Utilisation d'une cartouche filtrante pour la filtration de l'eau et des échantillons d'extraction de l'ADN de l'environnement

L'objectif général de ce protocole est de filtrer des échantillons d'eau à l'aide d'une cartouche filtrante et d'extraire l'ADN environnemental sans avoir à ouvrir le boîtier pour retirer le filtre, afin d'obtenir de l'ADN environnemental (eADN) par métabarcoding provenant de divers organismes aquatiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'écologie, telles que la surveillance de la biodiversité et l'écologie des communautés. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les cartouches filtrantes peuvent traiter des volumes d'eau plus importants, et que la filtration ainsi que l'extraction de l'ADN peuvent être réalisées de manière stérile.

Pour commencer cette procédure, fixez un tube à vide élevé au connecteur d'entrée d'une pompe aspirateur. Reliez l'autre extrémité du tube à un collecteur. Assurez-vous que les trois valves en T rouges du collecteur sont en position fermée.

Ensuite, mettez une paire de gants propres. Insérez un raccord femelle luer à l'extrémité supérieure du tuyau en caoutchouc sous vide. Puis, insérez un raccord de vide à l'extrémité inférieure.

Fixez soigneusement le raccord femelle luer à un orifice de sortie de la cartouche de filtration. Ensuite, reliez le connecteur de vide à un bouchon en silicone. Versez un litre d'eau échantillonnée dans le sac en plastique préparé.

Insérez le bouchon à vis avec le connecteur mâle luer-lock. Ensuite, reliez soigneusement un port d'entrée de la cartouche de filtre assemblée au connecteur mâle luer-lock. Veillez à ce que toutes les connexions soient bien sécurisées.

Ensuite, accrochez le sac en plastique à deux crochets situés sur le panneau en treillis. Insérez un bouchon en silicone dans le port d'entrée du collecteur. Puis, mettez l'aspirateur en marche.

Ouvrir les vannes en T rouges pour la filtration. Faire fonctionner le collecteur jusqu'à ce que la cartouche de filtration soit sèche. Ensuite, fermer les vannes en T rouges.

Répétez l'ensemble de ce processus pour filtrer la quantité d'eau souhaitée. Une fois que toute l'eau échantillonnée a été filtrée, retirez soigneusement la cartouche filtrante du sac en plastique et du récipient sous vide. Bouchonnez les deux extrémités de la cartouche avec les bouchons luer appropriés.

Ensuite, à l’aide d’un stylo résistant aux solvants, étiquetez la cartouche et le bouchon d’entrée à raccord Luer. Conservez à 20 degrés Celsius jusqu’au moment d’effectuer l’extraction de l’ADN. Pour les échantillons de plus de quatre litres, préparez un flacon de dix litres selon les instructions détaillées dans le protocole écrit.

Ajoutez l'échantillon d'eau à filtrer. Ensuite, insérez fermement une pipette de dix millilitres dans la valve de la bouteille en forme de livre. Insérez fermement le port d'entrée de la cartouche de filtration dans la pipette.

Ensuite, insérez un bouchon en silicone dans le port d'entrée du collecteur. Allumez l'aspirateur. Puis, ouvrez les vannes en T rouges pour la filtration.

Faites fonctionner le collecteur jusqu'à ce que la cartouche filtrante soit sèche. Une fois la filtration terminée, fermez les vannes en T rouges. Retirez soigneusement la cartouche du sac en plastique et du raccord sous vide.

Ensuite, boucher les deux extrémités de la cartouche avec les bouchons luer appropriés. Utiliser un stylo résistant aux solvants pour étiqueter la cartouche et le bouchon luer d'entrée. Conserver à 20 degrés Celsius jusqu'au moment d'effectuer l'extraction de l'ADN.

Préchauffez un incubateur à 56 degrés Celsius. Ensuite, découpez le bouchon articulé d'un tube de 2,0 millilitre et jetez le bouchon. Retirez le bouchon Luer d'entrée de la cartouche de filtration.

Ensuite, insérez le port d'entrée dans le tube de 2,0 millilitre. À l'aide d'un film auto-obturant, scellez hermétiquement la connexion entre la cartouche et le tube de collecte. Puis, insérez l'ensemble dans un adaptateur de centrifugeuse conçu pour un tube conique de 15 millilitres.

Centrifuger la cartouche pendant une minute à 5000 fois g pour éliminer le liquide restant dans le filtre. Une fois la centrifugation terminée, retirer le tube de collecte de la cartouche filtrante et jeter le tube. Ensuite, refermer l'orifice d'entrée.

Ensuite, mélanger 20 microlitres de solution d'albumine A, 220 microlitres de sérum physiologique tamponné au phosphate et 200 microlitres de tampon AL. Retirer le bouchon d'entrée et ajouter le mélange dans la cartouche à l’aide d’une pipette, en insérant complètement la pipette dans l’orifice d’entrée. Reboucher l’orifice d’entrée. Puis, placer la cartouche filtrante sur un agitateur rotatif.

Placer l'agitateurbain rotatif dans l'incubateur préchauffé et régler l'agitateurbain sur 20 tr/min pendant 20 minutes. Pendant l'incubation, étiqueter un nouveau tube de 2,0 millilitre avec un stylo résistant aux solvants. Ensuite, le placer dans un tube conique de 50 millilitres.

Une fois l'incubation terminée, retirez le bouchon d'entrée. Ensuite, insérez le port d'entrée dans le nouveau tube de 2,0 millilitres. Bouchonnez le tube conique avec un bouchon à vis.

Centrifuger pendant une minute à 5000 × g pour récupérer l'ADN extrait. Ensuite, retirer la cartouche du tube de 2,0 millilitre à l'aide de pinces stérilisées. Boucher le tube et purifier l'ADN extrait comme indiqué dans le protocole écrit.

Dans cette procédure, quatre volumes différents d'eau de mer sont filtrés sur le même collecteur à l'aide de deux filtres distincts, puis l'ADN environnemental est extrait par la suite. La cartouche filtrante a détecté, en moyenne, 50 % de plus d'espèces que les filtres en fibre de verre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment filtrer des échantillons d'eau à l'aide d'une cartouche filtrante, ainsi que comment extraire l'ADN environnemental sans avoir à ouvrir le boîtier pour retirer le filtre, dans le cadre du métabarcoding de l'ADN environnemental provenant de divers organismes aquatiques.