Haute teneur en graisses Alimentation Paradigm pour larvaire Zebrafish: Alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire

L’objectif global de ce protocole expérimental est de nourrir les larves de poisson-zèbre avec un repas riche en lipides qui peut être enrichi d’un analogue lipidique fluorescent pour monter les larves à la dynamique visuelle de l’absorption des lipides et pour quantifier l’apport en lipides alimentaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du métabolisme et de la biologie gastro-intestinale, telles que la façon dont les lipides alimentaires sont métabolisés et comment l’apport alimentaire est régulé. Le principal avantage de cette technique est que les analogues lipidiques fluorescents peuvent être efficacement délivrés dans les liposomes alimentaires.

La clarté optique de la larve de poisson-zèbre permet à la microscopie de révéler le traitement des lipides subcellulaires. Pour commencer, suspendez un milligramme d’analogue lipidique fluorescent en poudre dans deux millilitres de chloroforme à 100 % pour une concentration finale de 0,5 microgramme par microlitre. Aliquote l’analogue dans des tubes en verre ambré avec des bouchons à vis compatibles avec le solvant qui contiennent un joint en téflon.

Conservez ces bouillons au congélateur. Ajoutez 10,4 microlitres de stock analogue lipidique fluorescent de 0,5 microgramme par microlitre dans un tube de 1,5 millilitre et séchez sous un courant d’azote, en prenant soin de ne pas souffler le lipide hors du tube. Remettez immédiatement en suspension le lipide séché dans cinq microlitres d’éthanol à 100 % en pipetant un jet sur les côtés du tube.

Ensuite, ajoutez 95 microlitres de milieu embryonnaire et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que le mélange apparaisse homogène. Protégez le tube de la lumière et rangez-le sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour préparer une solution de liposomes de cholestérol fluorescents, ajoutez suffisamment de stock analogue de cholestérol fluorescent dans un tube de 1,5 millilitre pour obtenir une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre lorsqu’il est ajouté à l’émulsion de jaune d’œuf.

Faites sécher le stock de cholestérol sous un jet d’azote, comme précédemment. Remettez immédiatement en suspension l’analogue du cholestérol fluorescent dans 15 microlitres d’éthanol à température ambiante à 100 % en pipetant un jet sur le côté du tube. Et mélangez avec 85 microlitres de BSA sans acides gras et de l’eau.

Il est essentiel de solubiliser complètement l’analogue lipidique fluorescent dans l’éthanol et le milieu embryonnaire avant de l’ajouter à l’émulsion de jaune d’œuf pour assurer une distribution homogène du lipide dans l’alimentation et une disponibilité uniforme pour toutes les larves. Protégez le tube de la lumière avec du papier d’aluminium et rangez-le sur de la glace. Pour préparer la solution d’alimentation, ajoutez 19 millilitres de milieu embryonnaire dans un tube conique de 50 millilitres, puis ajoutez une aliquote de jaune d’œuf d’un millilitre.

Agitez le mélange pendant une à deux minutes pour obtenir une émulsion homogène. Versez le mélange à travers une passoire fine pour éliminer les conglomérats de protéines et recueillez-le dans un tube conique frais de 50 millilitres. Ensuite, sonifiez le mélange d’œufs cinq fois, une seconde en marche, une seconde en arrière, avec un micro-embout effilé de 1/4 de pouce à six watts.

Répétez le programme de sonication quatre fois de plus. Cela crée les liposomes, qui doivent maintenant être continuellement secoués jusqu’à l’utilisation pour maintenir l’homogénéité. Ajoutez la quantité appropriée d’analogues lipidiques fluorescents à cinq millilitres du mélange de liposomes immédiatement après la sonication.

Vortex à grande vitesse pendant 30 secondes pour incorporer les analogues lipidiques fluorescents dans les liposomes. Protégez le mélange de la lumière en enveloppant le tube dans du papier d’aluminium et remettez-le dans le rocker. Ajoutez cinquante larves dans une boîte d’alimentation, retirez le milieu embryonnaire et ajoutez 5 millilitres de nourriture.

Pour encourager l’apport alimentaire, bercez doucement les larves dans un berceau à bascule incubé et protégez-les de la lumière si des analogues lipidiques fluorescents sont utilisés. À la fin de la période d’alimentation, lavez les larves dans cinq millilitres de milieu embryonnaire trois fois. Pour immobiliser les larves, placez un bloc métallique sur de la glace, superposez un tissu pour éviter un refroidissement excessif, puis placez les larves dans le plat de milieu embryonnaire sur le dessus pour qu’elles refroidissent.

Observez les larves à 10x sous un microscope à dissection et déterminez lesquelles d’entre elles ont consommé la nourriture en liposomes. Les larves qui ont consommé des liposomes auront un intestin foncé. Il est essentiel de déterminer si une larve s’est nourrie en vérifiant si l’intestin n’est pas foncé.

En règle générale, un à cinq pour cent des larves ne mangent pas et pourraient fausser les résultats expérimentaux si elles ne sont pas identifiées et éliminées. Pour l’imagerie à long terme à fort grossissement avec un objectif inversé, refroidissez d’abord les larves sur un bloc métallique sur de la glace. Transférez une larve dans un plat à fond de verre et retirez le milieu embryonnaire en le faisant sécher avec un mouchoir.

Placez une goutte d’agarose à 42 degrés Celsius à faible taux de fusion 1,2 % sur la larve et positionnez-la immédiatement avec un tisonnier. Retirez le plat du bloc froid et laissez reposer l’agarose pendant deux à trois minutes. Enfin, ajoutez un volume suffisant de milieu embryonnaire frais pour couvrir l’agarose et prévenir la dessiccation.

Les échantillons sont maintenant prêts pour l’imagerie. À la fin d’une alimentation par liposomes, mettez en commun un minimum de 10 larves lavées dans un tube de 1,5 millilitre. Retirez le milieu embryonnaire, puis congelez les larves.

Répétez l’opération dans un tube séparé avec 10 larves non nourries comme témoin. En gardant l’échantillon sur de la glace, ajoutez 100 microlitres de tampon d’homogénéisation dans chaque tube, puis homogénéisez avec un sonicateur à micropointes. Transférez le tissu dans un tube de culture de 13 millilitres.

Ajouter 375 microlitres d’un à deux chloroformes au méthanol dans chaque boue tampon d’homogénéisation. Agitez pendant 30 à 60 secondes, puis incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Ajoutez 125 microlitres supplémentaires de chloroforme et agitez pendant 30 secondes.

Ensuite, ajoutez 125 microlitres de 200 millimolaires TRIS pH 7,5, vortex pendant 30 secondes, puis centrifugez à 2000 fois g pendant cinq minutes à l’abri de la lumière. Retirez soigneusement les échantillons de la centrifugeuse pour éviter de perturber les phases séparées. À l’aide d’une pipette en verre propre, prélevez la phase organique inférieure et transférez-la dans un tube en verre propre de 13 millilitres.

Évitez soigneusement de transférer l’une des phases aqueuses supérieures ou des débris larvaires moyens et jetez-les. Sécher la phase organique sous vide à 0,12 pression atmosphérique, tout en la protégeant de la lumière, en prenant soin de s’arrêter une fois le liquide évaporé. Remettez en suspension un seul échantillon dans 10 microlitres de chloroforme à deux pour un méthanol et repérez tout le volume de l’échantillon sur une plaque de chromatographie à couche mince canalisée.

Répétez l’opération avec les échantillons restants, en repérant à intervalles réguliers. Enfin, scannez la plaque avec un lecteur de plaque fluorescent. L’examen des larves nourries sur un rocker dans des conditions expérimentales montre des intestins foncés, typiques des poissons qui ont consommé l’émulsion de jaune d’œuf.

Les larves non nourries ont généralement des intestins clairs, de sorte que celles qui n’ont pas consommé la formule de régime pendant la période d’alimentation sont facilement distinguées. Une larve nourrie avec un analogue lipidique fluorescent visualise le transport et l’accumulation de ce lipide alimentaire. Ici, le signal fluorescent est visible dans tous les organes digestifs après huit heures d’alimentation.

Divers analogues lipidiques sont incorporés dans des ensembles uniques de structures cellulaires, et les visualisent ainsi, car ils sont métabolisés différentiellement en lipides complexes. Ici, les analogues fluorescents en C16 et C12 marquent les gouttelettes lipidiques. La fluorescence-C5 marque les canaux hépatiques et pancréatiques, les gouttelettes lipidiques, les membranes cellulaires et les réseaux artériels.

Et l’analogue fluorescent-C2 marque les canaux hépatiques et pancréatiques et les membranes cellulaires. Des tests de consommation alimentaire larvaire ont été utilisés pour étudier l’alimentation des larves de type sauvage par rapport aux larves transgéniques surexprimant l’apolipoprotéine A4B1, et ont montré que sur quatre heures d’alimentation, les larves transgéniques mangeaient moins que les larves de type sauvage. Les reproductions ont été normalisées à l’aide de larves témoins appariées et non nourries.

La quantification de la fluorescence des larves de type sauvage et transgénique, qui surexpriment Apo A4 après l’alimentation, montre une ingestion significativement réduite par les larves transgéniques par rapport au type sauvage. Une fois maîtrisé, l’aliment analogue lipidique fluorescent jaune d’œuf peut être préparé en 15 minutes environ. L’apport alimentaire peut être quantifié à partir de 10 à 12 échantillons groupés en quatre heures environ.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de dépister les larves pour les défauts de développement qui peuvent nuire à l’apport alimentaire, tels qu’une mâchoire malformée, un intestin sous-développé ou une mobilité réduite. Des méthodes telles que les traitements pharmaceutiques ou l’ingénierie génomique peuvent être incorporées dans ce protocole expérimental afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la façon dont des protéines spécifiques et des voies de signalisation cellulaire régulent l’apport alimentaire et le métabolisme des lipides. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la physiologie gastro-intestinale et de la biologie cellulaire pour visualiser le transport et l’accumulation des lipides alimentaires chez les larves de poisson-zèbre.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’un repas pour larves de poisson-zèbre riche en lipides, du dépistage des larves pour l’apport alimentaire, du montage des larves pour l’imagerie à court et à long terme et de la quantification de l’apport alimentaire. N’oubliez pas que travailler avec un sonicateur peut être dangereux. Une protection auditive doit être portée lors de l’exécution de cette procédure.