Détermination de la surface de la cellule relative et d'expression totale de Recombinant Canaux ioniques par cytométrie en flux

L’objectif global de cette méthode est de quantifier l’expression à la surface cellulaire des protéines membranaires à l’aide d’un test espacé par fluorescence. Le principal avantage de cette technique est que les tests de cytométrie en flux fournissent des points finaux quantifiables sur de grands volumes de cellules vivantes en une seule expérience. Les implications de cette technique s’étendent vers un diagnostic et un traitement des arythmies ventriculaires cardiaques car ces pathologies sont souvent associées à des mutations génétiques qui provoquent des défauts dans le trafic des canaux ioniques cardiaques.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal à identifier un site d’insertion externe approprié pour l’épitope qui ne nuit pas à leur fonction protéique et ne génère pas un signal fluorescent puissant en présence de l’anticorps conjugué. Benoite Bourdin, un assistant de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour commencer, marquez doublement les constructions d’ADN avec mCherry à l’extrémité C-terminale intracellulaire.

Exprimez également un épitope d’hemmagglutinine face à la face cellulaire, qui peut être mesuré à l’aide d’un anticorps de fluorescence pour estimer l’expression de surface cellulaire des protéines membranaires. Ensuite, cultivez une plaque de cellules TSA201 en utilisant des techniques standard jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence. Pour chaque échantillon, préparez les réactifs de transfection dans deux tubes.

Préparez un tube de 1,5 millilitre avec quatre microgrammes d’ADN et 250 microlitres de milieu sérique réduit, et un deuxième tube avec 10 microlitres de réactif de transfection médié par les liposomes et 250 microlitres de milieu de culture sérique réduit. Mélangez délicatement les deux tubes et incubez-les pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, combinez doucement le contenu du tube un et du tube deux et incubez les complexes d’ADN liposomique pendant 20 minutes à température ambiante.

Ajoutez les complexes aux cellules cultivées et secouez doucement la boîte de culture. Remettez le plat à 37 degrés Celsius et sous une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % pendant 24 heures. 24 heures après l’ajout du réactif de transfection, retirez le milieu de la boîte de culture et lavez soigneusement les cellules avec 400 microlitres de trypsine-EDTA préchauffée.

Ensuite, ajoutez 400 microlitres de trypsine-EDTA et incubez la boîte pendant cinq minutes pour permettre aux cellules de se détacher de la boîte. Une fois détaché, arrêtez la digestion de l’enzyme en ajoutant un millilitre de milieu de culture froid sans pénicilline ni streptomycine aux cellules. Pipetez doucement le milieu sur la plaque quatre à cinq fois pour laver toutes les cellules de la surface.

Ensuite, collectez les cellules dans des tubes stériles de 1,5 millilitre et placez-les immédiatement sur de la glace. Pour les étapes suivantes, utilisez une solution glacée et maintenez les cellules à quatre degrés pour éviter l’internalisation de l’épitope de surface. Diminuez également l’exposition des cellules à la lumière afin de limiter le photoblanchiment du signal fluorescent.

Ensuite, centrifugez les tubes pour granuler les cellules. Ensuite, aspirez et jetez soigneusement le surnageant obtenu. Remettez le granulé en suspension pour préparer une suspension à cellule unique en utilisant un millilitre de PBS.

Ensuite, centrifugez brièvement les tubes. Granulez et remettez les cellules en suspension une fois de plus afin d’éliminer complètement le milieu de culture. Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans 600 microlitres de PBS.

Mesurez la concentration cellulaire et ajustez-la à au moins trois millions de cellules par millilitre. Ensuite, divisez les cellules dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Assurez-vous d’inclure les contrôles appropriés pour distinguer la coloration spécifique de la coloration non spécifique, ainsi que pour la coloration extracellulaire et également pour la coloration intracellulaire.

L’anticorps de contrôle isotopique aidera à évaluer le niveau de coloration de fond et devrait correspondre à l’anticorps primaire, à l’isotope de bon augure et au fluorophore. Il est important d’utiliser l’anticorps isotopique de contrôle et l’anticorps fluorescent à la même concentration. Pour estimer l’expression à la surface cellulaire des protéines membranaires, il suffit d’étiqueter l’épitope HA extracellulaire à l’aide d’un anticorps conjugué à la lumière fluorescente.

Ensuite, ajoutez un anticorps monoclonal anti-HA conjugué à la FITC à cinq microgrammes par millilitre dans le tube. Vortex les cellules brièvement, puis incubez-les sur une plate-forme à bascule dans l’obscurité. Sortez les cellules de l’obscurité et ajoutez 900 microlitres de PBS.

Ensuite, centrifugez le tube pour granuler les cellules et aspirez le surnageant. Ensuite, lavez les cellules en remettant la pastille en suspension dans un millilitre de PBS et en faisant brièvement tourbillonner les cellules. Ensuite, répétez l’étape de centrifugation pour granuler à nouveau les cellules.

Répétez cette étape de lavage trois fois au total pour éliminer tout anticorps non lié. Après le lavage final, remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS et transférez la suspension unicellulaire dans un tube de cytométrie en flux de cinq millilitres. Gardez les cellules dans l’obscurité à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que l’échantillon soit analysé.

Pour estimer l’expression intracellulaire de la protéine totale, on marque ensuite les cellules perméabilisées. Ceci est accompli en utilisant un protocole similaire au marquage extracellulaire, mais avec l’ajout d’un tampon de perméabilisation cellulaire à base de saponine. Granulez les cellules, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de solution de perméabilisation de fixation directement à partir du stock préparé.

Incuber les cellules dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation fraîchement préparé et vortex brièvement les cellules. Ensuite, granulez les cellules et lavez-les deux fois de plus à l’aide du tampon de lavage par perméabilisation.

Ensuite, ajoutez l’anticorps monoclonal anti-HA conjugué à FITC à 5 microgrammes par millilitre et 100 microlitres de tampon de lavage par perméabilisation. Brièvement, le vortex les cellules et incubez les cellules dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage par perméabilisation.

Granulez les cellules et lavez-les trois fois dans 100 microlitres du même tampon que celui indiqué précédemment. Après le lavage final, remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS et transférez la suspension unicellulaire dans un tube de cytométrie en flux de cinq millilitres. Faites passer les cellules non perméabilisées et perméabilisées dans le cytomètre en flux le même jour.

Pour commencer, lancez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et importez les fichiers fcs créés lors de la cytométrie en flux. Cliquez sur le premier échantillon et lancez le processus de contrôle dans le tracé de la dispersion latérale par rapport à la diffusion directe. Ensuite, dessinez la porte P1 à l’aide de l’icône en forme d’ellipse autour des cellules vivantes pour éliminer les débris, les cellules mortes ou les agrégats.

Ensuite, dessinez le tracé du contour des paramètres du tube du mCherry en fonction de l’intensité de fluorescence FITC. Placez la porte P2 autour des cellules positives FITC et mCherry et la porte P3 autour de la population cellulaire négative à fluorescence. Ensuite, sélectionnez les points de contrôle P2 et P3 et cliquez sur l’icône Ajouter des statistiques dans la fenêtre de l’espace de travail d’origine.

Cliquez sur compte, puis sur moyenne. Enfin, appliquez les paramètres et les statistiques des portes à tous les échantillons sondés par le cytomètre. Ce protocole a été utilisé pour caractériser le rôle de la N-glycosylation sur l’expression totale et en surface cellulaire de CaV Alpha 2 Delta 1 dans les cellules TSA201.

Pour accéder à l’expression des protéines de surface cellulaire, l’HA a été mesurée sur des cellules non perméabilisées dont les sites de N-glycosylation étaient perturbés sur quatre sites, 16 sites ou aucun site. Les niveaux de FITC étaient forts dans le type sauvage et les cellules avec des cellules N-glycosylation perturbées à quatre endroits, mais seuls des niveaux de fond ont été trouvés dans les cellules avec 16 emplacements perturbés. Pour les cellules perméabilisées, la fluorescence FITC a augmenté pour toutes les conditions, indiquant que toutes les protéines CaV Alpha 2 Delta 1 transfectées, marquées HA, ont été colorées et détectées par l’anticorps anti HA FITC.

De plus, les niveaux de fluorescence de mCherry étaient similaires pour les cellules perméabilisées et non perméabilisées, ce qui signifie que la perméabilisation ne modifie pas le signal mCherry relatif. Des tests effectués après la perméabilisation cellulaire ont montré que l’expression totale des protéines pour les cellules avec 16 localisations perturbées était également significativement diminuée, qu’elle soit déduite de la fluorescence FITC dans les cellules perméabilisées ou de la fluorescence constitutive mCherry mesurée dans les cellules non perméabilisées et dans les cellules perméabilisées. En plus de cette procédure, des enregistrements physiologiques supplémentaires peuvent être effectués afin de corréler l’expression et la fonction des canaux ioniques.

Cette technique ouvre également la voie aux chercheurs dans le domaine médical pour étudier l’impact des mutations génétiques, des modifications post-traductionnelles, des microARN, des petites GTPases et le rôle des chaperons dans le trafic des protéines membranaires exprimées dans les cellules recombinantes ou natives. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la transfection de l’ADN dans les cellules recombinantes, de colorer le NTAC et les cellules perméabilisées, ainsi que d’effectuer l’analyse des données sur les échantillons. N’oubliez pas que travailler avec des cellules vivantes nécessite des précautions telles que travailler dans le liquide hélaminal pour la transfixion et porter des gants lors de la manipulation de produits chimiques.