Name: Haute teneur en graisses Alimentation Paradigm pour larvaire Zebrafish: Alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Découvrez une méthode d'alimentation lipidique pour larves de zebrafish avec imagerie en direct et quantification de l'ingestion. Cette technique permet d'étudier le métabolisme des lipides alimentaires et la régulation de l'appétit chez Danio rerio.

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Les auteurs remercient Meng-Chieh Shen pour les images, Jennifer Anderson pour ses commentaires utiles sur le manuscrit et les membres du laboratoire Farber pour leur contribution au développement de ces techniques. Cette étude a été financée par les RO1DK093399 de prix NIDDK-NIH (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium : PI Stephen Ekker et Co-PI S.A.F), et F32DK096786 (J.P.O.). Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des NIH. Un soutien supplémentaire a été fourni par la G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation au laboratoire de la S.A.F. et à la dotation de la Carnegie Institution for Science.

Ces protocoles ont été approuvés par la Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care et utilisation Comité (protocole no. 139). 1. Préparation d&#39;un animal <ol><li> Maintenir les adultes et les larves à 28 ° C sur un 14 heures: la lumière de 10 h: cycle d&#39;obscurité. Nourrir les adultes deux fois par jour avec Artemia shell libre (decapsulated, non-éclosion, à partir de 14 dpf) et micropellets commerciales. </li><li> Ces protocoles sont optimisés pour l&#39;utilisation des larves de 6-7 dpf recueillies par la reproduction naturelle du fond de l&#39;AB. Les protocoles peuvent être modifiés pour les larves d&#39;autres âges et origines. Ne pas fournir la nourriture exogène avant le 6 dpf. </li><li> Anesthetize larves avec Tricaine dans les milieux de l&#39;embryon (EM) (4,2 ml de 4 mg / Tricaine ml par 100 ml EM) à la température ambiante (RT). </li></ol> 2. Préparation de Lipid riche Egg Yolk RSS <ol><li> Préparer et stocker les jaunes d&#39;œufs de poulet. Séparez le jaune et le blanc de 12 œufs de poule. Réunir les jaunes, aliquote de 1 ml dans 1,5tubes ml, et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à 1 an (12 jaunes feront ~ 80 aliquotes). Rassembler les blancs, stocker et utiliser comme un aliment riche en protéines pauvre en lipides. </li><li> Préparer fluorescent analogique (s) lipide à ajouter à la charge de jaune d&#39;oeuf, si désiré. <ol><li> Suspendre le acheté, poudre analogue lipidique fluorescent dans 100% d&#39;éthanol ou 100% de chloroforme à 0,1 pg / pl (voir note suivante discuter des solvants), aliquote dans des tubes de verre opaque, sceller avec du parafilm, et stocker selon les instructions du fabricant. En raison de l&#39;évaporation rapide des solvants organiques ne pas utiliser des volumes de moins de ~ 400 pi pour le stockage à long terme aliquotes. Remarque: Si l&#39;analogue de lipide est mis en suspension dans de l&#39; éthanol, des volumes importants de l&#39;analogue de lipide sera utilisé car il sèche rapidement sous N2 de chloroforme. Si l&#39;analogue de lipide est mis en suspension dans de l&#39;éthanol, il n&#39;a pas besoin d&#39;être séché et remis en suspension avant de l&#39;ajouter à la charge des liposomes à l&#39;étape 2.2.4, mais la concentration totale d&#39;éthanol ne doit pas dépasser 0.1% dans l&#39;alimentation du liposome pour éviter les effets physiologiques potentiellement confondants de l&#39;éthanol. </li><li> Fluorescentes pour les analogues d&#39;acides gras: préparer un volume total de 20 ml de 5% de jaune d&#39;oeuf dans l&#39;émulsion EM. A partir de ce préparer aliquotes de 5 ml avec une concentration finale de 6,4 pM de 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacène (BODIPY C 16) pour l&#39; imagerie confocale en temps réel et la consommation alimentaire des dosages ou 1 pg / ml BODIPY C 12 pour l&#39; imagerie stéréoscopique. Transférer la quantité désirée de l&#39;analogue de lipide fluorescent dans un tube en plastique de 1,5 ml. Sécher le lipide sous un courant de N 2, en prenant soin de ne pas souffler le lipide du tube. </li><li> Immédiatement, remettre en suspension dans 5 ul éthanol à 100% par pipetage un flux sur les côtés du tube, ajouter 95 ul EM, et bien mélanger. Remarque: Le mélange doit apparaître homogène; si lipide de couleur se dépose sur les parois du tube ou le liquide soit grumeleux, le lipide n&#39;a pas complètement solubilisé et nécessite plus d&#39;éthanol. Protéger le tube from de lumière et de stocker sur la glace. </li><li> Pour fluorescent analogue de cholestérol: préparer une concentration finale de 2,4 pg / ml de cholestérol dans 5 ml d&#39;émulsion de 0,5 à 5% de jaune d&#39;oeuf pour des études d&#39;imagerie en direct. Transférer la quantité désirée de cholestérol dans un tube en plastique de 1,5 ml. Sécher le lipide sous un courant de N 2, en prenant soin de ne pas souffler le lipide du tube. </li><li> Immédiatement, remettre en suspension dans 15 pi de RT éthanol à 100% par pipetage un flux sur les côtés du tube et mélanger avec 85 pl de RT 1% de BSA sans acide gras dans H 2 O. purifié Protéger le tube de la lumière et de stocker sur la glace. </li></ol></li><li> Préparer Egg Yolk liposome RSS. <ol><li> Ajouter un aliquote décongelé de jaune d&#39;oeuf à EM dans un tube conique de 50 ml. Vortex le mélange de jaune d&#39;oeuf dilué pendant 1-2 min; le mélange doit apparaître comme une émulsion homogène. </li><li> Verser le mélange à travers une passoire fine pour éliminer les conglomérats de protéines et de recueillir dans un nouveau 50 ml tube conique, frais. </li><li> Pulse sonicatE le mélange d&#39;oeuf avec une micropointe conique un quart de pouce (5 fois (5 x 1 sec sur, 1 sec off) arrêtant 5-10 secondes entre chaque série, l&#39;intensité de sortie: 6 W) à la température ambiante pour créer des liposomes. les paramètres d&#39;alimentation de sonicateur sont dépendants instrument et nécessitent donc l&#39;optimisation pour chaque instrument et micropointe. Remarque: la roche en continu le mélange de liposomes à température ambiante pour maintenir l&#39;homogénéité jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Ajouter l&#39;analogue de lipide fluorescent aux liposomes de jaune d&#39;oeuf, si désiré. Immédiatement après sonication, pipeter les lipides préparés dans le mélange de liposome et vortex à grande vitesse pendant 30 secondes à incorporer dans des liposomes. Protéger le mélange de la lumière en enveloppant le tube en aluminium et continuer à bascule à la température ambiante. </li></ol> 3. Alimentation Paradigm <ol><li> Préparer le Larves pour l&#39;alimentation. <ol><li> Avant de commencer l&#39;alimentation, les larves d&#39;écran pour des défauts évidents morphologiques qui peuvent entraver l&#39;alimentation. Transfert des larves à 60 mm x 15 mm des boîtes de Pétri ou 6 ou 12 puits plates, réduire EM à un minimum, et le remplacer par 5 ml de la solution de liposomes préparée. </li><li> Si nécessaire, transférer les larves de contrôle unfed à 5 ml EM et / ou 5 ml 5% de blanc d&#39;oeuf dans EM et de traiter en parallèle. </li></ol></li><li> Agitez doucement les larves dans un rocker incubés (29-31 ° C à 30 tours par minute) tout au long de l&#39;alimentation pour encourager l&#39;apport alimentaire tout en continuant à protéger de la lumière si les analogues de lipides fluorescents sont présents. Si les larves ont besoin d&#39;être exposé à la lumière, minimiser l&#39;exposition avec un couvercle de l&#39;incubateur de verre teinté. </li><li> A la fin de la période d&#39;alimentation, rincer les larves nageant librement dans EM 3 fois. Remarque: Les larves peuvent commencer à consommer des liposomes à tout moment au cours de l&#39;alimentation. S&#39;il est essentiel que les larves commencent à alimenter en même temps, l&#39;écran de la prise alimentaire (voir 3.4) après 1 heure de l&#39;alimentation et de retour seules les larves qui ont commencé l&#39;alimentation à l&#39;émulsion de jaune d&#39;oeuf pour compléter l&#39;alimentation. </li><li> Screen les larves à ce stade pour la prise alimentaire comme un petit nombre ne peut pas eat (en général ~ 0-5%). Examiner l&#39;intestin des larves qui ont été anesthésiés ou légèrement refroidies sur un bloc de métal sur de la glace pour déterminer si elles sont alimentées: des larves qui ont consommé des liposomes aura un intestin sombre (figure 1). </li><li> Image ou processus larves pour la prise de nourriture immédiatement. Alternativement, le lieu des larves dans l&#39;eau douce EM et incuber à 28 ° C pour permettre la transformation métabolique de se produire. </li></ol> 4. Larves de montage pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Préparer le milieu de montage. <ol><li> Pour 3% de méthylcellulose: ajouter 0,75 g de cellulose de méthyle à 25 ml de près ébullition EM, vortex, roche à RT 2-3 jours jusqu&#39;à dissolution complète, et conserver à 4 ° C pour les années à -20 ° C. Des cycles répétés de gel et de dégel à 4 ° C va supprimer les bulles d&#39;air. Rangez 3% de méthylcellulose sur la glace lors du montage des larves. </li><li> Pour 1,2% low-mount agarose: ajouter 0,3 g de faible fondre agarose à 25 mL EM et dissoudre en amenant à ébullition, aliquote dans 2 ml tubes, et maintenir à 26-28 ° C sur un bloc thermique. inutilisées des aliquotes peuvent être stockées à température ambiante ou à -20 ° C et on fait bouillir à nouveau au moment de l&#39;utilisation. Assurez-vous que l&#39;agarose est suffisamment refroidi avant d&#39;exposer à des larves ou ils peuvent être trop chauffé. </li></ol></li><li> Pour un faible grossissement, à débit moyen d&#39;imagerie en direct, placez une lame de verre sur un tissu sur un bloc de métal sur la glace et attendre la diapositive à refroidir. Appliquer une quantité généreuse de 3% de méthylcellulose (qui a été maintenu à 4 ° C sur la glace) sur la lame, transférer une larve sur la cellulose de méthyle de 3%, en utilisant un poker de ligne de pêche (ligne de pêche de diamètre 0,41 mm collé à la extrémité d&#39;un tube capillaire en verre) créer une troth pour drainer l&#39;excès EM (de sorte que la méthylcellulose ne sera pas dilué) et positionner les larves comme on le souhaite. </li><li> Pour court terme (&lt;20 min), à fort grossissement imagerie en temps réel avec un objectif verticale d&#39;émersion de l&#39;huile, les larves avec la lamelle méthode appentis pour monter. <ol><li> Utilisez de la colle cyanoacrylate à base (superglue) àattacher aa 22 mm x 30 mm, la lamelle à une extrémité d&#39;une lame de verre. Utilisez un tisonnier pour mettre une fine ligne de 3% de méthylcellulose sur la diapositive à côté de la lamelle et transférer les larves à la diapositive avec un large trou Pasteur pipette. Enlever l&#39;excès EM afin de ne pas diluer la cellulose de méthyle. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un poker, placer délicatement les larves dans la cellulose de méthyle sur leurs côtés (côté gauche jusqu&#39;à l&#39;image plus du foie, côté droit jusqu&#39;à l&#39;image de la vésicule biliaire) avec leurs têtes à côté de la lamelle. </li><li> Coin superglue dans les coins d&#39;une seconde lamelle couvre-objet et placez doucement un bord de la lamelle couvre-objet sur la lamelle montée et l&#39;autre sur le coulisseau, en comblant les larves. Prenez soin de ne pas appliquer une pression excessive au cours de cette étape ou avec l&#39;objectif tout en imagerie de sorte que les larves restent indemne. </li></ol></li><li> Pour le long terme, l&#39;imagerie à fort grossissement avec un objectif à immersion verticale, les larves de montage dans l&#39;agarose. Ajouter une larve à une petite aliquote de 1,2% à faible masse fondue agarose puis transférer lelarve dans un petit volume d&#39;agarose dans une boîte de pétri. <ol><li> Placez rapidement les larves avec un tisonnier avant la solidification d&#39;agarose. Permettre l&#39;agarose à sécher pendant 2-3 min et couvre entièrement l&#39;agarose avec des produits frais EM pour l&#39;empêcher de sécher. </li></ol></li><li> Pour le long terme, l&#39;imagerie à fort grossissement avec un objectif inversé, les larves monter sur un plat à fond de verre dans l&#39;agarose. <ol><li> Refroidir un bloc de métal sur la glace. Placer le récipient sur le bloc de métal séparé par un tissu pour empêcher un refroidissement excessif et la congélation des larves. Transférer une larve à l&#39;antenne et retirez le EM en évacuant avec un tissu. </li><li> Déposer une goutte de 28 ° C à faible masse fondue agarose (1,2%) au-dessus de la larve et de positionner immédiatement avec un tisonnier (côté gauche vers le bas pour meilleure image du foie, côté droit vers le bas à l&#39;image de la vésicule biliaire). Retirer le plat du bloc froid, laisser sécher pendant 2-3 min, et ajouter un volume suffisant de EM frais pour couvrir l&#39;agarose (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> Apport 5. alimentaireEssai <ol><li> A la fin d&#39;une charge de liposome de jaune d&#39;oeuf contenant 6,4 uM BODIPY C 16, en commun un minimum de 10 larves lavé dans un tube de 1,5 ou 2 ml en plastique, retirez EM, et enclenchez gel. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C, à l&#39;abri de la lumière pendant plusieurs mois. Remarque: Si possible, recueillir des multiples répétitions. Il est important de recueillir les larves unfed à cette étape pour normaliser fond lipidique fluorescence (idéalement les larves de la même embrayage sont utilisés). </li><li> Effectuer une extraction des lipides Bligh-Dyer modifiée 3,21. <ol><li> Ajouter 100 ul de tampon d&#39;homogénéisation (20 mM de Tris-Cl, 1 mM EDTA) à l&#39;échantillon sur la glace (H 2 O alternativement purifié peut être utilisé). Homogénéiser sur la glace avec un sonicateur à micropointes (5 sec total: 1 sec sur 1 sec off). Vérifiez que les larves sont totalement homogénéisé; sinon, répéter. Transfert à un tube 13 ml de culture en verre jetable (autres tubes de verre peuvent être utilisés). Remarque: Le chloroforme est dangereux; effectuer tous les ex lipidique ultérieureles étapes de traction à la température ambiante dans une hotte chimique. </li><li> Pour chaque 100 pi de tampon d&#39;homogénéisation utilisé, ajouter 375 ul de 1: 2 (chloroforme: methanol). Vortex 30-60 sec, incuber 10 min, ajouter 125 ul de chloroforme pour 100 tampon d&#39;homogénéisation ul utilisé, et le vortex 30 sec. </li><li> Ajouter 125 ul de 200 mM Tris pH 7,5 par 100 tampon d&#39;homogénéisation ul utilisé, vortex 30 sec, et centrifuger (2000 x g, 5 min, RT, protégé de la lumière). Retirez délicatement les échantillons de la centrifugeuse. Ils seront séparés en deux phases: une phase aqueuse supérieure est une interface de débris des larves, et une phase organique inférieure (contient des lipides). </li><li> Avec une pipette en verre propre recueillir le fond, la phase organique et le transférer dans un tube de verre de 13 ml propre. Remarque: Prenez soin d&#39;éviter la phase aqueuse et les débris des larves à l&#39;interface; si la contamination se produit, répétez l&#39;étape de centrifugation et de se souvenir. Jeter la phase aqueuse supérieure; il peut être utile pour enlever et jeter cephase précédant la collecte de la phase organique. L&#39;échantillon peut être conservé à -80 ° C pendant jusqu&#39;à 1 mois. </li><li> Sécher la phase organique sous vide (0,12 atm), tout en protégeant de la lumière. Ne pas continuer à sécher les échantillons après évaporation du liquide car il permettra de réduire la solubilité des lipides. Resuspendre les lipides dans 2: 1 (chloroforme: méthanol) et de stocker sur la glace. Le volume optimal du chloroforme et une solution de methanol dépend de la méthode de détection utilisée; commencer bas et continuer à diluer au besoin. Une ligne directrice générale est d&#39;utiliser 10 pi pour 10 larves groupé. </li></ol></li><li> Découvrir les volumes d&#39;échantillons entiers dans des intervalles espacés uniformément sur une plaque de CCM canalisé et balayer la plaque avec un scanner laser couramment utilisé pour l&#39; imagerie biomoléculaire (par exemple, un lecteur de plaque fluorescente). Pour les analogues de lipides fluorescents inclus dans la liste des matériaux qui ont un maximum d&#39;excitation 500-650 maxima nm et émission 510-665 nm, utiliser un laser à 488 nm et à la collecte d&#39;émission à 520 nm. <ol><li> Quantifier la fluorescence totale de chaque tache avec un logiciel d&#39;imagerie. Note: Correct pour le fond lipidique fluorescence naturelle en soustrayant la fluorescence des paires, des échantillons larvaires à jeun. </li></ol></li></ol>

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<li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549(2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les techniques décrites ici permettent aux chercheurs de traiter des larves de poisson zèbre avec une alimentation riche en lipides, visualiser le traitement des lipides alimentaires dans des larves vivantes, et de quantifier l&#39;apport alimentaire des larves. Pour assurer le succès, une attention particulière devrait être accordée à plusieurs étapes critiques. œufs de poule commerciales varient; pour réduire au minimum la variabilité potentielle que nous effectuons tous les tests sur les oeufs organiques des poulets ...

Les mécanismes par lesquels l&#39;intestin réglemente le traitement des lipides alimentaires, le foie contrôle la synthèse des lipides et des lipoprotéines de métabolisme complexe, et comment ces organes fonctionnent avec le système nerveux central pour contrôler la prise alimentaire sont encore mal compris. Il est d&#39;intérêt biomédical pour élucider cette biologie à la lumière des épidémies actuelles de l&#39;obésité, les maladies cardiovasculaires, le diabète, et non alcoolisées maladie du foie gras. Des études en culture cellulaire et les souris ont fourni la majorité de notre compréhension des relations mécanistes entre les lipides et les maladies alimentaires, et le poisson zèbre (Danio rerio) sont en train de devenir un modèle idéal pour compléter ce travail. Zebrafish ont gastrointestinal similaire (GI) organes, le métabolisme des lipides, et le transport des lipoprotéines de vertébrés supérieurs 1,2, se développent rapidement, et sont génétiquement traitable. La clarté optique du poisson zèbre larvaire facilite les études in vivo, une particular avantage pour l&#39; étude du système gastro - intestinal comme son milieu extracellulaire (ie, la bile, le microbiote, la signalisation endocrine) est pratiquement impossible de modéliser ex vivo. Conformément, un organisme de recherche combinant la traçabilité génétique et favorables à l&#39; imagerie active des larves de poisson zèbre avec une variété de manipulations diététiques (riches en matières grasses 3,4, -cholestérol 5, et les régimes alimentaires 6,7), hydrate de carbone et des modèles de maladies cardio - vasculaires 8, le diabète 9,10, stéatose hépatique 11-13, 14-16 et de l&#39; obésité, émergent de fournir une foule d&#39;idées métaboliques. Un aspect essentiel de la transition du poisson zèbre larvaire dans la recherche métabolique est l&#39;optimisation des techniques développées dans d&#39;autres modèles animaux au poisson zèbre et le développement de nouveaux tests qui exploitent les atouts uniques du poisson zèbre. Ce protocole présente les techniques développées et optimisées pour nourrir le poisson zèbre larvaire un lipid-repas riche, visualisent alimentaire traitement lipidique du corps entier à la résolution subcellulaire, et de mesurer l&#39;apport alimentaire. jaune d&#39;oeufs de poules a été choisi pour composer le repas riche en lipides, car il contient des niveaux élevés de graisses et de cholestérol (lipides composent ~ 58% de jaune d&#39;oeuf de poulet, dont ~ 5% est le taux de cholestérol, 60% sont des triglycérides, et 35% sont des phospholipides ). Jaune poulet oeuf fournit plus de matières grasses que les aliments typiques commerciaux de poisson zèbre de micropellets (~ 15% de lipides) et l&#39;avantage qu&#39;il est un aliment normalisé avec des pourcentages connus d&#39;espèces d&#39;acides gras spécifiques, comme les régimes de poisson zèbre et régiments d&#39;alimentation ne sont pas normalisées dans les laboratoires 17. En outre, les analogues de lipides fluorescents prévus dans le jaune d&#39;oeuf visualiser le transport et l&#39; accumulation de lipides alimentaires 18, les composants cellulaires d&#39;image , y compris gouttelettes lipidiques en agissant les deux colorants vitaux 3 et par liaison covalente incorporation dans des lipides complexes, l&#39; étude du métabolisme par chromatographie sur couche mince (CCM) 19 </sup&gt; Et la chromatographie à haute performance liquide (HPLC) (SAF données non publiées), et de fournir une analyse quantitative pour l&#39; apport alimentaire totale 20.

<table><tbody><tr><td>Tricaïne (sel de méthanesulofnate d’éthyle 3-aminobenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anesthésie pour larves de poisson-zèbre</td></tr><tr><td>Oeufs de poule</td><td>N/A</td><td>N/A N/A</td><td>Oeufs biologiques, sans cage, non enrichis pour acides gras omege-3</td></tr><tr><td>Processeur à ultrasons 3000 sonicateur</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Pour fabriquer des liposomes de jaune d’œuf</td></tr><tr><td>Sonabox enceinte acoustique</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Pour fabriquer des liposomes de jaune d’œuf</td></tr><tr><td>1/8" à micro-pointe conique</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Pour fabriquer des liposomes de jaune d’œuf</td></tr><tr><td>Flacons ambrés (4 ml, verre)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Stockage des lipides ; comprend les flacons, les bouchons ouverts et les septos de capuchon</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&nbsp ;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Agitateur incubé pour aliments</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacéne-3-hexadécanoïque)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène-3-dodécanoïque)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène-3-pentanoïque)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacéne-3-propionique)</td></tr><tr><td>Cholestérol topFluor&nbsp ;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Analogue lipidique fluorescent ; 23-(difluorure de dipyrrothéthénon)-24-norcholestérol</td></tr><tr><td>BSA sans acides gras</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>Pour la solubilisation du cholestérol TopFluor</td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Supports de montage pour l’imagerie des larves vivantes ; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Supports de montage pour les larves vivantes imagerie; 22 x 30</td></tr><tr><td>lames de microscope VWR&nbsp ;</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>16004-422</td><td>Montage des larves pour l’imagerie en direct</td></tr><tr><td>Coverslips&nbsp ;</td><td>Verre de couverture</td><td>12-544A</td><td>Montage des larves pour l’imagerie en direct</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Montage des larves pour l’imagerie en direct</td></tr><tr><td>FluoroDish (plat à fond en verre)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp ;</td><td>FD35-100 Montage des</td><td>larves pour l’imagerie en direct ; parabole de 35 mm, verre de 23 mm, épaisseur de verre de 0,17 mm. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscope pour l’imagerie en direct à fort grossissement</td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td></td> Microscope <td>SM21500</td><td>Nikon pour l’imagerie en direct à faible grossissement</td></tr><tr><td>Tubes de culture en verre&nbsp ;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Extraction des lipides ; (13 x 100 mm ; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp ;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Extraction des lipides</td></tr><tr><td>Plaques CCM canalisées</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Dosage de l’ingestion alimentaire ; LK5D Gel de silice 150 A, 20 x 20 cm, 250 um d’épaisseur ; </td></tr><tr><td>Plaques CCM canalisées</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Dosage de l’ingestion alimentaire ; Remplacement direct des plaques TLC Whatman Scientific</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Imager en mode variable</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Lecteur de plaques fluorescentes pour le dosage de l’apport alimentaire</td></tr><tr><td>Logiciel ImageQuant</td> GE <td>Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analyse du dosage de l’apport alimentaire</td></tr><tr><td>5 3/4' Pipettes pasteur jetables en borosilicate de large calibre&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Transfert des larves</td></tr></tbody></table>

haute teneur en graisses alimentation paradigm pour larvaire zebrafish: alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Les poissons-zèbres sont en train d’émerger comme un modèle de traitement des lipides alimentaires et de maladies métaboliques. Ce protocole décrit comment nourrir les larves de poisson-zèbre avec un repas riche en lipides, qui consiste en une émulsion de liposomes de jaune d’œuf de poule créée par sonication de jaune d’œuf dans un milieu embryonnaire. Des instructions détaillées sont fournies pour dépister la consommation de jaune d’œuf chez les larves afin que les larves qui ne se nourrissent pas ne faussent pas les résultats expérimentaux. Les liposomes du jaune d’œuf de poule peuvent être enrichis avec des analogues lipidiques fluorescents, y compris les acides gras et le cholestérol, permettant une visualisation systémique et subcellulaire du traitement des lipides alimentaires. Plusieurs méthodes sont décrites pour monter les larves qui sont propices à l’imagerie en direct à court et à long terme avec des objectifs droits et inversés à fort et faible grossissement. De plus, il présente un test permettant de quantifier l’ingestion alimentaire des larves en extrayant les lipides des larves nourries avec des analogues lipidiques fluorescents, en repérant les lipides sur une plaque de chromatographie à couche mince et en quantifiant la fluorescence. Enfin, les aspects critiques des procédures, les contrôles importants, les options de modification des protocoles pour répondre à des questions expérimentales spécifiques et les limites potentielles sont discutés. Ces techniques peuvent être appliquées non seulement à des enquêtes ciblées et fondées sur des hypothèses, mais aussi à une variété de dépistages et de techniques d’imagerie en direct pour étudier le métabolisme des lipides alimentaires et le contrôle de l’apport alimentaire.

Lorsque alimenté sur une bascule à 29-31 ° C, la majorité des larves saines (≥95%) sera manger dans 1 h. À consommer l&#39;émulsion de jaune d&#39;oeuf, l&#39;intestin des larves obscurcit en couleur. Très intestins sombres peuvent être observés à 2 h (figure 1). Si les larves sont unfed ou ne parviennent pas à se nourrir, l&#39;intestin reste claire. Larves oeuf nourri d&#39;exposition blanche un distendus de lumière intestinale qui ne noircissent pas en couleur. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

Les poissons-zèbres sont en train de devenir un modèle précieux de traitement des lipides alimentaires et de maladies métaboliques. Il décrit des protocoles d’alimentation des larves riches en lipides, l’imagerie en direct d’analogues lipidiques fluorescents alimentaires et la quantification de l’apport alimentaire. Ces techniques peuvent être appliquées à une variété de techniques de dépistage, d’imagerie et d’enquête basée sur des hypothèses.

Haute teneur en graisses Alimentation Paradigm pour larvaire Zebrafish: Alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

L'objectif général de ce protocole expérimental est de nourrir des larves de poisson-zèbre avec un repas riche en lipides, pouvant être enrichi en un analogue lipidique fluorescent, afin de permettre l'observation des dynamiques d'absorption des lipides chez les larves et de quantifier l'ingestion alimentaire de lipides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du métabolisme et de la biologie gastro-intestinale, telles que la manière dont les lipides alimentaires sont métabolisés et comment l'ingestion alimentaire est régulée. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que des analogues lipidiques fluorescents peuvent être efficacement délivrés au moyen de liposomes alimentaires.La transparence optique du poisson-zèbre larvaire permet la microscopie pour révéler le traitement des lipides au niveau subcellulaire. Pour commencer, suspendre un milligramme d'analogue lipidique fluorescent en poudre dans deux millilitres de chloroforme à 100 % pour obtenir une concentration finale de 0,5 microgramme par microlitre. Répartir l'analogue en aliquotes dans des tubes en verre ambré à bouchon vissé compatibles avec le solvant et contenant un joint en téflon.Conserver ces stocks au congélateur. Ajouter 10,4 microlitres du stock d'analogue lipidique fluorescent à 0,5 microgramme par microlitre dans un tube de 1,5 millilitre et sécher sous un courant d'azote, en prenant soin de ne pas projeter le lipide hors du tube. Resuspendre immédiatement le lipide sec dans cinq microlitres d'éthanol à 100 % en pipetant un flux le long des parois du tube.Ensuite, ajoutez 95 microlitres de milieu pour embryon et mélangez soigneusement en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas jusqu'à ce que le mélange apparaisse homogène. Protégez le tube de la lumière et conservez-le sur de la glace jusqu'à utilisation. Pour préparer une solution de liposomes de cholestérol fluorescent, ajoutez suffisamment d'analogue de cholestérol fluorescent en solution mère dans un tube de 1,5 millilitre pour obtenir une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre lorsqu'il est ajouté à l'émulsion de jaune d'œuf.Séchez le stock de cholestérol sous un courant d'azote, comme précédemment. Resuspendez immédiatement l'analogue fluorescent de cholestérol dans 15 microlitres d'éthanol à 100 % à température ambiante en pipetant un filet le long de la paroi du tube. Mélangez ensuite avec 85 microlitres de BSA sans acide gras et de l'eau à 1 %.Il est essentiel de solubiliser complètement l'analogue lipidique fluorescent dans l'éthanol et le milieu pour embryons avant de l'ajouter à l'émulsion de jaune d'œuf afin d'assurer une distribution homogène du lipide dans l'aliment et une disponibilité uniforme pour toutes les larves. Protégez le tube de la lumière à l'aide de papier d'aluminium et conservez-le sur de la glace. Pour préparer la solution nutritive, ajoutez 19 millilitres de milieu pour embryons dans un tube conique de 50 millilitres, puis ajoutez un aliquot de un millilitre de jaune d'œuf.Vortexez le mélange pendant une à deux minutes afin d'obtenir une émulsion homogène. Versez le mélange à travers un tamis fin pour éliminer les agrégats protéiques et recueillez-le dans un tube conique propre de 50 millilitres. Ensuite, soumettez le mélange d'œufs à une sonication par impulsions cinq fois, une seconde activée, une seconde désactivée, à l’aide d’une microsonde effilée de 1/4 de pouce et d’une puissance de six watts.Répétez le programme de sonication quatre fois supplémentaires. Cela crée les liposomes, qu'il faut maintenant agiter en continu jusqu'à leur utilisation afin de maintenir l'homogénéité. Ajoutez la quantité appropriée d'analogues lipidiques fluorescents à cinq millilitres du mélange de liposomes immédiatement après la sonication.Vortexer à grande vitesse pendant 30 secondes pour incorporer les analogues lipidiques fluorescents dans les liposomes. Protéger le mélange de la lumière en enveloppant le tube dans du papier d’aluminium, puis le remettre sur le berceur. Ajouter cinquante larves dans une boîte de nourrissage, éliminer le milieu d’embryon et ajouter 5 millilitres de nourriture.Pour encourager l'ingestion de nourriture, agiter doucement les larves dans un berceau incubé et les protéger de la lumière si des analogues lipidiques fluorescents sont utilisés. À la fin de la période d'alimentation, laver les larves trois fois dans cinq millilitres de milieu pour embryons. Pour immobiliser les larves, placer un bloc métallique sur de la glace, recouvrir d'un tissu afin d'éviter un refroidissement excessif, puis déposer les larves dans la boîte contenant le milieu pour embryons par-dessus le bloc pour les refroidir.Observer les larves à un grossissement de 10x au microscope stéréoscopique et déterminer lesquelles ont consommé l'aliment composé de liposomes. Les larves ayant ingéré des liposomes présenteront un intestin assombri. Il est essentiel de déterminer si une larve s'est alimentée en vérifiant la présence d'un intestin assombri.Typiquement, un à cinq pour cent des larves ne se nourrissent pas et pourraient fausser les résultats expérimentaux s'ils ne sont pas identifiés et éliminés. Pour une imagerie à long terme et à fort grossissement avec un objectif inversé, refroidissez d'abord les larves sur un bloc métallique placé sur de la glace. Transférez une larve dans une boîte en verre à fond plat et retirez le milieu embryonnaire en aspirant avec un mouchoir en papier.Déposer une goutte d'agarose à 1,2 % à bas point de fusion à 42 degrés Celsius sur la larve, puis la positionner immédiatement à l'aide d'un outil. Retirer la boîte du bloc réfrigéré et laisser l'agarose durcir pendant deux à trois minutes. Enfin, ajouter un volume suffisant de milieu frais pour embryons afin de recouvrir l'agarose et éviter sa dessiccation.Les échantillons sont désormais prêts pour l'imagerie. À la fin d'une administration de liposomes, regrouper au minimum 10 larves lavées dans un tube de 1,5 millilitre. Éliminer le milieu d'embryon, puis congeler rapidement les larves.Répétez dans un tube distinct en utilisant 10 larves non nourries comme témoin. En maintenant l'échantillon sur de la glace, ajoutez 100 microlitres de tampon d'homogénéisation dans chaque tube, puis homogénéisez à l’aide d’un sonicateur à microplongeur. Transférez le tissu dans un tube de culture de 13 millilitres.Ajouter 375 microlitres de un à deux chloroforme au méthanol à chaque suspension de tampon d'homogénéisation. Vortexer de 30 à 60 secondes, puis incuber 10 minutes à température ambiante. Ajouter encore 125 microlitres de chloroforme et vortexer pendant 30 secondes.Ensuite, ajoutez 125 microlitres de TRIS 200 millimolaire à pH 7,5, vortexez pendant 30 secondes, puis centrifugez à 2000 ×g pendant cinq minutes à l’abri de la lumière. Retirez les échantillons de la centrifugeuse avec précaution afin de ne pas perturber les phases séparées. À l’aide d’une pipette en verre propre, prélève la phase organique inférieure et transférez-la dans un tube en verre propre de 13 millilitres.Évitez soigneusement de transférer les phases aqueuse supérieure ou intermédiaire contenant les débris larvaires, et jetez-les. Séchez la phase organique sous vide à une pression de 0,12 atmosphère, en protégeant du lumière, en prenant soin de s'arrêter dès que le liquide s'est évaporé. Resuspendez un échantillon unique dans 10 microlitres d'un mélange chloroforme-méthanol au rapport deux pour un, et déposez l'intégralité du volume de l'échantillon sur une plaque de chromatographie sur couche mince cannelée.Répétez avec les échantillons restants, en déposant les gouttes à intervalles réguliers. Enfin, analysez la plaque à l’aide d’un lecteur de plaques à fluorescence. L’examen des larves nourries sur berceau rotatif dans des conditions expérimentales révèle des intestins assombris, caractéristiques des poissons ayant consommé l’émulsion de jaune d’œuf.Les larves non nourries ont généralement des intestins clairs, ce qui permet facilement de distinguer celles qui n'ont pas consommé la formule alimentaire pendant la période d'alimentation. Une larve nourrie avec un analogue lipidique fluorescent permet de visualiser le transport et l'accumulation de ce lipide alimentaire. Ici, le signal fluorescent est visible dans l'ensemble des organes digestifs après huit heures d'alimentation.Divers analogues lipidiques sont intégrés à des ensembles uniques de structures cellulaires, et permettent ainsi de les visualiser, car ils sont métabolisés différemment en lipides complexes. Ici, les analogues marqués au Fluorescent-C16 et C12 marquent les gouttelettes lipidiques. L'analogue marqué au Fluorescent-C5 marque les canaux hépatiques et pancréatiques, les gouttelettes lipidiques, les membranes cellulaires et les réseaux artériels.Et les analogues marqués Fluorescent-C2 étiquettent les canaux hépatiques et pancréatiques ainsi que les membranes cellulaires. Des tests d'ingestion alimentaire chez les larves ont été utilisés pour étudier l'alimentation de larves de type sauvage par rapport à des larves transgéniques surexprimant l'apolipoprotéine A4B1, et ont montré que, lors d'alimentations de quatre heures, les larves transgéniques mangeaient moins que les larves de type sauvage. Les élevages ont été normalisés à l'aide de larves témoins appariées et non nourries.La quantification de la fluorescence de larves sauvages et transgéniques, qui surexpriment l'Apo A4 après l'alimentation, montre une ingestion significativement réduite chez les larves transgéniques par rapport aux larves sauvages. Une fois maîtrisée, la préparation de l'analogue lipidique fluorescent de jaune d'œuf comme aliment prend environ 15 minutes. L'ingestion alimentaire peut être quantifiée à partir de 10 à 12 échantillons regroupés en environ quatre heures.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de dépister chez les larves des anomalies du développement qui pourraient entraver l'ingestion de nourriture, telles qu'une mâchoire malformée, un intestin sous-développé ou une mobilité réduite. Des méthodes telles que des traitements pharmaceutiques ou l'ingénierie du génome peuvent être intégrées à ce protocole expérimental afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la manière dont des protéines spécifiques et des voies de signalisation cellulaire régulent l'ingestion alimentaire et le métabolisme des lipides. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans les domaines de la physiologie gastro-intestinale et de la biologie cellulaire de visualiser le transport et l'accumulation des lipides alimentaires chez les larves de poisson-zèbre.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer un aliment riche en lipides pour les larves de poisson zèbre, analyser les larves en fonction de leur ingestion alimentaire, monter les larves pour des observations en imagerie à court et à long terme, et quantifier l'ingestion alimentaire. N'oubliez pas que l'utilisation d'un sonicateur peut présenter des dangers. Une protection auditive doit être portée pendant la réalisation de cette procédure.

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