Name: Une méthode de détermination des niveaux de graisse dans la base Flottabilité- Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Découvrez une méthode de flottabilité pour mesurer les niveaux de graisse chez les larves de Drosophila melanogaster. Cette technique rapide et économique permet de cribler efficacement les stocks lipidiques altérés.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.E.H. a été soutenu par la bourse de formation en biologie moléculaire NIH-T32-GM08730. Ce travail a été soutenu par le NIH, la subvention NIDDK 5K01DK095932 et le prix AHA 12BGIA11930014 à T.R.

1. Collecter des oeufs de mouches avec Génotype d&#39;intérêt NOTE: croix Idéal se composent de 150 mouches vierges et au moins 75 hommes. collections d&#39;actions devraient se composer d&#39;au moins 200 mouches. <ol><li> Préparer des plaques de raisin. <ol><li> Ajouter 37,5 g d&#39;agar à 1,5 L d&#39;eau distillée dans un 4 L flacon. </li><li> Autoclave mélange eau / agar pendant 50 minutes à 121 ºC (250 ºF). </li><li> Alors que l&#39;eau / mélange agar est autoclavage, ajouter 50 g de saccharose à 500 ml de jus de raisin et remuer avec une barre d&#39;agitation sur une plaque d&#39;agitation chauffé jusqu&#39;à ce que le saccharose est dissous. </li><li> Eteignez le feu et continuez de remuer pour refroidir le jus de raisin / mélange de saccharose à moins de 70 ° C. Testez la température interne avec un thermomètre à alcool. </li><li> Ajouter 3 g agent de Drosophila anti-fongique (par exemple, Tegosept) pour chauffer le jus de raisin / mélange de saccharose et mélanger pour dissoudre. </li><li> Lorsque mélange eau / agar est hors de l&#39;autoclave, laisser refroidir le ballon au toucher par tourbillonnement de temps en temps. </li><li&gt; Combinez mélange eau / agar et le jus de raisin / mélange de saccharose et bien mélanger. </li><li> Utiliser une pipette sérologique pour ajouter 8 - 10 ml du mélange de raisin sur le couvercle d&#39;une petite boîte de Pétri (35 x 10 mm de style). Laisser le mélange à couronne supérieure à la hauteur des parois de couvercle pour former une forme convexe. </li><li> Permettre aux plaques de raisin pour refroidir pendant 2 heures à température ambiante puis stocker dans un récipient hermétique à 4 ºC. </li></ol></li><li> Préparer la pâte de levure. <ol><li> Ajouter 6 ml de solution tampon phosphate (PBS) à 4 g de levure sèche actif en direct dans un tube conique de 50 ml et mélanger avec une spatule jusqu&#39;à consistance lisse. </li><li> levure de magasin coller à 4 ºC. </li></ol></li><li> Ajouter une petite cuillerée (environ 1/8 c) de pâte de levure au milieu d&#39;une plaque de raisin. Lisser les bords rugueux avec une spatule. </li><li> Placer des plaques de raisin dans un incubateur jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient atteint la température ambiante. </li><li> Transfert mouches d&#39;intérêt dans une plaque chambre de collecte d&#39;œufs et le lieu de raisin with pâte de levure vers l&#39;intérieur sur le dessus. Ruban plaque de raisin à la chambre de collecte des œufs pour éviter de laisser la plaque tomber. Assurez-vous d&#39;écrire le génotype et la date des informations importantes sur le fond de la plaque de raisin. </li><li> Upend la chambre de collecte des œufs pour permettre aux mouches pondent leurs œufs sur la plaque de raisin. </li><li> Placez une boîte ou recouvrir la collection des chambres d&#39;œufs et de les placer dans un incubateur à 25 ° C. </li><li> Permettre aux mouches pondent des œufs pour 4-6 heures. </li><li> Fin collection en prenant la plaque de raisin hors de la chambre de collecte d&#39;œufs et de transférer les mouches de nouveau dans leur bouteille de nourriture. Utilisez une spatule pour essuyer la pâte de levure en excès de la plaque de raisin. Magasin plaque de raisin dans une boîte de Pétri plus grand dans un incubateur humidifié à 25 ° C pendant environ 24 heures. </li></ol> 2. Transfert Larves Experimental alimentaire <ol><li> Préparer la nourriture expérimentale. NOTE: Cette recette alimentaire est basée sur le centre Bloomington stocks recette 18. Des changements importantscomprennent quantité de levure pour optimiser la valeur nutritive de la nourriture a augmenté comme évalué par le calendrier de la phase errante (entre 112-120 heures après la collecte des œufs à 25 ° C). Alors que nous avons trouvé cette recette idéale pour la santé et le développement de nos larves expérimentale, toute recette de nourriture est acceptable d&#39;étalonnage donnée avec des contrôles positifs et négatifs, dont des exemples sont énumérés à l&#39;étape 3.10. <ol><li> Mesurer 1600 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Mélangez 134 g farine de maïs, 10,6 g de Drosophila agar de type II et une partie de l&#39;eau (~ 500 ml) dans un bêcher de 1 litre. Mélanger pendant 2 min avec un mélangeur à main motorisé. </li><li> Mélanger 70 g de levure sèche active en direct, 18,4 g de farine de soja, 84,8 g d&#39;extrait de malt, et un peu d&#39;eau (~ 500 ml) dans un autre bécher de 1 L. Mélanger pendant 2 min avec un mélangeur à main motorisé. </li><li> Agiter chaque bêcher et verser dans un flacon 4 L. Utiliser l&#39;eau restante pour rincer les béchers et ajouter dans le flacon. </li><li> Mesurer 140 ml de sirop de maïs léger et ajouter dans le ballon, mélanger par tourbillonnement. &lt;/ Li&gt; <li> Autoclave pendant 50 minutes à 121 ºC (250 ºF) dans le cadre de liquide. </li><li> Après autoclavage, versez la nourriture dans un 4 L bêcher et laisser refroidir. Aide le processus de refroidissement par mélange avec un mélangeur à main motorisé. </li><li> Une fois que le ballon a refroidi suffisamment pour toucher, ajouter 8,8 ml d&#39;acide propionique et 16,8 ml de solution / agent éthanol anti-fongique drosophile. Bien mélanger. (Ajouter la solution d&#39;agent anti-fongique Drosophila en ajoutant 380 g Drosophila agent anti-fongique à 1 200 L d&#39; éthanol et la preuve d&#39; agitation sur une plaque chaude jusqu&#39;à dissolution, assurant que la solution ne dépasse pas 70 ° C.) </li><li> Versez la nourriture dans des flacons jusqu&#39;à ce que la nourriture est d&#39;environ 1 pouce de profondeur et laisser refroidir à température ambiante pendant 2 - 3 h. Branchez flacons et stocker dans un incubateur à 25 ° C. Utiliser dans une semaine. </li></ol></li><li> Plongez une spatule à plusieurs reprises dans la couche supérieure de la fiole de nourriture pour le marquer. Cela aidera les larves à creuser et se nourrir. </li><li> 22 - 24 heures après la collecte des œufs aended, utilisez un petit pinceau pour recueillir 50 premier stade (L1) des larves de la même taille approximative. Placer les larves dans la nourriture expérimentale. Nettoyer le pinceau sur un laboratoire lingette et veiller à ce qu&#39;il n&#39;y ait pas restants larves sur le pinceau avant de continuer à un autre génotype. </li><li> Placez flacon de larves dans un incubateur à 25 ° C et laisser se développer. </li></ol> 3. Déterminer les niveaux de graisse dans Larves <ol><li> Préparer des solutions. <ol><li> Préparer 1 L 10x PBS stock. <ol><li> Ajouter 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, et 2,4 g KH 2 PO 4 à 800 ml d&#39; eau dans un bêcher de 2 L contenant une barre d&#39;agitation. Remuer sans chaleur jusqu&#39;à ce que tous les sels sont incorporés. Amener le pH à 7,4. Augmenter le volume à 1 litre avec de l&#39;eau. </li></ol></li><li> Préparer 2 L 1 x PBS. Ajouter 200 ml 10x PBS solution mère à 1800 ml d&#39;eau. </li><li> Utilisez ce stock de PBS 1x pour faire 20% p / v de saccharose. </li></ol></li><li> Retirer le flacon de larves de laincubateur, une fois il y a 20 - 40 larves errant sur les côtés du flacon (généralement le cinquième jour après la collecte des œufs). Notez la date et l&#39;heure de l&#39;essai, ainsi que le nombre de larves errant. </li><li> Préparer une solution expérimentale par addition de 11,5 ml de PBS et 9 ml de saccharose à 20% dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Ajouter 20% de saccharose dans le flacon jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit de 0,5 à 1 pouce de la partie supérieure du flacon. </li><li> Utilisez une spatule pour mélanger doucement la couche supérieure de la nourriture aux larves libres qui sont encore fouisseurs dans la nourriture. Toutes les larves se lèvera à la surface de la solution de saccharose. </li><li> Utilisez une pince pour transférer doucement les larves dans la concentration initiale de saccharose de l&#39;étape 3.3. </li><li> Utilisez une spatule pour mélanger doucement les larves dans cette solution. </li><li> Boucher le tube conique et upend plusieurs fois pour bien mélanger la solution. </li><li> Déboucher le tube conique et agiter pour créer un tourbillon doux. </li><li> Laisser les larves de régler, soit flottant au sommet de la solution ou sinking vers le bas. Attendre 2 - 5 min pour les larves de régler. NOTE: S&#39;il y a encore des larves qui ne sont pas définitivement flottant ou naufrage, choisir une ligne à utiliser comme point de coupure pour marquer les larves soit comme un flotteur ou une platine. Appliquer ce même critère pour tous les génotypes. Nous utilisons l&#39;angle au fond du tube conique en tant que notre limite. Adp ou SIR2 17 larves mutant peut être utilisé comme témoin positif et Isd2 19 mutants peuvent être utilisés en tant que témoin négatif pour la calibration du dosage. </li><li> Notez le nombre de larves flottant et la concentration spécifique testée. </li><li> Ajouter 1 ml 20% de saccharose à la solution expérimentale pour augmenter sa densité. </li><li> Répétez les étapes 03.07 à 03.10. Notez le nombre de larves flottant et cette nouvelle concentration. </li><li> Continuer les étapes 3,12 et 3,13 jusqu&#39;à ce qu&#39;au moins 95% des larves sont flottantes. </li><li> Utilisez une pince pour recueillir toutes les larves dans un plat de dissection rempli de PBS. </li><li> observe larves sous un microscope et note s&#39;il y a des petites larves, pré-pupes, chrysalides, ou d&#39;autres différences entre les génotypes. NOTE: Dans l&#39;idéal, toutes les larves doit apparaître homogène et au même stade de développement. Nous avons seulement observé des mesures de graisse cohérentes dans ces conditions. </li><li> Notez le nombre total de larves. </li><li> En utilisant des pinces, transférer 10 larves à un laboratoire essuyez pour sécher. Etiqueter un tube à centrifuger et placer 10 larves dans le tube. </li><li> Flash geler les larves dans de l&#39;azote liquide. Conserver le tube à -20 ºC. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Nutr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li>
<li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li>
<li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+body%2C+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates%3A+the+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71(2014).</li>
<li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+proteins+in+disease%3A+New+insights+from+invertebrate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li>
<li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796(2011).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li>
<li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353(2010).</li>
<li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Planar+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li>
<li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li>
<li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%3A+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li>
<li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments%2C+insulin+resistance+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes.+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li>
<li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li>
<li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li>
<li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).</li>
<li>Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from:
 <a target="_blank" href="http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm</a> (2014).</li>
<li>Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Perilipin%2FADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Il existe une multitude de techniques qui ont été développées pour mesurer les niveaux de lipides 8-10. Cependant, chacun de ces procédés est fourni avec quelques inconvénients majeurs qui sont traités par le dosage à base de flottabilité décrit ci-dessus. Tout d&#39;abord, cet essai est extrêmement rapide. Test d&#39;un gradient de concentration complète prend pas plus de 30 - 60 min. Ceci est une énorme amélioration sur la plupart des techniques actuellement utilisées. Par exemple, des...

Drosophila melanogaster a été utilisé pendant plus d&#39; un siècle dans l&#39;étude de la génétique et d&#39; autres questions biologiques de base. Au cours des dernières décennies, il est devenu clair que la drosophile est un outil puissant dans l&#39;étude de nombreuses maladies humaines. Comme 70 - 80% des gènes associés à des maladies humaines ont une mouche orthologue identifié : 1 - 4, Drosophila fournit un système encore traduisible simplifié dans lequel pour étudier les maladies complexes. Métabolisme en particulier, a bénéficié d&#39;une telle étude. Non seulement la génétique du métabolisme bien conservés entre les mouches et les humains, mais les organes et types de cellules sont également très similaires 2,5. Par exemple, le corps gras des magasins de mouche deux triacylglycérides (TAG) et le glycogène, des fonctions analogues à celles effectuées dans le foie des mammifères et adipeux blanc tissu 6. En utilisant la drosophile comme modèle pour l&#39; obésité humaine a considérablement amélioré notre compréhension des lipidesle métabolisme et la génétique de l&#39; obésité 7. Le stade larvaire du développement est particulièrement utile pour l&#39;étude de la ségrégation des éléments nutritifs pour le stockage ou l&#39;utilisation car il est dédié à l&#39;alimentation et le stockage de l&#39;énergie pour être utilisé pendant la nymphose. Actuellement, il existe de nombreuses méthodes quantitatives différentes de la détermination des niveaux de stockage de graisse chez la drosophile. La méthode la plus largement utilisée est le dosage colorimétrique couplé (CCA) 8,9. CCA a été développé pour la détermination des niveaux de TAG dans le sérum humain et fonctionne sur le principe que le glycérol libéré de l&#39;épine dorsale de triglycérides va subir plusieurs réactions, entraînant finalement une réaction d&#39;oxydoréduction couplé générant un produit coloré. Absorbance de longueurs d&#39;onde spécifiques de la lumière est ensuite mesurée pour déterminer la quantité initiale de glycérol présent. Cependant, le glycérol peut également être libéré de mono- et diacylglycérides en plus de TAG et ne peut donc pas être une mesure précise de sTored graisse corporelle 9. En outre, le pigment de l&#39; œil des mouches adultes écrasées peut interférer avec certaines lectures d&#39;absorbance et compliquer les résultats 9,10. Par conséquent, l&#39; ACC doit être accompagné et a été validée par chromatographie sur couche mince (TLC), ce qui permet la séparation de la plupart des familles de lipides qui peut être quantifiée par densitométrie 10,11. Cependant, certaines classes de lipides tels que les sterols ne peuvent pas être analysés et quantifiés doivent être 12 d&#39; une manière différente. La spectrométrie de masse (MS) est un moyen précis pour quantifier toutes les classes de lipides majeurs cellulaires 12,13. Cependant, les procédures nécessaires à l&#39;analyse par MS d&#39;extraction des lipides sont à la fois la consommation de temps (le plus près d&#39;une prise de journée complète) et coûteux. Nous présentons ici une méthode alternative pour déterminer rapidement et à moindre coût des niveaux de graisse organismal chez les larves L3 de Drosophila melanogaster. La méthode présentée ci-dessous exploite la différence de densité entre le tissu adipeux et le tissu maigre. fa Mammaliant tissu a une densité d&#39;environ 0,9 g / ml , 14 tandis que le muscle squelettique comme une masse volumique de 1,06 g / ml 15. Cette différence signifie que les animaux avec des magasins plus élevés de matières grasses auront une densité plus faible que les animaux avec des magasins inférieurs de graisse, ce qui leur permettra de flotter mieux dans une solution de densité fixe. Cette propriété permet de dépistage extrêmement rapide d&#39;un grand nombre d&#39;animaux tout en étant à la fois peu coûteux et non invasif. Analyse basée Flottabilité-a été utilisé à la fois pour confirmer les phénotypes de modifier les régulateurs connus des niveaux de graisse ainsi que pour identifier les nouveaux régulateurs génétiques et neurologiques de l&#39; obésité 16,17.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch’s Original 100 % Jus</td><td></td><td></td><td></td>de raisin</tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Levure de boulanger</td><td>Fleichmann’s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Semoule de maïs</td><td>Gélose drosophile dégermée enrichie</td><td>Quaker</td><td></td></tr><tr><td>Type II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Farine de soja</td><td>ADM Ingrédients de spécialité</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de malt</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Sirop de maïs léger</td><td>Karo</td> Acide propionique Karo <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium anhydre</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Plaque de Petri</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conique</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode de détermination des niveaux de graisse dans la base flottabilité-<em&gt; drosophila</em

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster est un système expérimental clé dans l’étude de la régulation des graisses. De nombreuses techniques existent actuellement pour mesurer les niveaux de graisse stockée chez la drosophile, mais la plupart sont coûteuses et/ou laborieuses et ont des limites évidentes. Ici, nous présentons une méthode pour déterminer rapidement et à moindre coût les niveaux de graisse de l’organisme dans les larves de drosophile L3. La technique repose sur les différences de densité entre les tissus adipeux et maigre et permet de détecter rapidement les phénotypes gras et maigres. Nous avons vérifié la précision de cette méthode par rapport au pourcentage de graisse corporelle déterminé par extraction lipidique neutre et chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GCMS). Nous décrivons en outre des protocoles détaillés pour la collecte et la synchronisation des larves ainsi que des recettes expérimentales pertinentes. La technique présentée ci-dessous permet de pallier les principales lacunes des méthodes de quantification des lipides les plus largement utilisées et constitue un moyen puissant de dépister rapidement et avec sensibilité les phénotypes de régulation des graisses chez les larves L3 tout en préservant l’intégrité des larves. Ce test a de nombreuses applications pour l’étude du métabolisme et de la régulation des graisses chez la drosophile.

La figure 1 représente un exemple de la façon dont le dosage à base de flottabilité peut détecter à la fois les réserves de graisse supérieures et inférieures dans les larves génétiquement manipulées. La figure 1A montre que l&#39; excitation ou le silençage d&#39;un certain sous - ensemble de neurones (E347) dans le cerveau des larves induit moins de gras et plus stocke respectivement. Le même contrôle d&#39;arrière - plan génétique a été utilisé dans l...

Nous présentons ici une méthode pour mesurer les niveaux de graisse organismales dans le troisième stade (L3) de stade larvaire de Drosophila melanogaster. Cette méthode exploite la densité relativement faible du tissu adipeux pour différencier les larves avec des réserves de graisse altérées. analyse basée sur Buoyancy est un outil précieux pour le dépistage rapide, reproductible et économique.

Une méthode de détermination des niveaux de graisse dans la base Flottabilité-<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

L'objectif général de ce dosage est de déterminer les éventuelles modifications des niveaux de stockage des graisses pouvant résulter d'un changement génétique, d'un régime alimentaire ou d'un traitement. Ces méthodes permettent de répondre à des questions essentielles dans le domaine du métabolisme, comme les contributions génétiques ou neuronales à la prédisposition à l'obésité. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est rapide, économique et très reproductible par rapport aux autres méthodes actuellement utilisées.Les personnes novices dans cette méthode ou dans le travail avec des larves au stade errant peuvent éprouver des difficultés avec ce protocole, car la chronologie du développement de différents génotypes peut varier fortement. Pour commencer cette procédure, ajoutez une petite quantité de pâte de levure au centre d'une plaque grillagée. Aplatissez les éventuels bords irréguliers à l’aide d'une spatule.Ensuite, transférez les mouches d'intérêt dans une chambre de collecte d'œufs, puis placez la plaque grillagée avec la pâte de levure par-dessus, tournée vers l'intérieur. Fixez ensuite la plaque grillagée à la chambre de collecte d'œufs à l'aide de ruban adhésif afin d'éviter qu'elle ne tombe. Assurez-vous d'inscrire les informations importantes concernant le génotype et la date sur la face inférieure de la plaque grillagée.Ensuite, retournez la chambre de collecte des œufs afin de permettre aux mouches de pondre sur la plaque grillagée. Puis, recouvrez la chambre de collecte des œufs avec une boîte ouverte et placez la chambre de collecte ainsi couverte dans un incubateur à 25 degrés celsius pendant quatre à six heures, afin de permettre aux mouches de pondre leurs œufs. Une fois terminé, retirez la plaque grillagée de la chambre de collecte des œufs et transférez les mouches dans leur flacon d’alimentation d’origine.Utilisez une spatule pour enlever tout excès de pâte de levure de la plaque à grille. Ensuite, conservez la plaque à grille dans une grande boîte de Petri placée dans un incubateur humidifié à 25 degrés Celsius pendant 24 heures. Dans cette procédure, incisez la couche supérieure de la nourriture en la piquant plusieurs fois avec une spatule afin de permettre aux larves de s'enfouir et de s'alimenter.22 à 24 heures après la collecte des œufs, utilisez un petit pinceau pour prélever 50 larves de premier stade de taille approximativement identique et déposez les larves dans le flacon contenant l'aliment expérimental. Il est très important de sélectionner et de transférer des larves de taille approximativement identique dans l'aliment expérimental. Cela garantira une coordination étroite du développement larvaire.Ensuite, nettoyez le pinceau avec un essuie-laboratoire et assurez-vous qu'aucune larve ne reste sur le pinceau avant de passer à un autre génotype. Par la suite, placez le flacon contenant les larves dans un incubateur à 25 degrés Celsius et laissez-les se développer. Retirez le flacon contenant les larves de l'incubateur dès que 20 à 40 larves remontent sur les parois du flacon.Enregistrez la date et l'heure du test ainsi que le nombre de larves errantes. Préparez ensuite la solution expérimentale en ajoutant 11,5 millilitres de PBS et neuf millilitres de saccharose à 20 % dans un tube conique de 50 millilitres. Ajoutez du saccharose à 20 % dans le flacon jusqu'à ce que le niveau atteigne un pouce du bord supérieur du flacon.Utilisez une spatule pour mélanger doucement la couche supérieure de la nourriture afin de libérer les larves qui s'y enfouissent encore. Toutes les larves remonteront à la surface de la solution de saccharose. Ensuite, transférez délicatement les larves dans la solution initiale de saccharose et mélangez-les doucement.Lors du transfert des larves vers la solution expérimentale, veillez à ne pas comprimer ni percer les larves. Cela pourrait modifier les résultats du test. Boucher le tube conique et le retourner plusieurs fois pour mélanger complètement la solution.Ensuite, retirez le bouchon du tube conique et faites-le tourner doucement pour créer un vortex léger. Laissez reposer deux à cinq minutes afin que les larves se déposent, soit en flottant à la surface de la solution, soit en coulant au fond. Notez le nombre de larves flottantes et la concentration spécifique de saccharose testée.Ensuite, ajoutez un millilitre de saccharose à 20 % à la solution expérimentale pour augmenter sa densité. Par la suite, utilisez une spatule pour mélanger doucement les larves. Après cela, fermez le tube conique et retournez-le plusieurs fois pour mélanger complètement la solution.Ensuite, retirez le bouchon du tube conique et faites tourner doucement pour créer un vortex léger. Notez le nombre de larves flottantes et la nouvelle concentration. Poursuivez ce processus jusqu'à ce qu'au moins 95 % des larves flottent.Ajouter du saccharose à 20 % dans le flacon conique jusqu'à environ 2,5 cm du bord supérieur. Ensuite, rassembler toutes les larves dans une boîte de dissection remplie de PBS. Examiner les larves au microscope afin de détecter d'éventuelles petites larves, des prépupes, des pupes ou toute autre différence entre les génotypes, afin de s'assurer que les procédures ont été correctement réalisées.Ensuite, enregistrez le nombre total de larves. Par la suite, transférez 10 larves sur un essuie-tout de laboratoire pour les sécher. Étiquetez un tube microcentrifuge et placez les larves dans le tube.Ensuite, congeler rapidement les larves dans de l'azote liquide et conserver le tube à moins 20 degrés Celsius. Voici un exemple montrant comment le test fondé sur la flottabilité peut détecter à la fois une accumulation de graisse plus élevée et plus faible chez les larves génétiquement modifiées. Cette figure montre qu'une excitation ou une inhibition d'un sous-ensemble spécifique de neurones dans le cerveau larvaire induit respectivement une accumulation de graisse plus faible et plus élevée.Le même témoin de fond génétique a été utilisé dans les deux cas. Voici un exemple de la manière dont ce phénotype obtenu par le dosage de la densité est corroboré par l'extraction de lipides neutres et leur quantification par GCMS. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 30 minutes si elle est correctement effectuée, et peut être réalisée en parallèle avec d'autres génotypes.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de synchroniser au maximum le développement des larves expérimentales. Après cette procédure, les larves peuvent être congelées rapidement dans de l'azote liquide afin d'être utilisées dans d'autres méthodes, comme la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, pour obtenir des informations supplémentaires telles que les classes spécifiques de types de lipides présents dans les larves. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs spécialisés en métabolisme d'explorer les contributions génétiques et/ou neuronales à l'obésité chez Drosophila.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser rapidement les génotypes pour détecter des variations des niveaux de lipides stockés.

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo présente un test pour surveiller l’acidification intestinale chez les mouches drosophiles. Après l’ingestion d’aliments complétés par un colorant indicateur de pH, l’acidification de la lumière intestinale entraîne un changement de couleur du colorant. L’inspection visuelle du tube digestif des mouches pour examiner le changement de couleur fournit des preuves d’acidification.

Essai de surveillance de l’acidification intestinale : une technique pour étudier l’acidification de la lumière intestinale chez la drosophile à l’aide d’un colorant bleu de bromophénol

Nous présentons robustes méthodes biochimiques et microscopiques pour...

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Nous décrivons ici une méthode de mesure rapide et précise des performances de vol chez la drosophile, permettant le criblage à haut débit.

Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; Drosophila</em

Les troubles métaboliques sont parmi l'une des maladies les plus communes chez les humains. Le modèle organisme génétiquement traitable D. melanogaster peut être utilisé pour identifier de nouveaux gènes qui régulent le métabolisme. Ce document décrit une méthode relativement simple qui permet d'étudier le taux métabolique chez les mouches par la mesure de leur production de CO 2.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Les poissons-zèbres sont en train de devenir un modèle précieux de traitement des lipides alimentaires et de maladies métaboliques. Il décrit des protocoles d’alimentation des larves riches en lipides, l’imagerie en direct d’analogues lipidiques fluorescents alimentaires et la quantification de l’apport alimentaire. Ces techniques peuvent être appliquées à une variété de techniques de dépistage, d’imagerie et d’enquête basée sur des hypothèses.

Haute teneur en graisses Alimentation Paradigm pour larvaire Zebrafish: Alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire

Le dosage CApillary FEeder (CAFE) est une méthode simple, économique et très fiable pour étudier les mécanismes sous-jacents à l’apport alimentaire. Utilisé avec l’organisme modèle génétique très polyvalent Drosophila melanogaster, il fournit un moyen puissant d’obtenir de nouvelles connaissances sur les mécanismes de régulation de l’apport alimentaire.

Capillaire Feeder Assay mesures prise alimentaire dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Ce travail présente une méthode pour quantifier rapidement et précisément la pigmentation abdominale de Drosophila melanogaster en utilisant l'analyse d'image numérique . Cette méthode rationalise les procédures entre l'acquisition du phénotype et l'analyse des données et comprend le montage des échantillons, l'acquisition d'image, l'extraction de la valeur des pixels et la mesure des traits.

Quantifier la pigmentation abdominale dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Il s’agit d’un régime riche en graisses alimentation protocole pour provoquer l’obésité chez la drosophile, un modèle pour la compréhension des mécanismes moléculaires fondamentaux impliqués dans la lipotoxicité. Il fournit également un dosage de triacylglycérides à haut rendement pour mesurer l’accumulation de graisse dans la drosophile et potentiellement d’autres modèles (insectes) dans diverses conditions alimentaires, environnementale, génétiques ou physiologiques.

Alimentation de régime riche en graisses et haut débit triacylglycérides essai chez Drosophila Melanogaster

Présentés ici sont des méthodes détaillées pour la dissection et la coloration gouttelette de lipide des ovocytes dans les larves de Drosophila à l'aide de BODIPY 493/503, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques.

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Décrit ici est un protocole qui permet la quantification colorimétrique de la quantité de nourriture consommée dans un intervalle de temps défini par les larves de Drosophila melanogaster exposées à des régimes de qualité macronutriment différente. Ces tests sont menés dans le cadre d’un criblage thermogénétique neuronal.

Quantification de l’apport en macronutriments dans un écran neuronal thermogénétique à l’aide de larves de drosophiles

Le présent protocole décrit l’induction de l’autophagie dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster via l’épuisement des nutriments et analyse les changements dans l’autophagie à l’aide de souches de mouches transgéniques.

Analyse de l’autophagie induite par la famine dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster

Découvrez une méthode de flottabilité pour mesurer les niveaux de graisse chez les larves de Drosophila melanogaster. Cette technique rapide et économique permet de cribler efficacement les stocks lipidiques altérés.

Une méthode de détermination des niveaux de graisse dans la base Flottabilité-

Explorer plus de vidéos