Name: ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: למדו שיטה פשוטה לייצור וטיהור חלבון MOG בעכברים לחקר אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית. פרוטוקול זה מאפשר ייצור נרחב באמצעות ציוד סטנדרטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהאגודה לטרשת נפוצה של קנדה. RWJ זכה בפרס הדוקטורט של אגודת וו לתואר שני בקנדה.

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+recognition+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+autoantigen+depends+on+immunization+with+protein+rather+than+short+peptide%2C+while+B+cell+invasion+of+the+CNS+in+autoimmunity+does+not%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not.</a> J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).</li>
<li>Barun, B., Bar-Or, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+sclerosis+with+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies.</a> Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).</li>
<li>Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+encephalitogenicity+of+recombinant+human+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).</li>
<li>Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+myelin+oligodendrocyte+glycoproteins+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+different+mechanisms+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+additives+on+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li>
<li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+Infiltration+of+the+Spinal+Cord+by+Non-Classically+Activated+B+Cells+is+Associated+with+Chronic+Disease+Course+in+a+Spontaneous+B+Cell-Dependent+Model+of+CNS+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease.</a> Front Immunol. 6, 470(2015).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S.Tag+fusion+system+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The S.Tag fusion system for protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).</li>
<li>Amor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epitopes+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+for+the+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL+and+Biozzi+AB%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice.</a> J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).</li>
<li>Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+profiling+of+tobacco+etch+virus+protease+using+a+novel+fluorescence-assisted+whole-cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).</li>
<li>Litzenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+producing+demyelinating+autoantibodies%3A+development+and+function+in+gene-targeted+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice.</a> J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+Escherichia+coli-expressed+human+thymosin-alpha1+using+affinity+chromatography+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography.</a> Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).</li>
<li>Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+protein+production+levels+in+Escherichia+coli+with+a+strong+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter.</a> FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).</li>
<li>Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+T+cells+exacerbates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+mouse%2C+but+not+rat%2C+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens.</a> J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Blommel, P. G., Fox, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הנה, יש לנו תיאר פרוטוקול לייצור חלבון תג MOG וכיצד ליצור MOG טהור 1-125 מן החלבון תג MOG. פרוטוקול זה מבוסס הוא על שיטות טיהור חלבונים מבוססות תקן שלו-תג, כמו גם פרוטוקול שתואר לעיל עבור הדור של חלבון MOG מבוסס מבוגר 15. למרות זאת הוא לא תיאר כאן, השימוש העיקרי של חלבון תג ש&quot;א היא לגרום EAE באמצעות חיסון עם אנטיגן חלבון. פרוטוקול המתאר כיצד EAE מושרה בעכברים, אשר תואם את חלבון תג MOG, ניתן למצוא התייחסות ...

טרשת נפוצה היא מחלה אנושית מאופיינת בדלקת כרונית ניווניות של מערכת העצבים של מערכת העצבים המרכזית אשר נחשב להיות מונע על ידי תגובה אוטואימונית מכוונת המיאלין. ההפסד של המיאלין אקסונים לאורך הזמן לגרום לירידה ההדרגתית של מנוע קוגניטיבית פונקצית 1. &quot;Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית&quot; הוא מונח כללי עבור במודלים של בעלי חיים של מחלה אוטואימונית מכוונת המיאלין במערכת העצבים המרכזית. כמו MS האדם, EAE מאופיין בדרך כלל על ידי חדירה של תאי מערכת החיסון של מערכת העצבים המרכזית, ובמקרים מסוימים, demyelination 2. עם זאת, את המידה שבה נתון כל מודל EAE דומה האדם MS בחלקו תלוי המין או זן בשימוש ועל המורכבות של תגובה אוטואימונית נגד המיאלין הבסיסי. אוטואימוניות נגד המיאלין יכולות להיגרם באופן ניסיוני במספר דרכים, אך השיטה הנפוצה ביותר בשימוש כיום היא לחסן עכברים עם פפטיד קצר של חומצות אמינו מחק את CD4 immunodominant <sעד&gt; + epitope תא T של חלבון המיאלין. זה מייצג את הדרישה המינימלית כדי לעורר תגובה פתוגניים. אולי הנפוצות ביותר של אלה הוא פפטיד חומצה 21 אמינו נגזר גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (ש&quot;א 35-55), אשר משמש כדי לגרום EAE ב C57Bl / 6 עכברים 3. עם זאת, עבור כמה מטרות ניסוי רצוי או אפילו צורך לחסן עם אנטיגנים חלבון גדולים ואכן ישנם מספר יתרונות לכך על חיסון עם פפטיד קצר. ראשית, בגלל הגבלת MHC, פפטידים קצרים הם בדרך כלל יעילים רק בטווח מצומצם מאוד של זנים, בעוד אנטיגנים חלבון גדולים המייצגים גם את החלבון השלם או תחום מסוים יכולים להיות מעובד בדרך כלל לצורך הציג זני עכבר מרובים טהור או אפילו במינים שונים 4. שנית, אנטיגן חלבון גדול מסוגל גרימת תגובה חיסונית מורכבת יותר שילוב סוגים נוספים של הלימפוציטים הכרת אנטיגן, ולא limitinהכרת אנטיגן גרם לתאי T מסוג CD4 +. לדוגמא, תאי B באמצעות קולטן תא B שלהם (BCR) אינטראקציה ישירה עם שלם ולא חלבון מעובד. אנחנו ואחרים הראו תאי B מופעל על ידי חיסון MOG 35-55 אינם מכירים MOG חלבון 5. מאחר ותאי B הודגמו לאחרונה לשחק תפקיד פתוגניים האדם MS 6, מודלים EAE המשלבים תאי B בפתולוגיה אוטואימוניות חשובים יותר ויותר. למרות היתרונות של שימוש אנטיגנים חלבון גדול יותר כדי לגרום EAE, נותרו כמה מקורות זמינים מסחרית עבור חלבונים כאלה. ואכן, בעוד פפטידים קצרים כמו MOG 35-55 יכול להיות מסונתזים מהר מאוד ובעלות נמוכה יחסית, האפשרויות המסחריות לחלבון MOG מוגבלות עלות משמעותית יותר לרכוש. עם זאת, ישנם מספר וקטורי ביטוי זמין עבור קבוצות מחקר כדי ליצור תחום תאי ש&quot;א (ש&quot;א 1-125) עצמם. However, כל מערכות הביטוי שזיהינו בספרות מבוססת על טכנולוגיות ישנות יותר כי הוחלפו מאז עם מערכות ביטוי יעילות יותר 7. יתר על כן, רובם מבוססים על MOG חולדה או אדם 8. עבור חקירות כמה אוטואימיוניות בעכברים, אנטיגן מבוסס על autoantigen העכבר MOG עדיף. לבסוף, כל חלבונים המבוססים MOG שזיהינו, או המסחריים או כמו וקטורי ביטוי, הם חלבוני היתוך המכילים חומצות אמינו נוספות לבסיס MOG 1-125. אלה כוללים תג לטיהור ובדרך כלל רצפים אחרים גם כן, רבים מהם עם פונקציה לא הצלחנו לזהות. כדי לטפל במגבלות אלה, שעוררנו חלבון היתוך רומן המבוסס על תחום MOG העכבר התאי התמזג תג המכיל thioredoxin כדי להילחם insolubility הידוע של MOG חלבון 5. רצף תג גם מכיל רצף 6xHis לטיהור וכן CLE פרוטאז TEVavage אתר המאפשר עבור הסרה מלאה של כל רצפי תג, אם תרצה בכך. זוהי השיטה היחידה שאנו מודעים לייצר חלבון MOG 1-125 טהור. כדי להקל על ייצור של כמויות גדולות של חלבון, רצף MOG 1-125 היה קודון אופטימיזציה עבור ביטוי חיידקים חלבון היתוך תג MOG הוכנס למערכת הביטוי PET-32. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הפרוטוקול לייצר ולטהר חלבון תג MOG, וטהור MOG 1-125, תוך שימוש בציוד שאינו מתמחה לרשות ברוב מעבדות אימונולוגיה.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot מעבדה</td><td></td><td>חיידקים אלה נדרשים לייצור חלבון MOGtag. מלאי גליצרול של חיידקים אלה זמין לפי בקשה.</td></tr><tr><td>טחנת מרק LB</td><td>ביושופ</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Reconsititize את האבקה ל-50% אתנול / 50% H2O ב-100 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>החזר את האבקה ל-H2O ב-1M ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ליזוזים ביצת תרנגולת</td><td>ביושופ</td><td>LYS702.10</td><td>להרכיב מחדש ב-H2O ב-50 מ"ג/מ"ל ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיי</td><td>מלח חוצץ פוספט</td><td>20012-027</td> אין <td>צורך במי מלח חוצץ פוספט מסחריים, כל מי מלח חוצץ פוספט מתוצרת מעבדה סטנדרטית מספיק.</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>ביושופ</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>האיכות חייבת להיות גבוהה מ-98% טוהר.</td></tr><tr><td>0.5 M</td><td>EDTA bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>ניקל (II) סולפט</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>שרף הקישור שלו</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>אחסן ב-20% אתנול 80% H2O ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>אלכוהול מסחרי אתנול נטול מים</td><td></td><td>P016EAAN</td><td>לדלל במים לפי הצורך.</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט טריהידרט</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין סטנדרטי</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת חלבון Bio-rad תרכיז מגיב צבע</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, מלח דיסודיום דיהידרט</td><td>פישר מדעי</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW צינורות דיאליזה מעור נחש</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>אין לטפל במגיב זה מחוץ למכסה אדים.</td></tr><tr><td>AcTEV פרוטאז</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>ייצור פרוטאז TEV משלך יכול להתבצע באמצעות (https://www.addgene.org/8827/) ולטהר אותו כמו בהתייחסות 17</td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 3350</td><td>ביושופ</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 8000</td><td>ביושופ</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp שטוח תחתון 96 באר צלחת</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon microplate spectrometer</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>ציוד זה משתמש בתוכנת ניתוח הנתונים Gen5.</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>ביושופ</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>ביושופ</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>ביושופ</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>עמודות התפלת חלבון</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>ביושופ</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>טרומי 12% פוליאקרילאמיד ג'ל</td><td>ביו-ראד</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כתמים מהיר</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל עגינה EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>מגש דגימת אור לבן</td><td>ביו-ראד</td><td>1708272&nbsp;</td><td>משמש יחד עם מצלמת EZ של תחנת ג'ל לכתמים כחולים של coomassie</td></tr><tr><td>סולם חלבונים</td><td>ביו-ראד</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות encephalomyelitis מחקרים

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית כרונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS), הנחשבת כתוצאה מתגובות אוטואימוניות המכוונות למיאלין. דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא המודל החייתי הנפוץ ביותר של מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית, והיא נגרמת בדרך כלל באמצעות חיסון עם פפטידים קצרים המייצגים אפיטופים של תאי CD4+ T של חלבוני מיאלין. עם זאת, תאי B מזהים חלבון לא מעובד ישירות, וחיסון עם פפטיד קצר אינו מפעיל תאי B המזהים את החלבון המקומי. מכיוון שניסויים קליניים אחרונים של טיפולים מדלדלי תאי B בטרשת נפוצה הציעו תפקיד לתאי B בהנעת מחלות בבני אדם, יש צורך דחוף במודלים של בעלי חיים המשלבים זיהוי תאי B של אוטואנטיגן. לשם כך, יצרנו חלבון היתוך חדש המכיל את התחום החוץ-תאי של גרסת העכבר של מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) וכן היתוך N-terminal של His-tag למטרות טיהור וחלבון תיורדוקסין לשיפור המסיסות (תג OG). אתר מחשוף פרוטאז של וירוס תחריט טבק (TEV) שולב כדי לאפשר הסרה של כל רצפי התגים, והשאיר רק את התחום החוץ-תאי הטהור MOG1-125. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט המשתמש רק בציוד מעבדה סטנדרטי לייצור כמויות גדולות שלתג MOG טהור או MOG1-125. פרוטוקול זה מייצר באופן עקבי למעלה מ-200 מ"ג של חלבוןתג MOG. חיסון עםתג MOG או MOG1-125 מייצר תגובה אוטואימונית הכוללת תאי B פתוגניים המזהים את ה-MOG המקורי של העכבר.

לאחר הטיהור הושלמה, דגימות שנאספו צעדים 1.4, 2.1, 3.4, ואת המוצר הסופי משלב 6.4 צריך לרוץ על ג&#39;ל חלבון (איור 3 א). תג MOG צריך להופיע תחילה כלהקת 31.86 kDa במדגם T O / N, אך לא T 0, וצריך להיות בלהקה היחידה במוצר הטהור הסופי. כדי לבדוק אם חלבון תג MOG התקפל כראוי, חלבון תג MOG יכול לשמש תווית תאי MOG-חלבון מסוימים B על ידי FACS. על ידי לימפוציטים תיוג עכבר עם דילול 1: 1,000...

אנו מתארים פרוטוקול פשוט המשתמש בציוד מעבדה בסיסי בלבד כדי לייצר ולטהר כמויות גדולות של חלבון היתוך המכיל גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים של עכבר. ניתן להשתמש בחלבון זה כדי לגרום לדלקת מוח אוטואימונית ניסיונית המונעת על ידי תאי T ו-B כאחד.

ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להפיק חלבון המבוסס על הדומיין החוץ-תאי של הגליקופרוטאין של מיאלין באוליגודנדרוციטים, או MOG, אשר ניתן להשתמש בו כדי להשרות אנצפלומיליטיס אוטואימונית ניסויית (EAE). פרוטוקול זה מאפשר לכל מעבדה להפיק חלבון MOG לצורך שימושו כאנטיגן להשראת EAE. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה הוא שאינו נסמך על ציוד ייעודי לטיפול בחלבונים, אלא ניתן להשתמש בציוד סטנדרטי הנמצא כמעט בכל מעבדה לאימונולוגיה.פרוטוקול זה עובד עבור חלבון MOG tag המבוסס על הגרסה של העכבר, והוא אמור לעבוד עבור מערכות ביטוי אחרות של חלבון MOG המשלבות hestate לניקוי. זרע חמישה מיליליטר של מרק סטרילי עם מלאי גליסרול של BL 21 MOG tag והדגר אותו למשך לילה ב-37 degrees Celsius וב-200 RPM. הוסף 500 microlitres של 100 milligram per milliliter ampicillin לכל אחד משני הבקראקים בנפח 500 milliliter המכילים 500 milliliters של LB סטרילי. העבר מיליליטר אחד של תרבית הלילה לכל אחד משני הבקראקים של מרק LB.דגרו ב-37 °C וב-200 RPM למשך חמש שעות או עד להגעה לצפיפות אופטית של 0.6. לאחר שהושגה צפיפות התאים הרצויה, הוסיפו 0.5 milliliters של IPTG בריכוז one molar לכל בקבוק תרבית. דגרו את הבקבוק ב-37 °C וב-200 RPM למשך ארבע שעות, ולאחר מכן בטמפרטורת החדר וב-75 RPM למשך הלילה.חלק את התרביות באופן שווה בין בקבוקים בני 250 milliliter המתאימים לסרטוריגציה במהירות גבוהה, ושמור את הבקבוקים על קרח מהשלב הזה ואילך. שקע את התאי הבקטריאליים ב-22,000 times g למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. השב ואחד את כל המשקעים הבקטריאליים בנפח כולל של 30 milliliters של בופר ליזיס.העבירו נפח זה למבחנה בעלת תחתית עגולה בנפח 50 מיליליטר המסוגלת לעמוד בצנטריפוגה במהירות גבוהה. הניחו את המבחנה במסבב מים בטמפרטורה של 30 degree Celsius למשך 30 דקות. במהלך זמן הדגירה, נערו את המבחנה פעמיים כדי להשעות שוב את התאים.לאחר הדגירה, העבירו את המבחנה לקרח ובצעו סוניקציה לתמיסה בתדר של 20 kilohertz ובאמפליטודה של 70%, בפולסים של שלוש שניות פעילות ושלוש שניות מנוחה, למשך חמישה פולסים; בצעו סוניקציה לתמיסה עבור שישה סבבים כוללים של חמישה פולסים, תוך מתן אפשרות לתמיסה להתקרר בקרח בין הסבבים. לאחר מכן, סבבו את התמיסה בצנטריפוגה ב-24, 000 times g למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, ולאחר מכן השעיקו שוב את המשקע ב-30 milliliters של בופר A והגדירו דגירה לתמיסה בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, בצעו סוניקציה לתמיסה על קרח כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן הוסיפו לתמיסה 17.2 grams של guanidine HCl.יש להדגיר את הדגימה על קרח למשך שעה אחת כדי להמיס את חלבון תג MOG. כדי להטעין ולהשוות את שרף הניקל, שטפו תחילה את השרף על ידי הוספת 40 milliliters של מים לכל מבחנה המכילה שרף. הניחו את המבחנות בצורה אופקית על רוקר והניחו להן להתערבל במשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius.עם הסיום, סובב את המבחנות בצנטריפוגה במהירות של 4500 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant באמצעות פיפט כדי להימנע מהפרעה למשקע. לאחר מכן, הוסף 40 milliliters של charge buffer לכל מבחנה.העבירו את המבחנות למכשיר ערבוב (rocker) והניחו להן להתערבב במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C לפני ביצוע סבב צנטריפוגה נוסף כפי שנעשה קודם לכן. הסתילו את העלון (supernatant) והוסיפו למבחנות 40 milliliters של בופר B. העבירו את המבחנות למכשיר ערבוב והניחו להן להתערבב במשך חמש דקות בטמפרטורה של 4°C לפני צנטריפוגה נוספת של המבחנות עם הסורבן (resin).כדי לטהר את חלבון תג ה-MOG, העבירו את כל נפח החלבון המומס לשפרוּר הראשון המכיל שרף ניקל. לאחר הערבוב, הניחו את השפרוּר באופן אופקי על מכשיר נדנוד (rocker) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר סרכוז של השפרוּר ב-4500 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הסוپرנאטנט לשפרוּר השני של שרף הניקל והדגירו כפי שנעשה קודם לכן.בינתיים, השהו שוב את שרף הניקל במבחנה הראשונה ב-40 milliliters של evolution buffer והניחו את המבחנה באופן אופקי על rocker בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לפני הצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן. העבירו את supernatant המכיל את חלבון ה-MOG tag המוזכר לבקבוק של 250 milliliter המסומן כ-purified MOG tagged protein. שמרו בקבוק זה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בכל שלב של אלוציה, רכז את העילאי שמתקבל בבקבוק זה. הוסף 40 מיליליטר של strip buffer לניקל שנמצא במבחנה הראשונה והנח אותה בצורה אופקית על רוקר למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. סבב את המבחנה בצנטריפוגה, השלך את העילאי וטען מחדש את הניקל כפי שנעשה קודם לכן.עם סיום השלב, התקדמו לטיפול במבחנה השנייה כפי שנעשה במבחנה הראשונה. סך של ארבעה סבבים של ספיחה של החלבון המומס על שרף ניקל טעון ואליוציה יאפשרו שחזור של מרבית החלבון. גזרו מקטע של כ-30 סנטימטרים של צינור דיאליזה מסוג snake skin.אבטחו קצה אחד בעזרת פינצטה המוסטטית (hemostat) על ידי קיפול קצה עור הנחש שלוש פעמים וכליבת הקצה המקופל בעזרת הפינצטה. מלאו את עור הנחש בחלבון MOG tag מדולל. לאחר מכן, הוציאו בועות אוויר מעור הנחש על ידי דחיפתן החוצה מהקצה הפתוח.לבסוף, אטמו את הקצה השני של הפרוטור בעזרת פלייר המסטטי (locking hemostat) שני. לאחר מכן, מלאו דלי גדול בליטר אחד של בופר אצטט בריכוז 1x עם גואנידין בריכוז 4M. הכניסו לדלי עד שני קטעים של פרוטור דיאליזה המכילים חלבון MOG tag.הדביקו את התפסנים (hemostats) לדופן הדלי באמצעות סרט דביק, כדי לפנות מקום למגנט של מערבל מגנטי להסתובב ללא הפרעה בתחתית. הניחו את הדלי בחדר בטמפרטורה של 4°C על גבי פלטה מגנטית והפעילו אותה בקצב סיבוב איטי. הדיאליזה אורכת שלושה ימים לפחות כדי להפחית בהדרגה את כמות הגואנידין בבופר.יש לבדוק באופן סדיר שהשפופרת נשארת שלמה ושהקצוות סגורים היטב. לאחר ארבע עד חמש שעות, יש להוסיף ליטר אחד של acetate buffer בריכוז 1x לדלי הדיאליזה. חזור על תהליך זה כל ארבע עד חמש שעות, שלוש פעמים בסך הכל, כך שיהיו בדלי ארבעה ליטרים בסך הכל.לאחר השלכת מחצית מהבופר מהמיכל, מלאו שוב ליטר אחד של בופר אצטט בריכוז one x והגדירו את הצינורות ואת מוט הבחישה. לבסוף, החליפו את כל נפח ארבעת הליטרים במיכל בארבעה ליטרים של בופר אצטט טרי בריכוז one x והניחו לבחישה למשך ארבע עד חמש שעות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצעו שלב זה ביום ריכוז החלבון.כדי לרכז את חלבון ה-MOG tag, רפדו עיפרון בנייר אלומינום וכסו את נייר האלומינום ב-PEG 3350 וב-PEG 1000 ביחס של אחד לאחד. PEG 3350 יכול לסייע במניעת אגרגציה של חלבונים במהלך הריכוז והוא משמש כחומר קריו-שימור יעיל. הניחו את צינור עור הנחש המכיל את חלבון ה-MOG tag על גבי נייר האלומינום וכסו ב-PEG 8000.השאירו זאת בטמפרטורת החדר ובדקו את הנפח באופן קבוע עד שהנפח יהיה שווה לנפח הסופי המוערך או נמוך ממנו. אם העט הופך לרווי מדי במים במהלך תהליך הריכוז, הכינו תבנית חדשה עם נייר אלומיניום ו-PEG. יש לדגום חלבונים לאורך פרוטוקול הטיהור או להריץ אותם על ג'ל SDS page כדי לאשר את רמת הטוהר.מוצג ג'ל מייצג המראה את תג MOG המזוכה מאוד במשקל של 31.86 kilodaltons. כדי לוודא שחלבון תג MOG התקפל כהלכה, נבחנה באמצעות ציטומטריה של זרימה הקישור של חלבון תג MOG לתשעת תאי B, חיוביים ל-CD19 ושליליים ל-CD4, מקשרי לימפה של עכברי C57 black six מסוג wild type או עכברי IgH MOG המבטאים שרשרת כבדה של אימונוגלובולין הספציפית לחלבון MOG. פרוטוקול זה דורש מינימום של 10 ימים מההתחלה ועד הסוף.במהלך הליך הבידוד חשוב לעקוב אחר החלבון ולזכור מה יש לשמור ומה יש להשליך. זכרו כי השימוש בניקל סולפט הקסאהידראט, המשמש לטעינת שרף הניקל, הוא מסוכן ביותר ויש לנקוט באמצעי זהירות למניעת שאיפה או מגע עם העור או העיניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק ולטהר את חלבון ה-MOG tag שלכם.לאחר הטהרה, ניתן להמריץ את חלבון התג MOG באמולסיה בתוך עזר (adjuvant) מלא של פרוינד ולהשתמש בו כחיסון להשראת EAE. EAE המושרה על ידי תג MOG יכול לשמש למחקר של מעורבותן של סוגי תאים מרובים, כגון תאי CD4 או תאי CDAT או תאי B, באוטו-אימוניות של מערכת העצבים המרכזית. בניגוד לפפטיד קצר, המוגבל ל-MHC, ניתן להשתמש באנטיגן חלבוני בכל זן של עכברים.

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקת הומוגניזציה יעילה ליצירת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) במודל מורין. התחליב מכיל אנטיגן עצמי - גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) - בשלב המים, מוקף בשלב שמן רציף הכולל חיידק פתוגני בלתי פעיל. האמולסיה מבטיחה שחרור מתמשך של אנטיגנים לתגובה חיסונית ממושכת.

הכנת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי להשראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית

הסרטון מדגים השראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי על ידי הזרקת שילוב של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים מיאלין ושחפת מיקובקטריום בלתי פעילה. המודל מאפשר לחוקרים לחקור מנגנוני מחלה ולבחון התערבויות טיפוליות.

אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

סרטון זה מדגים את השיטה של גרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) על ידי הזרקת אדג'ובנט לפפטידים שמקורם במיאלין כדי להפעיל תאי T אוטו-ריאקטיביים, הנודדים למוח. רעלן השעלת ניתן כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, ומאפשר לתאי T אלה ולתאי חיסון אחרים להיכנס למוח. תאים חיסוניים אלה גורמים לדמיאלינציה, מה שמוביל לפגיעה בהולכה עצבית ובהתפתחות של EAE.

יצירת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

בסרטון זה, מודל עכבר של טרשת נפוצה נקבע באמצעות אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). העכבר מוזרק עם תחליב המכיל פפטיד עצבי ואדג'ובנט, המפעיל תגובה חיסונית המפעילה תאי T אוטוריאקטיביים. לאחר מכן מתבצעת הזרקה של רעלן שעלת (PTX) כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, מה שמאפשר לתאי T האוטו-תגובתיים לחדור למוח. חדירה זו יוזמת מפל איתות שבסופו של דבר גורם לנזק למיאלין, המחקה את המצב הדה-מיאלינציה של טרשת נפוצה.

מקור: Jain, R. W., et al. ייצור וטיהור פשוט ויעיל של גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים של מיאלין עכבר למחקרי אנצפלומיאליטיס אוטואימוניים ניסיוניים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את הבידוד והטיהור של MOGtag, גליקופרוטאין מיאלין רקומביננטי אוליגודנדרוציטים (MOG) המשמש במחקרי דלקת מוח אוטואימונית ניסיוניים (EAE). הפרוטוקול כולל ליזה חיידקית, סוניקציה, צנטריפוגה וכרומטוגרפיה של זיקה לניקל כדי להשיג MOGtag מטוהר. חלבון זה מאפשר מחקר אוטואימוני בתיווך תאי B במודלים של טרשת נפוצה.

בידוד וטיהור של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים רקומביננטיים של מיאלין

Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסויי (EAE) הוא מודל חיה הוקם בטרשת נפוצה. C57BL / 6 עכברים שחוסנו עם גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין פפטיד (MOG) 35-55 (ש"א 35-55), וכתוצאה משיתוק רפה עולה שנגרם על ידי תאי מערכת החיסון אוטוריאקטיבים במערכת העצבים המרכזית. פרוטוקולים לזירוז מחלה וניטור יידונו.

המיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) מושרה ניסויי אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) בעכברים C57BL / 6

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי המשתמש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים וניטור תהליך המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית. תסמינים אוטואימוניים ניסיוניים הקשורים לאנצפלומיאליטיס מנותחים באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של עצם הירך ובדיקת שדה פתוח כדי להעריך את תהליך המחלה באופן מקיף.

אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.

שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל בעל חיים של טרשת נפוצה (MS), אשר חולק עם המחלה האנושית תגובה אוטואימונית הומורלית חזקה. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול ELISA פשוט וגמיש לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברים מחוסנים EAE.

כימות נוגדנים אוטוריאקטיביים בעכברים על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

למדו שיטה פשוטה לייצור וטיהור חלבון MOG בעכברים לחקר אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית. פרוטוקול זה מאפשר ייצור נרחב באמצעות ציוד סטנדרטי.

ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים

גלה סרטונים נוספים