Utilisation d'une cartouche filtrante pour la filtration de l'eau et des échantillons d'extraction de l'ADN de l'environnement

L’objectif global de ce protocole est de filtrer des échantillons d’eau à l’aide d’une cartouche filtrante et d’extraire l’ADN environnemental sans avoir à ouvrir le boîtier pour retirer le filtre du métabarcoding de l’ADNe de divers organismes aquatiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine écologique, telles que le suivi de la biodiversité et l’écologie des communautés. Le principal avantage de cette technique est que les cartouches filtrantes peuvent accueillir de plus grands volumes d’eau et que la filtration et l’extraction de l’ADN peuvent être effectuées de manière stérile.

Pour commencer cette procédure, fixez un tube à vide poussé au connecteur d’entrée d’une pompe d’aspiration. Fixez l’autre extrémité du tube à un collecteur. Assurez-vous que les trois vannes en T rouges du collecteur sont en position d’arrêt.

Ensuite, mettez un ensemble de gants propres. Insérez un raccord Luer femelle à l’extrémité supérieure du tube en caoutchouc sous vide. Ensuite, insérez un connecteur d’aspirateur à l’extrémité inférieure.

Fixez soigneusement le raccord Luer femelle à un orifice de sortie de la cartouche filtrante. Ensuite, fixez le connecteur d’aspiration à un bouchon en silicone. Versez un litre d’eau échantillonnée dans le sac en plastique préparé.

Entourez le capuchon à vis du connecteur Luer-Lock mâle. Ensuite, connectez soigneusement un orifice d’entrée de la cartouche filtrante assemblée avec le connecteur Luer-Lock mâle. Assurez-vous que toutes les connexions sont sécurisées.

Ensuite, accrochez le sac en plastique à deux broches sur le panneau en filet. Insérez un bouchon en silicone dans l’orifice d’entrée du collecteur. Ensuite, allumez l’aspirateur.

Ouvrez les vannes en T rouges pour la filtration. Faites fonctionner le collecteur jusqu’à ce que la cartouche filtrante soit sèche. Ensuite, fermez les vannes en T rouges.

Répétez tout ce processus pour filtrer la quantité d’eau souhaitée. Une fois que toute l’eau échantillonnée a été filtrée, retirez soigneusement la cartouche filtrante du sac en plastique et du récipient sous vide. Boucher les deux extrémités de la cartouche avec les capuchons Luer appropriés.

Ensuite, à l’aide d’un stylo anti-solvant, étiquetez la cartouche et entrez le capuchon Luer. Conserver à 20 degrés Celsius jusqu’au moment d’effectuer l’extraction de l’ADN. Pour les échantillons de plus de quatre litres, préparez une bouteille de livre de dix litres comme détaillé dans le protocole de texte.

Ajouter l’échantillon d’eau à filtrer. Ensuite, insérez fermement une pointe de pipette de dix millilitres dans la valve de la bouteille du livre. Insérez fermement l’orifice d’entrée de la cartouche filtrante dans la pointe de la pipette.

Ensuite, insérez un bouchon en silicone dans l’orifice d’entrée du collecteur. Allumez l’aspirateur. Ensuite, ouvrez les vannes en T rouges pour la filtration.

Faites fonctionner le collecteur jusqu’à ce que la cartouche filtrante soit sèche. Une fois la filtration terminée, fermez les vannes en T rouges. Retirez délicatement la cartouche du sac en plastique et du connecteur d’aspiration.

Ensuite, bouchez les deux extrémités de la cartouche avec les capuchons Luer appropriés. Utilisez un stylo résistant aux solvants pour étiqueter la cartouche et le capuchon Luer d’entrée. Conserver à 20 degrés Celsius jusqu’au moment d’effectuer l’extraction de l’ADN.

Préchauffez un incubateur à 56 degrés Celsius. Ensuite, coupez le capuchon à charnière d’un tube de 2,0 millilitres et jetez le bouchon. Retirez le capuchon d’entrée de la cartouche filtrante.

Ensuite, insérez l’orifice d’entrée dans le tube de 2,0 millilitres. À l’aide d’un film auto-obturant, fermez hermétiquement la connexion entre la cartouche et le tube de collecte. Ensuite, insérez l’unité combinée dans un adaptateur de centrifugeuse pour un tube conique de 15 millilitres.

Centrifugez la cartouche pendant une minute à 5000 fois g pour éliminer le liquide restant dans le filtre. Une fois la centrifugation terminée, retirez le tube de collecte de la cartouche filtrante et jetez le tube. Ensuite, récapitulez l’orifice d’entrée.

Ensuite, mélangez 20 microlitres de solution de protéine A-Case, 220 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate et 200 microlitres de tampon AL. Retirez le capuchon d’entrée et ajoutez le mélange dans la cartouche à l’aide d’une pipette, en insérant complètement la pipette dans l’orifice d’entrée. Récapitulez l’orifice d’entrée. Ensuite, placez la cartouche filtrante sur un agitateur rotatif.

Placez l’agitateur rotatif dans l’incubateur préchauffé et réglez l’agitateur à 20 tr/min pendant 20 minutes. Pendant l’incubation, étiquetez un nouveau tube de 2,0 millilitres avec un stylo résistant aux solvants. Ensuite, placez-le dans un tube conique de 50 millilitres.

Une fois l’incubation terminée, retirez le capuchon d’entrée. Ensuite, insérez l’orifice d’entrée dans le nouveau tube de 2,0 millilitres. Boucher le tube conique avec un bouchon à vis.

Centrifuger pendant une minute à 5000 fois g pour recueillir l’ADN extrait. Ensuite, retirez la cartouche dans le tube de 2,0 millilitres à l’aide d’une pince stérilisée. Boucher le tube et purifier l’ADN extrait comme indiqué dans le protocole de texte.

Dans cette procédure, quatre volumes différents d’eau de mer sont filtrés sur le même collecteur à l’aide de deux filtres uniques, et l’ADNe est ensuite extrait. La cartouche filtrante a détecté, en moyenne, 50 % d’espèces en plus que les filtres en fibre de verre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de filtrer des échantillons d’eau avec une cartouche filtrante et de la façon d’extraire l’ADNe sans avoir à ouvrir le boîtier pour retirer le filtre du métacodage à barres de l’ADNe de divers organismes aquatiques.