Le dépistage de la Endocrine Activité en eau à l'aide disponibles dans le commerce In vitro Transactivation Bioassays

L’objectif global de cette procédure normalisée est de dépister des échantillons d’eau pour détecter la présence de substances chimiques actives sur le système endocrinien, à l’aide d’essais cellulaires basés sur des récepteurs disponibles dans le commerce. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la surveillance de la qualité de l’eau, telles que : des produits chimiques actifs sur le système endocrinien sont-ils réellement présents dans l’échantillon ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut analyser un groupe de composés actifs endocriniens beaucoup plus rapidement que les méthodes chimiques actuelles.

Cette technique peut aider à diagnostiquer les problèmes de qualité de l’eau qui découlent de la présence de produits chimiques perturbateurs endocriniens. Cette méthode donne un aperçu des contaminants dans l’eau, mais elle peut également être appliquée à d’autres matrices environnementales, telles que les sédiments et les tissus. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique peuvent avoir des difficultés, car elle nécessite une grande précision lors de l’utilisation des techniques de pipetage.

Pour commencer cette procédure, préparer l’échantillon d’eau dans des solutions mères de milieu spécifique à l’essai et de produit chimique de référence, comme indiqué dans le protocole de texte. Conservez le milieu spécifique au test à quatre degrés Celsius pour un stockage à long terme. Ensuite, ajoutez 15 microlitres de la substance chimique de référence appropriée à 285 microlitres de milieu de test dans un tube stérile.

Mélangez l’échantillon en pipetant de haut en bas. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de DMSO à 5 % dans un milieu de dosage à huit tubes supplémentaires. Transférez une aliquote de 100 microlitres du tube un au tube deux, pour commencer une série de dilutions en trois parties.

Mélangez soigneusement l’échantillon dilué dans le tube deux à l’aide d’une pipette. Ensuite, transférez une aliquote de 100 microlitres du tube deux au tube trois. Continuez ce processus pour chaque tube.

Ensuite, préparez un échantillon de contrôle de solvant en mélangeant 10 microlitres de DMSO dans 190 microlitres de milieu de dosage. Ensuite, collectez et étiquetez quatre nouveaux tubes. Ajoutez 95 microlitres de milieu de dosage dans le premier tube.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’extrait d’eau et mélangez soigneusement. Ajouter 50 microlitres de DMSO à 5 % dans un milieu de dosage dans les trois autres tubes. Ensuite, effectuez une double dilution en transférant 50 microlitres de solution d’un tube à l’autre.

Commencez par prélever un flacon de cellules arrêtées par division ER ou GR hors du congélateur cryogénique. Décongelez rapidement les cellules en plaçant le flacon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, en agitant doucement pendant deux minutes. Ensuite, décontaminez le flacon avec de l’éthanol à 70 %.

Placez-le dans une enceinte de sécurité biologique de classe deux. Ouvrez le flacon à l’aide de techniques aseptiques et transférez les cellules dans 10 millilitres de milieu de dosage. Centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes.

Une fois la centrifugation terminée, utiliser une pipette en verre stérile pour aspirer le surnageant. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans six millilitres de milieu de dosage. Mélangez cinq microlitres de suspension cellulaire avec cinq microlitres de solution de coloration vitale.

Ensuite, ajoutez une aliquote dans une chambre de comptage. Comptez le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un microscope optique ou d’un compteur de cellules automatisé. Ensuite, estimez la densité des cellules vivantes dans la suspension cellulaire.

Diluer si nécessaire, pour obtenir une densité finale de 550 000 cellules vivantes par millilitre de milieu de dosage. Commencez par créer une disposition de plaque qui comprend une courbe d’étalonnage spécifique au test en neuf points, des échantillons d’AQ/CQ et plusieurs dilutions pour chaque extrait d’eau. Ajouter 90 microlitres de milieu de test dans les puits de contrôle libres de cellules répliquées.

Versez la suspension cellulaire dans un réservoir de pipetage stérile. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 90 microlitres de suspension cellulaire dans les autres puits. Ajouter 10 microlitres d’échantillons dilués dans les puits appropriés.

Couvrez l’assiette avec un couvercle. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Une fois l’incubation terminée, laissez la plaque s’équilibrer à la température ambiante.

Ensuite, les prochaines étapes doivent être menées en l’absence de lumière directe. Préparez une solution de chargement six fois selon les instructions du fabricant. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution de chargement dans chaque puits.

Ajouter 10 microlitres de réactif de viabilité cellulaire dans chaque puits, afin d’évaluer la cytotoxicité de l’extrait d’eau diluée. Scellez la plaque avec un film adhésif en aluminium. Ensuite, incubez la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures.

Une fois l’incubation terminée, ajoutez la plaque dans le lecteur de microplaques doté de capacités de lecture par le bas. Mesurez la fluorescence et analysez les données comme indiqué dans le protocole texte. Dans cette étude, quatre échantillons composites de 24 heures d’effluents d’eaux usées municipales traitées, six échantillons instantanés d’eau de surface provenant de systèmes d’eau douce du sud de la Californie et un blanc de terrain composé d’eau ultra-pure ont été analysés.

Une activité RE a été détectée dans sept des 10 échantillons d’eau représentatifs, tandis que l’activité RG a été détectée dans quatre. Les lignes directrices sur les performances QA/QC pour les tests des récepteurs des œstrogènes et des récepteurs des glucocorticoïdes peuvent être consultées ici. Les résultats de l’étude pour la cytotoxicité et la précision de l’échantillon étaient bien en deçà des critères d’acceptation, validant les mesures de l’échantillon d’eau.

Les concentrations équivalentes les plus élevées ont été observées dans les effluents secondaires, tandis que l’activité RG de l’effluent tertiaire était inférieure à la limite de détection de l’essai biologique. De même, la plupart des échantillons d’eau de surface n’ont montré aucune activité RG au-dessus de la limite de détection et présentaient des niveaux d’activité RE beaucoup plus faibles que les effluents secondaires. La majorité des échantillons d’effluents d’usines de traitement des eaux usées ont montré une relation dose-réponse supérieure à la limite de détection pour les essais biologiques RE et GR.

Les résultats représentatifs du rapport de fluorescence bleu/vert moyen de ces échantillons, tracés en fonction du facteur d’enrichissement relatif, peuvent être consultés ici. Cette technique peut être réalisée en 24 heures, si elle est effectuée correctement. Lorsque vous l’essayez, il est important de suivre toutes les directives d’AQ/CQ.

Cette technique a ouvert la voie aux gestionnaires pour explorer d’autres approches de surveillance des perturbateurs endocriniens dans l’eau. N’oubliez pas que travailler avec de l’azoture de sodium peut être dangereux. Des précautions doivent être prises, comme travailler dans une hotte qui fonctionne correctement.