Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

L’objectif global de ce protocole est de générer des protéines basées sur le domaine extracellulaire de la glycoprotéine des oligodendrocytes de myéline ou MOG, qui peut être utilisée pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale ou EAE. Ce protocole permet à n’importe quel laboratoire de fabriquer la protéine MOG afin de l’utiliser comme antigène pour induire l’EAE. Le principal avantage de ce protocole est qu’il ne repose pas sur un équipement spécialisé de manipulation des protéines, mais que vous pouvez utiliser un équipement standard que l’on trouve dans presque tous les laboratoires d’immunologie.

Eh bien, ce protocole a été optimisé pour la protéine de marquage MOG basée sur la version de la souris, il devrait fonctionner pour d’autres systèmes d’expression de protéines MOG qui intègrent un hestate pour la purification. Inoculez cinq millilitres de bouillon stérilisé avec le stock de glycérol BL 21 MOG et incubez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Ajouter 500 microlitres d’ampicilline de 100 milligrammes par millilitre dans chacun des flacons de 500 millilitres contenant 500 millilitres de LB stérile. Transférez un millilitre de la culture de nuit dans chacun des deux flacons de bouillon LB.

Incuber à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant cinq heures ou jusqu’à une densité optique de 0,6. Une fois que la densité cellulaire souhaitée est atteinte, ajoutez 0,5 millilitre d’une molaire IPTG dans chaque flacon de culture. Incuber le flacon, régler à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant quatre heures, puis à température ambiante et 75 tr/min pendant la nuit.

Répartissez uniformément les cultures dans des bouteilles de 250 millilitres compatibles avec la centrifugation à grande vitesse et gardez les bouteilles sur la glace à partir de maintenant. Granulez les cellules bactériennes à 22 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Remettez en suspension et combinez tous les granulés bactériens dans un total de 30 millilitres de tampon de lysat.

Transférez ce volume dans un tube inférieur de 50 millilitres capable d’une centrification à grande vitesse. Placez ce tube dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant le temps d’incubation, secouez deux fois le tube pour remettre les cellules en suspension.

Après l’incubation, transportez le tube sur de la glace et sonicez la solution à 20 kilohertz et à 70 % d’amplitude en pulsant pendant trois secondes et en arrêtant pendant trois secondes pendant cinq impulsions, sonisez la solution pendant six cycles au total de cinq impulsions, permettant à la solution de refroidir dans la glace entre les tours. Ensuite, centrifugez la solution à 24 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis remettez la pastille en suspension dans 30 millilitres de tampon A et incubez la solution à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, sonifiez la solution sur de la glace comme précédemment, puis ajoutez 17,2 grammes de chlorhydrate de guanidine à la solution.

Incuber l’échantillon sur de la glace pendant une heure pour solubler la protéine de marquage MOG. Pour charger et équilibrer la résine de nickel, lavez d’abord la résine en ajoutant 40 millilitres d’eau dans chaque tube contenant de la résine. Posez les tubes horizontalement sur une bascule et laissez-les agiter pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Une fois terminé, centrifugez les tubes à 4500 fois g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant par pipetage pour éviter de déranger la pastille. Ajoutez ensuite 40 millilitres de tampon de charge dans chaque tube.

Transférez les tubes sur une bascule et laissez-les agiter pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius avant de centrifuger à nouveau comme précédemment. Jetez le surnageant et ajoutez 40 millilitres de tampon B dans les tubes. Transférez les tubes sur une bascule et laissez-les agiter pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avant de centrifuger à nouveau les tubes avec de la résine.

Pour purifier la protéine de marquage MOG, transférez tout le volume de protéine solublisée dans le premier tube contenant de la résine de nickel. Après avoir mélangé, placez le tube horizontalement sur une bascule à quatre degrés Celsius pendant une heure. Après avoir centralisé le tube à 4500 fois g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius, transférez ce surnageant dans le deuxième tube de résine de nickel et incubez comme précédemment.

Pendant ce temps, remettez en suspension la résine de nickel dans le premier tube dans un tampon d’évolution de 40 millilitres et placez le tube horizontalement sur une bascule à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avant de centrifuger comme précédemment. Transférez le surnageant contenant la protéine de marquage MOG mentionnée dans une bouteille de 250 millilitres étiquetée protéine de marque MOG purifiée. Conservez cette bouteille à quatre degrés Celsius.

À chaque étape d’élution, regroupez le surnageant résultant dans cette bouteille. Ajoutez 40 millilitres de tampon à bande au nickel présent dans le premier tube et placez-le horizontalement sur une bascule pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Centrifugez le tube, jetez le surnageant et rechargez le nickel levé comme précédemment.

Une fois terminé, avancez avec le deuxième tube comme cela a été fait pour le premier tube. Un total de quatre cycles d’absorption de la protéine solubilisée sur la résine de nickel chargée et l’élution permettra de récupérer la majeure partie de la protéine. Coupez environ 30 centimètres de tube de dialyse en peau de serpent.

Fixez une extrémité avec un hémostat verrouillable en pliant l’extrémité de la peau de serpent trois fois et en serrant l’extrémité pliée avec l’hémostat. Remplissez la peau du serpent avec de la protéine d’étiquette MOG diluée. Ensuite, retirez toutes les bulles d’air de la peau de serpent en les forçant à sortir de l’extrémité ouverte.

Enfin, scellez l’autre extrémité du tube à l’aide d’un deuxième hémostat de verrouillage. Ensuite, remplissez un grand seau avec un litre d’un tampon en acétate avec quatre molaires de guanidine. Placez jusqu’à deux sections de tube de dialyse contenant la protéine d’étiquette MOG dans le seau.

À l’aide de ruban adhésif, fixez les hémostats sur le côté du seau pour laisser de la place à une barre d’agitation magnétique pour tourner sans entrave dans le fond. Placez le seau dans une pièce à quatre degrés Celsius sur une plaque de jupe magnétique et allumez-le à un taux de rotation lent. La dialyse dure au moins trois jours pour réduire progressivement la quantité de guanidine dans le tampon.

Vérifiez régulièrement que le tube commence intact et que les extrémités sont bien fermées. Après quatre à cinq heures, ajoutez un litre d’un tampon en acétate dans le seau de dialyse. Répétez ce processus toutes les quatre à cinq heures pour un total de trois fois pour obtenir un total de quatre litres dans le seau.

Après avoir jeté la moitié du tampon dans le seau, remplissez avec un litre d’un tampon en acétate et installez le tube et le guide-barre. Enfin, remplacez tout le volume de quatre litres dans le seau par quatre litres de tampon frais un x acétate et laissez remuer pendant quatre à cinq heures. Pour de meilleurs résultats, effectuez cette étape le jour de la concentration des protéines.

Pour concentrer la protéine de l’étiquette MOG, tapissez un stylo de papier d’aluminium et recouvrez la feuille d’aluminium de PEG 3350 et de PEG 1000 dans un rapport de un à un. Le PEG 3350 peut aider à prévenir l’agrégation des protéines pendant la concentration et c’est un cryoconservateur efficace. Placez la protéine de marquage MOG contenant un tube en peau de serpent sur la feuille d’aluminium et recouvrez de PEG 8000.

Laissez-le reposer à température ambiante et vérifiez régulièrement le volume jusqu’à ce que le volume soit égal ou inférieur au volume final estimé. Si le stylo devient trop saturé d’eau pendant le processus de concentration, installez une nouvelle casserole avec du papier d’aluminium et du PEG. Échantillons de protéines prélevés tout au long du protocole de purification ou analysés sur un gel de page FDS pour confirmer la pureté.

Un gel représentatif est affiché montrant l’étiquette MOG hautement purifiée à 31,86 kilodaltons. Pour vérifier que la protéine de marquage MOG s’est correctement repliée, la liaison de la protéine de marquage MOG à neuf lymphocytes B CD19 positifs et CD4 négatifs provenant de ganglions lymphatiques de souris noires de type sauvage C57 ou de souris MOG IgH exprimant une chaîne lourde d’immunoglobulines spécifique de la protéine MOG a été évaluée à l’aide de la cytométrie en flux. Ce protocole nécessite un minimum de 10 jours du début à la fin.

Tout au long de la procédure d’isolement, il est important de garder une trace de la protéine et de se rappeler ce qui doit être conservé et ce qui doit être jeté. N’oubliez pas que lors de l’utilisation de sulfate de nickel hexahydraté utilisé dans le chargement de la résine de nickel, il est extrêmement dangereux et des précautions doivent être prises pour éviter l’inhalation ou le contact avec la peau ou les yeux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire et de purifier votre propre protéine de marquage MOG.

Une fois purifiée, la protéine MOG peut être émulsionnée dans l’adjuvant de Freund complet et utilisée comme immunisation pour induire l’EAE. L’EAE induite par le marqueur MOG peut être utilisée pour étudier l’implication de plusieurs types de cellules telles que les cellules CD4 ou CDAT ou les cellules B dans l’auto-immunité du système nerveux central. Contrairement au peptide court, qui est restreint par le CMH, l’antigène protéique peut être utilisé dans n’importe quelle souche de souris.