A Fluorescence Assay simple pour Quantification de Canine neutrophiles extracellulaires Piège sortie

L'objectif général de cette expérience est d'isoler des neutrophiles quiescents et de mesurer leur libération d'ADN en réponse à des agonistes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en immunologie et en médecine vétérinaire, telles que : quelle est la réponse des neutrophiles à divers agonistes de l'induction des pièges extracellulaires des neutrophiles ou de la mort cellulaire ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet le criblage rapide de divers agonistes et inhibiteurs de la formation de pièges extracellulaires des neutrophiles.

Commencez par insérer une aiguille papillon de calibre 21 dans la veine céphalique d’un chien donneur en bonne santé, puis fixez une seringue de trois millilitres et prélèvez trois échantillons sanguins de trois millilitres, en transférant immédiatement les échantillons dans des tubes à sang non bouchonnés contenant du EDTA. Veillez à ce que la ponction veineuse soit atraumatique et que le débit sanguin soit satisfaisant, car un prélèvement sanguin insuffisant entraînera un rendement médiocre en neutrophiles. Après avoir rempli chaque tube, retournez-les afin de garantir un mélange adéquat du sang et de l’anticoagulant.

Rassembler le sang dans un tube conique de 50 millilitres. Mélanger les échantillons avec un volume égal de Dextran 500 stérile à 3 % à température ambiante par retournements doux et laisser le tube en position verticale pendant 18 à 20 minutes à température ambiante. Ensuite, transférer la couche supérieure de couleur jaunâtre dans un tube neuf jusqu'à ce qu'elle ne puisse plus être collectée sans contamination par la couche inférieure rouge.

Centrifuger la couche supérieure. Jeter le surnageant, en resuspendant manuellement le culot dans 10 millilitres de PBS stérile à température ambiante. Ensuite, ajouter 10 millilitres d'une solution de séparation cellulaire contenant du polysucrose dans du diatrizoate de sodium à température ambiante dans un tube conique de 50 millilitres.

Déposez soigneusement les cellules en couche au-dessus de la solution de séparation. Séparez les cellules par centrifugation. Éliminez les trois couches supérieures constituées du plasma, des plaquettes, des cellules mononucléées et du gradient de densité.

Lyserez tous les érythrocytes restants avec 10 millilitres d'eau à température ambiante. Après 30 secondes, ajouterez 10 millilitres de chlorure de sodium stérile à 1,8 % à température ambiante pour rétablir la tonicité. Mélangerez les cellules par retournement doux.

Prélève maintenant les cellules par centrifugation. Resuspendre délicatement le culot blanc dans 10 millilitres de PBS stérile. Après le comptage, centrifuger à nouveau les cellules et resuspendre le culot à une concentration de cinq fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans du PBS stérile à température ambiante.

Sécher à l'air, selon les besoins, un petit volume de cellules sur un porte-objet en verre, puis les colorer à l'aide d'un kit de fixation et de coloration rapide, conformément aux instructions du fabricant. Si l'isolement des neutrophiles a réussi, au moins 95 % des cellules nucléées devraient être des granulocytes, avec une contamination érythrocytaire minimale, comme observé en microscopie optique. Immédiatement après l'isolement des neutrophiles, faire passer la suspension cellulaire à travers un filtre stérile de 70 microns et ajouter cinq fois 10 à la puissance quatre cellules dans les puits d'une plaque de 96 puits contenant le milieu de culture, puis incuber pendant 30 minutes à 39 degrés Celsius et 4 % de dioxyde de carbone.

Une fois les cellules attachées, ajouter aux puits d'essai, ainsi qu'à deux puits témoins contenant uniquement du PBS, jusqu'à un volume final de 100 à 200 microlitres de l'agoniste d'intérêt dans du RPMI sans rouge de phénol et complété par du SFC inactivé par la chaleur. Ensuite, ajouter une sonde fluorescente spécifique des acides nucléiques imperméable aux cellules, puis replacer la plaque dans l'incubateur. Après la période d'incubation appropriée, mesurer la fluorescence à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Une stimulation d'une heure des neutrophiles canins par le facteur d'activation des plaquettes entraîne une augmentation moyenne de fluorescence quatre fois supérieure par rapport aux cellules contrôles non stimulées. Cependant, le PMA est un agoniste plus lent qui ne montre aucune augmentation de la fluorescence des neutrophiles avant deux heures d'activation, mais qui produit finalement, au fil du temps, un accroissement similaire du taux de fluorescence. La fluorescence du colorant d'acide nucléique n'est pas spécifique de la formation de pièges extracellulaires neutrophiliques, car elle peut également apparaître en cas de mort cellulaire par d'autres mécanismes ou si les réactifs sont contaminés par de l'ADN.

Par exemple, dans cette expérience représentative, une préparation commerciale de LPS a produit une fluorescence très élevée en l'absence de neutrophiles, probablement en raison d'une contamination par de l'ADN bactérien. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ six heures si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de manipuler délicatement les neutrophiles.

Ne vortexez pas les cellules et aspirez les surnageants au lieu de les verser. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme la microscopie en immunofluorescence, peuvent être réalisées afin de confirmer que l'ADN libéré correspond à la NETose. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'hématologie pour explorer l'interaction entre l'ADN libéré et la coagulation, ainsi que l'effet de nouveaux agonistes de NET, notamment le plasma de patients.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les neutrophiles canins et de mesurer leur réponse aux agonistes.