Name: Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Apprenez à produire et purifier la protéine MOG murine pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale. Cette méthode accessible utilise un équipement standard de laboratoire d'immunologie.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de la Société canadienne de la sclérose en plaques. RWJ est le récipiendaire d’une bourse de doctorat de la Société canadienne de la sclérose en plaques de la famille Waugh.

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Ici, nous avons décrit un protocole pour la production de MOG protéine étiquette et comment générer MOG pur 1-125 de la protéine MOG d&#39;étiquette. Ce protocole est basé à la fois sur la base des procédés de purification de protéines His-tag standard, ainsi qu&#39;un protocole décrit précédemment pour la production d&#39;une protéine à base de MOG âgée 15. Bien qu&#39;il ne soit pas décrit ici, l&#39;utilisation primaire de la protéine MOG tag est d&#39;induire l&...

La SEP est une maladie humaine chronique caractérisée par une inflammation et les maladies neurodégénératives du système nerveux central qui est censée être entraînée par une réponse auto-immune dirigée vers la myéline. La perte de la myéline et des axones au fil du temps le résultat de la baisse progressive de la fonction cognitive et motrice 1. &quot;Auto-immune expérimentale encéphalomyélite&quot; est un terme générique pour les modèles animaux de la maladie auto-immune dirigée vers la myéline du SNC. Comme MS humaine, EAE est généralement caractérisée par une infiltration de cellules immunitaires du système nerveux central et, dans certains cas, 2 démyélinisation. Cependant, la mesure dans laquelle un modèle EAE donné ressemble à MS humaine dépend en partie de l&#39;espèce ou de la souche utilisée et de la complexité de la réponse auto-immune anti-myéline sous-jacente. autoimmunité anti-myéline peut être induite expérimentalement de plusieurs façons, mais la méthode la plus couramment utilisée aujourd&#39;hui consiste à immuniser des souris avec un peptide court d&#39;acides aminés mimant le CD4 immunodominant <sup&gt; + T épitope d&#39;une protéine de myéline. Cela représente le minimum requis pour induire une réponse pathogène. Peut-être le plus commun de ces derniers est un peptide de 21 acides aminés dérivée de la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG 35-55), qui est utilisé pour induire l&#39; EAE chez les souris C57BL / 6 3. Toutefois, pour certaines fins expérimentales, il est souhaitable, voire nécessaire, pour immuniser avec de plus grands antigènes protéiques et en effet il y a plusieurs avantages à cette immunisation avec plus de peptide court. Tout d&#39;abord, en raison de la restriction du CMH, des peptides courts ne sont généralement efficaces dans une gamme très limitée de souches, tandis que les grands antigènes protéiques représentant soit l&#39;ensemble de la protéine ou d&#39;un domaine spécifique peuvent être traitées normalement pour la présentation sur plusieurs souches de souris consanguines ou même chez différentes espèces 4. En second lieu, un antigène de protéine plus grande est capable d&#39;induire une réponse immunitaire plus complexe comportant plusieurs types de lymphocytes dans la reconnaissance des antigènes, plutôt que limiting reconnaissance de l&#39; antigène aux lymphocytes T CD4 +. Par exemple, les cellules B via leur récepteur des cellules B (BCR) interagissent directement avec la protéine entière plutôt que de traiter. Nous et d&#39; autres ont montré que les cellules B activées par MOG 35-55 vaccination ne reconnaissent pas la protéine MOG 5. Comme les cellules B ont été récemment démontré à jouer un rôle pathogène dans MS humaine 6, les modèles EAE qui incorporent les cellules B en pathologie auto - immune sont de plus en plus importante. Malgré les avantages de l&#39;utilisation de plus grandes protéines d&#39;antigènes pour induire l&#39;EAE, il reste peu de sources disponibles dans le commerce pour de telles protéines. En effet, alors que les peptides courts comme MOG 35-55 peuvent être synthétisés très rapidement et à un coût relativement faible, les options commerciales pour la protéine MOG sont limitées et le coût nettement plus à l&#39; achat. Néanmoins, il existe plusieurs vecteurs d&#39;expression disponibles pour les groupes de recherche pour générer MOG domaine extracellulaire (MOG 1-125) eux - mêmes. However, tous les systèmes d&#39;expression que nous avons identifiés dans la littérature sont basées sur les technologies plus anciennes qui ont depuis été remplacés par des systèmes d&#39;expression plus efficaces 7. En outre, la plupart sont basées sur le rat ou humain MOG 8. Pour certaines enquêtes d&#39;auto-immunité chez la souris, un antigène sur la base du autoantigène MOG de la souris est préférable. Enfin, toutes les protéines à base de MOG que nous avons identifiés, qu&#39;ils soient commerciaux ou sous forme de vecteurs d&#39;expression, sont des protéines de fusion contenant des acides aminés supplémentaires à la base MOG 1-125. Ceux-ci comprennent une étiquette pour la purification et le plus souvent d&#39;autres séquences ainsi, dont beaucoup avec une fonction que nous étions incapables d&#39;identifier. Pour répondre à ces limitations, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion sur la base du MOG domaine extracellulaire de la souris fusionnée à une étiquette contenant la thiorédoxine pour lutter contre l&#39;insolubilité connu de la protéine MOG 5. La séquence de balise contient également une séquence 6xHis pour la purification et une protéase TEV cleSite Avage qui permet l&#39;élimination complète de toutes les séquences marqueur, si on le souhaite. Ceci est la seule méthode que nous sommes conscients de pour générer pur protéine MOG 1-125. Afin de faciliter la production de grandes quantités de protéine, dont la séquence a été MOG 1-125 codon optimisé pour l&#39; expression bactérienne et la protéine marqueur de fusion MOG a été insérée dans le système d&#39;expression pET-32. Ici, nous décrivons en détail le protocole pour produire et purifier MOG protéine étiquette, et MOG pur 1-125, en utilisant un équipement non spécialisé disponible pour la plupart des laboratoires d&#39;immunologie.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli-pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Ces bactéries sont nécessaires à la fabrication de la protéine MOGtag. Des stocks de glycérol de ces bactéries sont disponibles sur demande.</td></tr><tr><td>LB bouillon meunier</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>bio basique</td><td>AB0028</td><td>Reconsitituter la poudre en 50 % d’éthanol/ 50 % H2O à 100 mg/ml. Stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Reconsitititu la poudre en H2O à 1M et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Lysozyme poule-œuf</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Reconstituer en H2O à 50 mg/ml et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr>Technologies <td>de vie</td><td>saline tamponnée au phosphate</td><td>20012-027</td><td>La solution saline tamponnée au phosphate commerciale n’est pas nécessaire, toute solution saline tamponnée au phosphate standard fabriquée en laboratoire est suffisante.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td></td><td>Bioshop SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>La qualité doit être supérieure à 98 % de pureté.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de nickel (II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>Résine de liaison de His</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Stocker dans 20 % d’éthanol 80 % H2O à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Éthanol anhydre</td><td>Alcools commerciaux</td><td>P016EAAN</td><td>Diluer avec de l’eau au besoin.</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine standard</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad dosage des protéines concentré de réactif</td><td>colorant bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique dihydraté</td> Fisher <td>scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Tube de dialyse</td><td>Snakeskin Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Ce réactif ne doit pas être manipulé en dehors d’une hotte.</td></tr><tr><td>AcTEV protéase</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>La production de votre propre protéase TEV peut être réalisée à l’aide de (https://www.addgene.org/8827/) et purifiée comme dans la référence 17</td></tr><tr><td>Polyéthylèneglycol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polyéthylèneglycol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp fond plat 96 plaque de puits</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de microplaques Eon</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Cet équipement utilise le logiciel d’analyse de données Gen5.</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodécylsulfate de sodium</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>bleu de bromophénol</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage des protéines</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>Gel préfabriqué 12 % polyacrylamide</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de coloration rapide</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Plateau d’échantillons à lumière blanche</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp ;</td><td>Utilisé avec l’imageur gel dock EZ pour les taches de bleu coomassie</td></tr><tr><td>Échelle protéique</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC), dont on pense qu’elle survient à la suite de réponses auto-immunes ciblant la myéline. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal le plus courant de maladie auto-immune du SNC et est généralement induite par l’immunisation avec des peptides courts représentant des épitopes de cellules T CD4+ immunodominants des protéines de myéline. Cependant, les lymphocytes B reconnaissent directement les protéines non transformées, et l’immunisation avec un peptide court n’active pas les lymphocytes B qui reconnaissent la protéine native. Étant donné que de récents essais cliniques sur des thérapies d’appauvrissement des lymphocytes B dans le traitement de la SP ont suggéré que les lymphocytes B jouent un rôle dans l’apparition de maladies chez l’humain, il est urgent de disposer de modèles animaux intégrant la reconnaissance de l’auto-antigène par les lymphocytes B. À cette fin, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion contenant le domaine extracellulaire de la version murine de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) ainsi que des fusions N-terminales d’un His-tag à des fins de purification et de la protéine thiorédoxine pour améliorer la solubilité (MOG tag). Un site de clivage de la protéase du virus de gravure du tabac (TEV) a été incorporé pour permettre l’élimination de toutes les séquences de marqueur, ne laissant que le domaine extracellulaire pur MOG1-125. Ici, nous décrivons un protocole simple utilisant uniquement un équipement de laboratoire standard pour produire de grandes quantités demarqueur MOG pur ou MOG1-125. Ce protocole génère constamment plus de 200 mg de protéine demarquage MOG. L’immunisation avecl’étiquette MOG ou le MOG1-125 génère une réponse auto-immune qui comprend des lymphocytes B pathogènes qui reconnaissent le MOG natif de la souris.

Une fois la purification terminée, les échantillons prélevés dans les étapes 1.4, 2.1, 3.4, et le produit final de l&#39; étape 6.4 doivent être exécutés sur un gel de protéine (figure 3A). MOG tag devrait d&#39; abord apparaître comme une bande 31,86 kDa dans l&#39;échantillon T O / N, mais pas T 0, et devrait être le seul groupe dans le produit pur final. Pour tester si la balise protéine MOG a correctement repliée, la b...

Nous décrivons un protocole simple utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire de base pour générer et purifier de grandes quantités d’une protéine de fusion contenant de la myéline, de la glycoprotéine oligodendrocytaire de souris. Cette protéine peut être utilisée pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale entraînée par les lymphocytes T et B.

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

L'objectif général de ce protocole est de produire une protéine basée sur le domaine extracellulaire de la glycoprotéine myélinique des oligodendrocytes, ou MOG, qui peut être utilisée pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, ou EAE. Ce protocole permet à tout laboratoire de produire la protéine MOG afin de l'utiliser comme antigène pour induire l'EAE. Le principal avantage de ce protocole est qu'il ne nécessite pas d'équipement spécialisé pour la manipulation des protéines, mais utilise plutôt du matériel standard disponible dans presque tous les laboratoires d'immunologie.Eh bien, ce protocole a été optimisé pour la protéine MOG taguée à partir de la version murine ; il devrait fonctionner pour d'autres systèmes d'expression de la protéine MOG incorporant une étiquette his pour la purification. Ensemencer cinq millilitres de bouillon stérilisé avec le stock glycérolé BL21 MOG tag et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Ajouter 500 microlitres d'ampicilline à 100 milligrammes par millilitre à chacun des deux flacons de 500 millilitres contenant du bouillon LB stérile. Transférer un millilitre de la culture de nuit dans chacun des deux flacons de bouillon LB.Incuber à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant cinq heures ou jusqu'à une densité optique de 0,6. Une fois la densité cellulaire souhaitée atteinte, ajouter 0,5 millilitre de IPTG à une molaire dans chaque flacon de culture. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant quatre heures, puis à température ambiante et 75 tr/min toute la nuit.Répartir uniformément les cultures dans des bouteilles de 250 millilitres compatibles avec la centrifugation à haute vitesse et conserver les bouteilles sur de la glace à partir de ce moment. Récupérer les cellules bactériennes en culot à 22 000 ×g pendant 15 minutes à 4 °C. Resuspendre et combiner tous les culots bactériens dans un volume total de 30 millilitres de tampon de lyse.Transférez ce volume dans un tube de 50 millilitres environ, capable de centrifugation à grande vitesse. Placez ce tube dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant le temps d'incubation, agitez le tube deux fois pour resuspendre les cellules.Après l'incubation, transférez le tube sur de la glace et soniquez la solution à 20 kilohertz et une amplitude de 70 %, en impulsions de trois secondes activées suivies de trois secondes désactivées, pour cinq impulsions. Soniquez la solution pendant six séries complètes de cinq impulsions, en laissant la solution refroidir sur la glace entre chaque série. Ensuite, centrifugez la solution à 24 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis resuspendez le culot dans 30 millilitres de tampon A et incubez la solution à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Après l'incubation, soniquez à nouveau la solution sur glace comme précédemment, puis ajoutez 17,2 grammes de chlorure de guanidine HCl à la solution.Incuber l'échantillon sur de la glace pendant une heure afin de solubiliser la protéine marquée avec la balise MOG. Pour charger et équilibrer la résine au nickel, laver d'abord la résine en ajoutant 40 millilitres d'eau à chaque tube contenant la résine. Placer les tubes horizontalement sur un agitateur et les laisser agiter pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Une fois terminé, centrifuger les tubes à 4500 ×g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette afin de ne pas perturber le culot. Ensuite, ajouter 40 millilitres de tampon de charge à chaque tube.Transférer les tubes sur un agitateur et les laisser agiter pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius avant de procéder à une nouvelle centrifugation comme précédemment. Jeter le surnageant et ajouter 40 millilitres de tampon B dans les tubes. Transférer les tubes sur un agitateur et les laisser agiter pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avant de centrifuger à nouveau les tubes contenant la résine.Pour purifier la protéine marquée MOG, transférez le volume total de la protéine solubilisée dans le premier tube contenant la résine au nickel. Après homogénéisation, placez le tube horizontalement sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant une heure. Après centrifugation du tube à 4500 × g pendant huit minutes à quatre degrés Celsius, transférez ce surnageant dans le deuxième tube de résine au nickel et incubez comme précédemment.Entre-temps, resuspendre la résine au nickel dans le premier tube dans 40 millilitres de tampon d'élution et placer le tube horizontalement sur un agitateur à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avant de centrifuger comme précédemment. Transférer le surnageant contenant la protéine marquée MOG évoquée dans un flacon de 250 millilitres étiqueté « protéine purifiée marquée MOG ». Conserver ce flacon à quatre degrés Celsius.À chaque étape d'élution, rassemblez le surnageant obtenu dans ce flacon. Ajoutez 40 millilitres de tampon de désorption au nickel présent dans le premier tube et placez-le horizontalement sur un berceur pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Centrifugez le tube, jetez le surnageant et rechargez le nickel comme précédemment.Une fois terminé, passez au deuxième tube comme cela a été fait pour le premier tube. Un total de quatre cycles d'absorption de la protéine solubilisée sur la résine de nickel chargée et d'élution permettra de récupérer la majeure partie de la protéine. Coupez environ 30 centimètres de tube de dialyse en peau de serpent.Fixez une extrémité à l’aide d’un clamp hémostatique en repliant l’extrémité de la peau de serpent trois fois sur elle-même, puis en pinçant l’extrémité repliée avec le clamp. Remplissez la peau de serpent avec la protéine marquée MOG diluée. Ensuite, retirez toutes les bulles d’air de la peau de serpent en les chassant par l’extrémité ouverte.Enfin, sceller l'autre extrémité du tube à l'aide d'un deuxième clamp hémostatique verrouillable. Ensuite, remplir un grand seau avec un litre de tampon acétate 1x contenant quatre molarités de guanidine. Placer jusqu'à deux sections de tube de dialyse contenant la protéine MOG tag dans le seau.À l’aide d’un ruban adhésif, fixez les pinces hémostatiques sur le côté du seau afin de laisser suffisamment d’espace pour qu’un barreau d’agitation magnétique puisse tourner librement au fond. Placez le seau dans une pièce à quatre degrés Celsius sur une plaque chauffante munie d’un socle magnétique et mettez-la en marche à une vitesse de rotation lente. La dialyse nécessite au minimum trois jours pour réduire progressivement la quantité de guanidine dans le tampon.Vérifiez régulièrement que le tube est intact au départ et que les extrémités sont fermement scellées. Après quatre à cinq heures, ajoutez un litre de tampon acétate 1 x dans le seau de dialyse. Répétez ce processus toutes les quatre à cinq heures pendant un total de trois fois, pour obtenir au final quatre litres dans le seau.Après avoir jeté la moitié du tampon contenu dans le récipient, remplissez à nouveau avec un litre de tampon acétate 1 x et mettez en place les tubulures et le barreau d'agitation. Enfin, remplacez entièrement le volume de quatre litres dans le récipient par quatre litres de tampon acétate 1 x frais et laissez agiter pendant quatre à cinq heures. Pour de meilleurs résultats, effectuez cette étape le jour de la concentration des protéines.Pour concentrer la protéine marquée MOG, tapissez un récipient avec du papier d'aluminium et recouvrez le papier d'aluminium de PEG 3350 et de PEG 1000 en un rapport de un à un. Le PEG 3350 peut aider à prévenir l'agrégation des protéines pendant la concentration et constitue un cryoprotecteur efficace. Placez le tube en peau de serpent contenant la protéine marquée MOG sur le papier d'aluminium et recouvrez-le de PEG 8000.Laisser reposer à température ambiante et vérifier régulièrement le volume jusqu'à ce que celui-ci soit égal ou inférieur au volume final estimé. Si la membrane devient trop saturée en eau pendant le processus de concentration, préparer une nouvelle boîte avec du papier d'aluminium et du PEG. Prélever des échantillons de protéine à différents stades du protocole de purification ou les analyser sur un gel SDS-PAGE afin de confirmer leur pureté.Un gel représentatif est présenté, montrant la protéine MOG purifiée à 31,86 kilodaltons. Afin de vérifier que la protéine MOG s'est repliée correctement, la liaison de cette protéine à des cellules B CD19 positive, CD4 négative, provenant de ganglions lymphatiques de souris C57BL/6 de type sauvage ou de souris IgH MOG exprimant une chaîne lourde d'immunoglobuline spécifique de la protéine MOG, a été évaluée par cytométrie en flux. Ce protocole nécessite un minimum de 10 jours du début à la fin.Au cours de la procédure d'isolement, il est important de suivre la protéine et de se souvenir de ce qu'il faut conserver et de ce qu'il faut éliminer. N'oubliez pas que le sulfate de nickel hexahydraté utilisé pour charger la résine au nickel est extrêmement dangereux et que des précautions doivent être prises afin d'éviter toute inhalation ou tout contact avec la peau ou les yeux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de produire et de purifier votre propre protéine marquée MOG.Une fois purifiée, la protéine recombinante MOG peut être émulsionnée dans l'adjuvant de Freund complet et utilisée comme immunogène pour induire l'EAE. L'EAE induite par la protéine MOG permet d'étudier l'implication de divers types cellulaires, tels que les cellules CD4, CDAT ou B, dans l'auto-immunité du système nerveux central. Contrairement aux peptides courts, dont l'utilisation est restreinte par le CMH, un antigène protéique peut être utilisé chez n'importe quelle souche de souris.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique d’homogénéisation efficace pour générer une émulsion antigène-adjuvant afin d’induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) dans un modèle murin. L’émulsion contient un auto-antigène – la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) – dans la phase aqueuse, entourée d’une phase huileuse continue comprenant une bactérie pathogène inactivée. L’émulsion assure une libération prolongée d’antigènes pour une réponse immunitaire prolongée.

PRÉPARATION D’UNE ÉMULSION ADJUVANTE D’ANTIGÈNE POUR INDUIRE UNE ENCÉPHALOMYÉLITE AUTO-IMMUNE

La vidéo démontre l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin en injectant une combinaison de glycoprotéines oligodendrocytaires de myéline et de Mycobacterium tuberculosis inactivé. Le modèle permet aux chercheurs d’étudier les mécanismes de la maladie et de tester des interventions thérapeutiques.

Induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Cette vidéo montre la méthode d’induction expérimentale de l’encéphalomyélite auto-immune (EAE) en injectant des peptides dérivés de la myéline avec un adjuvant pour activer les lymphocytes T autoréactifs, qui migrent vers le cerveau. La toxine coquelucheuse est administrée pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant à ces lymphocytes T et à d’autres cellules immunitaires de pénétrer dans le cerveau. Ces cellules immunitaires provoquent une démyélinisation,...

Génération d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin

Dans cette vidéo, un modèle murin de sclérose en plaques est établi à l’aide d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). On injecte à la souris une émulsion contenant un peptide neuronal et un adjuvant, déclenchant une réponse immunitaire qui active les lymphocytes T autoréactifs. Ceci est suivi d’une injection de toxine coquelucheuse (PTX) pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, permettant aux lymphocytes T autoréactifs d’infiltrer le cerveau. Cette...

Source : Jain, R. W., et al. Production et purification simples et efficaces de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline de souris pour des études expérimentales sur l’encéphalomyélite auto-immune. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre l’isolement et la purification de MOGtag, une glycoprotéine oligodendrocytaire (MOG) de myéline recombinante utilisée dans les études expérimentales sur l’encéphalomyélite auto-immune (EAE). Le protocole implique la lyse bactérienne, la sonication, la...

Isolement et purification de glycoprotéines d’oligodendrocytes de myéline recombinante

Encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal établi de la sclérose en plaques. Souris C57BL / 6 sont immunisées avec la myéline oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), entraînant une paralysie flasque ascendante causée par des cellules immunitaires auto-réactifs dans le système nerveux central. Protocoles pour l'induction et la surveillance des maladies seront discutés.

Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induit encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) dans C57BL / 6

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Le présent protocole décrit l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin utilisant la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline et la surveillance du processus de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique. Les symptômes expérimentaux liés à l’encéphalomyélite auto-immune sont analysés à l’aide d’une micro-tomodensitométrie du fémur de souris et d’un test en plein champ pour évaluer le processus de la maladie de manière exhaustive.

Induction et divers indicateurs d’évaluation de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.

Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal de la sclérose en plaques (SEP), qui partage avec la maladie humaine une réponse auto-immune humorale robuste. Ici, nous rapportons un protocole ELISA simple et flexible pour quantifier les auto-anticorps dans le sérum de souris immunisées contre l’EAE.

Quantification des anticorps autoréactifs chez la souris lors d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Apprenez à produire et purifier la protéine MOG murine pour induire l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale. Cette méthode accessible utilise un équipement standard de laboratoire d'immunologie.

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études (Vidéo) | JoVE Journal

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

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