Name: Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Apprenez à produire et purifier la protéine MOG murine pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale. Cette méthode accessible utilise un équipement standard de laboratoire d'immunologie.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Société canadienne de la sclérose en plaques. RWJ est le récipiendaire d’une bourse de doctorat de la Société canadienne de la sclérose en plaques de la famille Waugh.

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ici, nous avons décrit un protocole pour la production de MOG protéine étiquette et comment générer MOG pur 1-125 de la protéine MOG d&#39;étiquette. Ce protocole est basé à la fois sur la base des procédés de purification de protéines His-tag standard, ainsi qu&#39;un protocole décrit précédemment pour la production d&#39;une protéine à base de MOG âgée 15. Bien qu&#39;il ne soit pas décrit ici, l&#39;utilisation primaire de la protéine MOG tag est d&#39;induire l&...

La SEP est une maladie humaine chronique caractérisée par une inflammation et les maladies neurodégénératives du système nerveux central qui est censée être entraînée par une réponse auto-immune dirigée vers la myéline. La perte de la myéline et des axones au fil du temps le résultat de la baisse progressive de la fonction cognitive et motrice 1. &quot;Auto-immune expérimentale encéphalomyélite&quot; est un terme générique pour les modèles animaux de la maladie auto-immune dirigée vers la myéline du SNC. Comme MS humaine, EAE est généralement caractérisée par une infiltration de cellules immunitaires du système nerveux central et, dans certains cas, 2 démyélinisation. Cependant, la mesure dans laquelle un modèle EAE donné ressemble à MS humaine dépend en partie de l&#39;espèce ou de la souche utilisée et de la complexité de la réponse auto-immune anti-myéline sous-jacente. autoimmunité anti-myéline peut être induite expérimentalement de plusieurs façons, mais la méthode la plus couramment utilisée aujourd&#39;hui consiste à immuniser des souris avec un peptide court d&#39;acides aminés mimant le CD4 immunodominant <sup&gt; + T épitope d&#39;une protéine de myéline. Cela représente le minimum requis pour induire une réponse pathogène. Peut-être le plus commun de ces derniers est un peptide de 21 acides aminés dérivée de la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG 35-55), qui est utilisé pour induire l&#39; EAE chez les souris C57BL / 6 3. Toutefois, pour certaines fins expérimentales, il est souhaitable, voire nécessaire, pour immuniser avec de plus grands antigènes protéiques et en effet il y a plusieurs avantages à cette immunisation avec plus de peptide court. Tout d&#39;abord, en raison de la restriction du CMH, des peptides courts ne sont généralement efficaces dans une gamme très limitée de souches, tandis que les grands antigènes protéiques représentant soit l&#39;ensemble de la protéine ou d&#39;un domaine spécifique peuvent être traitées normalement pour la présentation sur plusieurs souches de souris consanguines ou même chez différentes espèces 4. En second lieu, un antigène de protéine plus grande est capable d&#39;induire une réponse immunitaire plus complexe comportant plusieurs types de lymphocytes dans la reconnaissance des antigènes, plutôt que limiting reconnaissance de l&#39; antigène aux lymphocytes T CD4 +. Par exemple, les cellules B via leur récepteur des cellules B (BCR) interagissent directement avec la protéine entière plutôt que de traiter. Nous et d&#39; autres ont montré que les cellules B activées par MOG 35-55 vaccination ne reconnaissent pas la protéine MOG 5. Comme les cellules B ont été récemment démontré à jouer un rôle pathogène dans MS humaine 6, les modèles EAE qui incorporent les cellules B en pathologie auto - immune sont de plus en plus importante. Malgré les avantages de l&#39;utilisation de plus grandes protéines d&#39;antigènes pour induire l&#39;EAE, il reste peu de sources disponibles dans le commerce pour de telles protéines. En effet, alors que les peptides courts comme MOG 35-55 peuvent être synthétisés très rapidement et à un coût relativement faible, les options commerciales pour la protéine MOG sont limitées et le coût nettement plus à l&#39; achat. Néanmoins, il existe plusieurs vecteurs d&#39;expression disponibles pour les groupes de recherche pour générer MOG domaine extracellulaire (MOG 1-125) eux - mêmes. However, tous les systèmes d&#39;expression que nous avons identifiés dans la littérature sont basées sur les technologies plus anciennes qui ont depuis été remplacés par des systèmes d&#39;expression plus efficaces 7. En outre, la plupart sont basées sur le rat ou humain MOG 8. Pour certaines enquêtes d&#39;auto-immunité chez la souris, un antigène sur la base du autoantigène MOG de la souris est préférable. Enfin, toutes les protéines à base de MOG que nous avons identifiés, qu&#39;ils soient commerciaux ou sous forme de vecteurs d&#39;expression, sont des protéines de fusion contenant des acides aminés supplémentaires à la base MOG 1-125. Ceux-ci comprennent une étiquette pour la purification et le plus souvent d&#39;autres séquences ainsi, dont beaucoup avec une fonction que nous étions incapables d&#39;identifier. Pour répondre à ces limitations, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion sur la base du MOG domaine extracellulaire de la souris fusionnée à une étiquette contenant la thiorédoxine pour lutter contre l&#39;insolubilité connu de la protéine MOG 5. La séquence de balise contient également une séquence 6xHis pour la purification et une protéase TEV cleSite Avage qui permet l&#39;élimination complète de toutes les séquences marqueur, si on le souhaite. Ceci est la seule méthode que nous sommes conscients de pour générer pur protéine MOG 1-125. Afin de faciliter la production de grandes quantités de protéine, dont la séquence a été MOG 1-125 codon optimisé pour l&#39; expression bactérienne et la protéine marqueur de fusion MOG a été insérée dans le système d&#39;expression pET-32. Ici, nous décrivons en détail le protocole pour produire et purifier MOG protéine étiquette, et MOG pur 1-125, en utilisant un équipement non spécialisé disponible pour la plupart des laboratoires d&#39;immunologie.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli-pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Ces bactéries sont nécessaires à la fabrication de la protéine MOGtag. Des stocks de glycérol de ces bactéries sont disponibles sur demande.</td></tr><tr><td>LB bouillon meunier</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>bio basique</td><td>AB0028</td><td>Reconsitituter la poudre en 50 % d’éthanol/ 50 % H2O à 100 mg/ml. Stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Reconsitititu la poudre en H2O à 1M et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Lysozyme poule-œuf</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Reconstituer en H2O à 50 mg/ml et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr>Technologies <td>de vie</td><td>saline tamponnée au phosphate</td><td>20012-027</td><td>La solution saline tamponnée au phosphate commerciale n’est pas nécessaire, toute solution saline tamponnée au phosphate standard fabriquée en laboratoire est suffisante.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td></td><td>Bioshop SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>La qualité doit être supérieure à 98 % de pureté.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de nickel (II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>Résine de liaison de His</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Stocker dans 20 % d’éthanol 80 % H2O à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Éthanol anhydre</td><td>Alcools commerciaux</td><td>P016EAAN</td><td>Diluer avec de l’eau au besoin.</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine standard</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad dosage des protéines concentré de réactif</td><td>colorant bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique dihydraté</td> Fisher <td>scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Tube de dialyse</td><td>Snakeskin Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Ce réactif ne doit pas être manipulé en dehors d’une hotte.</td></tr><tr><td>AcTEV protéase</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>La production de votre propre protéase TEV peut être réalisée à l’aide de (https://www.addgene.org/8827/) et purifiée comme dans la référence 17</td></tr><tr><td>Polyéthylèneglycol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polyéthylèneglycol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp fond plat 96 plaque de puits</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de microplaques Eon</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Cet équipement utilise le logiciel d’analyse de données Gen5.</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodécylsulfate de sodium</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>bleu de bromophénol</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage des protéines</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>Gel préfabriqué 12 % polyacrylamide</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de coloration rapide</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Plateau d’échantillons à lumière blanche</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp ;</td><td>Utilisé avec l’imageur gel dock EZ pour les taches de bleu coomassie</td></tr><tr><td>Échelle protéique</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC), dont on pense qu’elle survient à la suite de réponses auto-immunes ciblant la myéline. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal le plus courant de maladie auto-immune du SNC et est généralement induite par l’immunisation avec des peptides courts représentant des épitopes de cellules T CD4+ immunodominants des protéines de myéline. Cependant, les lymphocytes B reconnaissent directement les protéines non transformées, et l’immunisation avec un peptide court n’active pas les lymphocytes B qui reconnaissent la protéine native. Étant donné que de récents essais cliniques sur des thérapies d’appauvrissement des lymphocytes B dans le traitement de la SP ont suggéré que les lymphocytes B jouent un rôle dans l’apparition de maladies chez l’humain, il est urgent de disposer de modèles animaux intégrant la reconnaissance de l’auto-antigène par les lymphocytes B. À cette fin, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion contenant le domaine extracellulaire de la version murine de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) ainsi que des fusions N-terminales d’un His-tag à des fins de purification et de la protéine thiorédoxine pour améliorer la solubilité (MOG tag). Un site de clivage de la protéase du virus de gravure du tabac (TEV) a été incorporé pour permettre l’élimination de toutes les séquences de marqueur, ne laissant que le domaine extracellulaire pur MOG1-125. Ici, nous décrivons un protocole simple utilisant uniquement un équipement de laboratoire standard pour produire de grandes quantités demarqueur MOG pur ou MOG1-125. Ce protocole génère constamment plus de 200 mg de protéine demarquage MOG. L’immunisation avecl’étiquette MOG ou le MOG1-125 génère une réponse auto-immune qui comprend des lymphocytes B pathogènes qui reconnaissent le MOG natif de la souris.

Une fois la purification terminée, les échantillons prélevés dans les étapes 1.4, 2.1, 3.4, et le produit final de l&#39; étape 6.4 doivent être exécutés sur un gel de protéine (figure 3A). MOG tag devrait d&#39; abord apparaître comme une bande 31,86 kDa dans l&#39;échantillon T O / N, mais pas T 0, et devrait être le seul groupe dans le produit pur final. Pour tester si la balise protéine MOG a correctement repliée, la b...

Nous décrivons un protocole simple utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire de base pour générer et purifier de grandes quantités d’une protéine de fusion contenant de la myéline, de la glycoprotéine oligodendrocytaire de souris. Cette protéine peut être utilisée pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale entraînée par les lymphocytes T et B.

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

L'objectif général de ce protocole est de produire une protéine basée sur le domaine extracellulaire de la glycoprotéine myélinique des oligodendrocytes, ou MOG, qui peut être utilisée pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, ou EAE. Ce protocole permet à tout laboratoire de produire la protéine MOG afin de l'utiliser comme antigène pour induire l'EAE. Le principal avantage de ce protocole est qu'il ne nécessite pas d'équipement spécialisé pour la manipulation des protéines, mais utilise plutôt du matériel standard disponible dans presque tous les laboratoires d'immunologie.Eh bien, ce protocole a été optimisé pour la protéine MOG taguée à partir de la version murine ; il devrait fonctionner pour d'autres systèmes d'expression de la protéine MOG incorporant une étiquette his pour la purification. Ensemencer cinq millilitres de bouillon stérilisé avec le stock glycérolé BL21 MOG tag et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Ajouter 500 microlitres d'ampicilline à 100 milligrammes par millilitre à chacun des deux flacons de 500 millilitres contenant du bouillon LB stérile. Transférer un millilitre de la culture de nuit dans chacun des deux flacon

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Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique d’homogénéisation efficace pour générer une émulsion antigène-adjuvant afin d’induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) dans un modèle murin. L’émulsion contient un auto-antigène – la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) – dans la phase aqueuse, entourée d’une phase huileuse continue comprenant une bactérie pathogène inactivée. L’émulsion assure une libération prolongée d’antigènes pour une réponse immunitaire prolongée.

PRÉPARATION D’UNE ÉMULSION ADJUVANTE D’ANTIGÈNE POUR INDUIRE UNE ENCÉPHALOMYÉLITE AUTO-IMMUNE

La vidéo démontre l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin en injectant une combinaison de glycoprotéines oligodendrocytaires de myéline et de Mycobacterium tuberculosis inactivé. Le modèle permet aux chercheurs d’étudier les mécanismes de la maladie et de tester des interventions thérapeutiques.

Induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Cette vidéo montre la méthode d’induction expérimentale de l’encéphalomyélite auto-immune (EAE) en injectant des peptides dérivés de la myéline avec un adjuvant pour activer les lymphocytes T autoréactifs, qui migrent vers le cerveau. La toxine coquelucheuse est administrée pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant à ces lymphocytes T et à d’autres cellules immunitaires de pénétrer dans le cerveau. Ces cellules immunitaires provoquent une démyélinisation,...

Génération d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Dans cette vidéo, un modèle murin de sclérose en plaques est établi à l’aide d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). On injecte à la souris une émulsion contenant un peptide neuronal et un adjuvant, déclenchant une réponse immunitaire qui active les lymphocytes T autoréactifs. Ceci est suivi d’une injection de toxine coquelucheuse (PTX) pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant aux lymphocytes T autoréactifs d’infiltrer le cerveau. Cette...

Source : Jain, R. W., et al. Production et purification simples et efficaces de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline de souris pour des études expérimentales sur l’encéphalomyélite auto-immune. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre l’isolement et la purification de MOGtag, une glycoprotéine oligodendrocytaire (MOG) de myéline recombinante utilisée dans les études expérimentales sur l’encéphalomyélite auto-immune (EAE). Le protocole implique la lyse bactérienne, la sonication, la...

Isolement et purification de glycoprotéines d’oligodendrocytes de myéline recombinante

La transplantation de cellules souches / progénitrices neurales (PNJ) détient de grandes promesses en neurologie régénérative. L'administration systémique de PNJ est devenu faible invasive, et thérapeutique très efficace protocole efficace, pour fournir des cellules souches dans le cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central.

Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d&#39;EAE chronique

Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal établi de la sclérose en plaques. Souris C57BL / 6 sont immunisées avec la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), entraînant une paralysie flasque ascendante causée par des cellules immunitaires auto-réactifs dans le système nerveux central. Protocoles pour l'induction et la surveillance des maladies seront discutés.

Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induit encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) dans C57BL / 6

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.

Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal de la sclérose en plaques (SEP), qui partage avec la maladie humaine une réponse auto-immune humorale robuste. Ici, nous rapportons un protocole ELISA simple et flexible pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris immunisées contre l’EAE.

Quantification des anticorps autoréactifs chez la souris lors d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Apprenez à produire et purifier la protéine MOG murine pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale. Cette méthode accessible utilise un équipement standard de laboratoire d'immunologie.

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études (Vidéo) | JoVE Journal

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

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