de la glace et remettez la pastille en suspension dans le surnageant résiduel en agitant doucement le tube.

Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférez doucement l’homogénat sur le dessus du gradient de densité continu prédéfini via la paroi du tube récepteur. Ensuite, centrifugez l’échantillon et le gradient dans un rotor à godets oscillants à 7 800 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec le frein desserré. Une fois terminé, observez les deux bandes vertes que l’on peut voir dans le dégradé.

Jetez la bande supérieure, qui contient les chloroplastes brisés, et utilisez une pipette Pasteur pour transférer la bande inférieure contenant les chloroplastes intacts dans un tube à centrifuger frais de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez 25 millilitres de tampon HMS dans le tube et retournez le tube deux fois pour laver le Percoll des chloroplastes. Ensuite, replacez le tube dans le rotor à godets oscillants et regranulez les chloroplastes.

Videz le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le tampon résiduel en agitant doucement le tube sur de la glace. Ajoutez 100 à 300 microlitres supplémentaires de tampon HMS si nécessaire, mais essayez de ne pas trop diluer l’échantillon. Conservez les chloroplastes remis en suspension sur de la glace.

Commencez par ajouter cinq microlitres de chloroplastes isolés à 495 microlitres de tampon HMS dans un tube de 1,5 millilitre. Retournez le tube pour mélanger doucement la solution. Placez ensuite un verre de protection sur la chambre de comptage d’un hémacytomètre.

Pipetez lentement 40 à 60 microlitres de la suspension de chloroplaste dilué dans l’espace entre le verre de couverture et la chambre de comptage. À l’aide d’un microscope à contraste de phase, imagez les chloroplastes avec un objectif 20x. Les chloroplastes intacts semblent ronds et brillants et sont entourés d’un halo de lumière.

Utilisez ensuite l’objectif 10x au nombre de chloroplastes dans 10 grands carrés. Le nombre de chloroplastes par grand carré doit se situer en moyenne entre 10 et 30. S’il y a trop peu ou trop de chloroplastes, ajustez le facteur de dilution et répétez la procédure.

Une fois dans la plage appropriée, calculez le nombre de chloroplastes par millilitre comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Pour exécuter un parcours temporel avec trois points temporels, préparez trois tubes, chacun contenant une aliquote de 130 microlitres de tampon d’arrêt d’importation, et laissez-les sur de la glace. Dans un tube de deux millilitres, préparer la réaction d’importation contenant le tampon de réaction et la protéine précurseur radiomarquée.

Notez qu’il doit y avoir une réaction pour chaque condition à tester. Utilisez environ 10 millions de chloroplastes par point temporel. Incuber le tube à réaction à 25 degrés Celsius dans un bain-marie sous une quantité limitée de lumière.

De temps en temps, agitez les tubes pour remettre les chloroplastes en suspension. Pour effectuer un cours temporel, avec des aliquotes de 130 millilitres de la réaction aux points temporels requis dans la plage linéaire d’importation. Immédiatement après le retrait, transférez chaque aliquote de 130 microlitres dans un tube de tampon d’arrêt d’importation glacé mélangé en tapotant doucement le tube, et placez les tubes sur de la glace jusqu’à ce que le cours de temps soit terminé.

Une fois le dernier échantillon prélevé, centrifugez tous les échantillons pendant 30 secondes à 12 000 fois g dans un Microfuge. Ensuite, jetez les surnageants et remettez les granulés en suspension dans 15 microlitres de tampon de charge de deux x protéines. Mélangez ensuite les échantillons par vortexing.

Enfin, analysez tous les échantillons, ainsi qu’un contrôle d’entrée de précurseur, à l’aide du SDS-PAGE standard et de l’autoradiographie, de la fluorographie ou de la phosphorimage. PsaD est un composant de 18 kilodaltons du photosystème I qui est synthétisé comme un précurseur plus grand de 23 kilodaltons. Le traitement jusqu’à la forme mature de 18 kilodaltons indique qu’il y a eu importation dans les chloroplastes.

Le mutant sp1 d’Arabidopsis étudié ici porte un défaut dans un régulateur important de la machinerie d’importation de la protéine chloroplaste, la protéine sp1. Dans des conditions de stress, la quantité de protéine PsaD importée dans les chloroplastes mutants sp1 est augmentée par rapport au type sauvage, mais pas dans des conditions normales non stressantes. Alors que la forme protéique mature de PsaD s’est accumulée de manière dépendante du temps avec les chloroplastes des deux génotypes de plantes, le taux d’importation était significativement plus élevé pour les chloroplastes mutants sp1 que pour les chloroplastes de type sauvage.

Ces résultats impliquent un rôle important pour la protéine sp1 dans la régulation de l’importation de protéines chloroplastiques dans des conditions de stress. Une fois maîtrisée, cette méthode, de l’isolement des chloroplastes à la réalisation du test d’importation, peut être réalisée en cinq à six heures si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer toutes les étapes d’isolement des chloroplastes à quatre degrés Celsius pour s’assurer que les chloroplastes conservent une activité maximale.

Après sa mise au point initiale il y a plusieurs décennies, le test d’importation in vitro de protéines de chloroplaste a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine pour explorer de nombreux aspects différents du mécanisme d’importation de protéines de chloroplaste. Le raffinement présenté ici permet d’étudier les effets des conditions de stress sur l’importation de protéines. N’oubliez pas que le travail avec des matières radioactives nécessite des précautions particulières.

Des précautions telles que le port de gants, d’une blouse de laboratoire et de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.