Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés

L’objectif global de cette procédure est de fournir un protocole simple et efficace pour synthétiser des micelles réticulées de disulfure chargées de médicaments pour l’administration ciblée de médicaments. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la nanomédecine. Par exemple, comment produire efficacement des nano-formulations stables.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet de synthétiser facilement des micelles réticulées de disulfure à grande échelle, ce qui est extrêmement souhaitable pour les études cliniques chez les patients. Pour commencer cette procédure, ajoutez deux grammes de monoamine de polyéthylène glycol à terminaison monométhyle dans une fiole à fond rond. Ajoutez dix millilitres de DMF anhydre pour le dissoudre.

Refroidir sur glace. Ajouter trois équivalents d’hydroxybenzotriazole, trois équivalents de DIC et trois équivalents de lysine protégée par le di-eth-moc dans une fiole à fond rond. Ensuite, ajoutez dix millilitres de DMF anhydre.

Remuez le mélange pendant 20 minutes sur une plaque d’agitation magnétique. Ajouter ensuite le mélange dans la fiole à fond rond contenant du polyéthylène glycol à terminaison monométhyle. Retirez la fiole à fond rond du bain de glace, puis remuez toute une nuit à température ambiante.

Une fois l’agitation terminée, confirmez la fin de la réaction comme détaillé dans le protocole de texte. Ajoutez 200 millilitres d’éther glacé dans la fiole de réaction. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant six minutes à quatre degrés Celsius Pour séparer le polymère précipité.

Répétez le processus de précipitation et de centrifugation deux fois, en dissolvant le produit dans 10 millilitres de DMF, à chaque fois avant la précipitation. Ensuite, lavez le polymère trois fois avec de l’éther glacé. Connectez le tube à une source de vide poussé pour éliminer l’éther résiduel.

Après cela, ajoutez 20 millilitres de 20%4-méthylpipéridine dans du DMF au polymère. Remuer jusqu’à ce que la dissolution soit complète. Laissez la réaction s’amuser pendant trois heures.

Après avoir confirmé l’achèvement de la réaction, séchez le produit polymère. Maintenant, composez l’intermédiaire polymère numéro deux sous vide, puis effectuez des étapes supplémentaires de synthèse du polymère comme indiqué dans le protocole de texte. Une fois que l’intermédiaire polymère numéro 10 est produit, transférez-le dans une fiole de réaction.

Ajouter 30 millilitres de DMF anhydre. Dans un nouveau flacon, dissoudre 24 équivalents d’acide cholique activé dans 20 millilitres de DMF. Ajoutez ensuite 48 équivalents de N, N-Diisopropyléthylamine.

Remuer pendant 10 minutes. Une fois l’agitation terminée, transvaser le mélange dans la fiole réactionnelle contenant l’intermédiaire polymère numéro 10. Laissez la réaction fonctionner pendant la nuit.

Le lendemain, confirmez l’achèvement de la réaction et précipitez l’intermédiaire polymère numéro 11, comme indiqué dans le protocole de texte. Composez ensuite l’intermédiaire polymère dans de l’eau désionisée. Lyophilisez l’échantillon pour obtenir une poudre blanche.

Après avoir préparé les micelles, dissoudre 20 milligrammes de télodendrimère et cinq milligrammes de PTX dans un millilitre de chloroforme. Éliminer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir un film polymère sec homogène. Reconstituer le film avec un millilitre de PBS par vortexing.

Puis sonicate pendant 30 minutes à 40 kilohertz. Ajoutez 3 % de peroxyde d’hydrogène pour oxyder les groupes thiols sur le télodendrimmer. Effectuer les étapes supplémentaires de préparation et de vérification décrites dans le protocole textuel.

Une fois la préparation des micelles terminée, mesurez la taille et la distribution granulométrique des micelles à l’aide d’un instrument de diffusion dynamique de la lumière. Effectuez les mesures à température ambiante et maintenez la concentration micelle à un milligramme par millilitre. Préparez ensuite une solution mère de 7,5 milligrammes par millilitre de dodécylsulfate de sodium dans du PBS.

Préparez ensuite une solution mère de 1,5 milligramme par millilitre de micellules réticulées de disulfure dans du PBS. L’utilisation de ces solutions mères crée un mélange dans lequel la concentration finale de SDS est de 2,5 milligrammes par millilitre. Et la concentration micellaire est de 1,0 milligramme par millilitre.

Chargez l’échantillon et mesurez la taille et la distribution granulométrique de la solution micellaire à deux minutes d’intervalle. Après avoir prélevé du sang frais citraté de souris nues, centrifugez un échantillon de sang d’un millilitre à 1 000 x g pendant 10 minutes pour collecter des globules rouges. Lavez-les trois fois avec du PBS, puis remettez en suspension la pastille cellulaire avec du PBS jusqu’à une concentration finale de 2 %Mélangez 200 microlitres de suspension érythrocytaire avec une solution de 1,0 milligramme par millilitre de PTX NCM.

Mélangez ensuite 200 microlitres de suspension érythrocytaire avec une solution de 1,0 milligramme par millilitre de DCM PTX. Incuber ces mélanges dans un agitateur d’incubateur pendant quatre heures à 37 degrés Celsius. Une fois l’incubation terminée, centrifugez les mélanges à 3 000 x g pendant cinq minutes.

Transférez 100 microlitres du surnageant de chaque échantillon dans une plaque à 96 puits. Ensuite, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance de l’hémoglobine libre à 540 nanomètres. Tel que mesuré par le test d’Ellman, le taux de conversion des groupes thiols libres en liaisons disulfure a atteint 85 % après 48 heures d’oxydation médiée par l’oxygène.

Ici, une méthode d’oxydation médiée par le peroxyde d’hydrogène est utilisée comme méthode alternative. Le taux de conversion atteint 88 % en 30 minutes. Ce qui est 96 fois plus rapide que l’approche médiée par l’oxygène.

En utilisant cette approche plus efficace, plus de 50 grammes de nanoparticules ont été produits avec une taille de particule mesurée de 27 nanomètres avec une distribution de taille étroite. La stabilité des micelles réticulées disufide chargées de PTX est également étudiée dans des conditions sévères de perturbation des micelles. La taille des particules des micelles est restée stable au fil du temps, ce qui indique qu’elles sont restées intactes.

Après l’introduction de GSH à une concentration intracellulaire, la taille des micelles réticulées de disulfure chargées de médicament reste intacte pendant 30 minutes, puis diminue brusquement à un nanomètre. Cela signifie la réduction d’un nombre critique de liaisons disulfure, condition préalable à la dissociation rapide des micelles. Les résultats représentatifs de l’activité hémolytique des micelles chargées de PTX sont présentés ici.

Les NCM PTX ont un nombre de lyses des globules rouges dose-dépendant. Cependant, les DCM PTX qui ont une réticulation disulfure ne montrent aucune activité hémolytique observable. Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée dans une autre si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’ajouter une quantité égale de peroxyde d’hydrogène à 3 % pour la formation de disulfure. Suite à cette procédure, un test d’hémolyse peut être effectué afin d’évaluer la compatibilité sanguine des micelles réticulées de disulfure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser efficacement des micelles réticulées de disulfure chargées de médicaments.

N’oubliez pas que certains de ces produits chimiques peuvent être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.