Une méthode efficace pour la synthèse de Peptoïdes avec Monomères / Arginine type de type Lysine mixte et de l'évaluation de leur activité anti-leishmaniose

L’objectif global de cette procédure est d’introduire à la fois des monomères de type lysine et arginine dans la même séquence peptoïde et d’évaluer l’activité de ces composés contre Leishmania mexicana, les parasites responsables de la leishmaniose cutanée, une maladie tropicale négligée. De nouvelles thérapies sont nécessaires de toute urgence pour la leishmaniose cutanée, et cette procédure peut aider à identifier et à développer des peptoïdes en tant que nouvelle classe d’anti-infectieux potentiels pour cette maladie tropicale négligée. Le principal avantage de ce protocole est qu’il est possible de synthétiser des peptoïdes contenant des fonctionnalités cationiques mixtes.

Ceci est hautement souhaitable car cela peut aider à moduler les activités biologiques des séquences. Bien que ce test soit testé contre la forme mammifère du parasite, il peut également être utilisé contre le stade insecte de Leishmania mexicana ou appliqué sur des lignées cellulaires de mammifères. La démonstration visuelle de cette méthode est vraiment utile car elle montre la nature progressive de la synthèse et aussi la culture du parasite à divers moments du cycle de vie de Leishmania mexicana.

Pour commencer cette procédure, préparez des solutions dans du diméthylformamide comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, ajoutez 0,1 millimole de résine d’amide de patinoire protégée par Fmoc dans un récipient de réaction en polypropylène de 20 millilitres recouvert de deux frittes. Ajoutez cinq millilitres de diméthylformamide et laissez reposer le récipient pendant 60 minutes à température ambiante.

Ensuite, vidangez le DMF à l’aide d’une plate-forme sous vide d’extraction en phase solide. Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution de pipéridine préparée. Placez le récipient sur une plate-forme vibrante à 450 tr/min à température ambiante et secouez pendant cinq minutes.

Égouttez la solution à l’aide de la station de vide. Ensuite, ajoutez deux millilitres de solution de pipéridine et agitez dans les mêmes conditions pendant 15 minutes. Une fois l’agitation terminée, égouttez la solution via une station de vide.

Ajoutez deux millilitres de DMF et mélangez pendant 30 secondes pour laver la résine. Égouttez le DMF et répétez le lavage trois fois. Pour commencer la synthèse du sous-monomère, ajoutez un millilitre de solution d’acide bromoacétique préparée et 0,2 millilitre de solution de CID préparée.

Agitez pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, égouttez la solution et lavez-la trois fois avec deux millilitres de DMF à chaque fois. Ajouter un millilitre de solution d’amine préparée.

Ensuite, agitez la résine pendant 60 minutes à température ambiante. Égouttez la solution et lavez la résine trois fois avec deux millilitres de DMF à chaque fois. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution d’acide bromoacétique et 0,2 millilitre de solution DIC.

Agitez pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, égouttez la solution et lavez-la trois fois avec deux millilitres de DMF à chaque fois. Pour introduire un monomère fonctionnalisé à la guanidine, ajoutez un millilitre de solution de diamine non protégée à la résine.

Agiter pendant 60 minutes à température ambiante. Ensuite, égouttez la solution et lavez la résine avec deux millilitres de DMF trois fois. Ajouter 0,5 millilitre de solution préparée de 2-acétyldimédone.

Agiter pendant 60 minutes à température ambiante. Ensuite, égouttez la solution et lavez la résine avec deux millilitres de DMF trois fois. Poursuivez la synthèse du sous-monomère jusqu’à ce que la séquence souhaitée soit réalisée.

Ensuite, ajoutez quatre millilitres de solution d’hydrazine préparée et agitez pendant trois minutes à température ambiante. Égouttez la solution et répétez l’opération trois fois. Ensuite, lavez la résine trois fois avec deux millilitres de DMF pour chaque lavage.

Ajouter DIPEA et six équivalents de pyrazole-1-carboxamidine par amine libre dans la séquence peptoïde. Agiter pendant 60 minutes à température ambiante. Une fois l’agitation terminée, égouttez la solution.

Lavez la résine trois fois avec deux millilitres de dichlorométhane pour chaque lavage. Faites sécher la résine à l’air libre pendant 10 minutes et rangez-la pour une utilisation future. Un clivage d’essai peut être effectué après l’ajout d’amines pour vérifier la progression de la synthèse.

Pour commencer le clivage final, ajoutez quatre millilitres de cocktail de clivage dans la même cartouche de réaction frittée que celle utilisée pour la synthèse et couvrez le récipient. Agitez pendant 90 minutes à température ambiante. Ensuite, à l’aide du récipient de réaction fritté, filtrez le cocktail de clivage de la résine dans une fiole à fond rond.

Évaporez le cocktail de clivage à l’aide d’un évaporateur rotatif. Ajoutez deux millilitres d’éther diéthylique anhydre pour précipiter le peptoïde. À l’aide d’une pipette, retirer l’éther diéthylique et le jeter.

Ensuite, répétez trois fois la précipitation de l’éther diéthylique. Une fois les précipitations terminées, dissolvez le peptoïde brut dans 10 millilitres d’acétonitrile préparé et une solution d’eau acidifiée. Transférer dans un récipient pré-pesé.

Ensuite, congelez à moins 20 degrés Celsius et lyophilisez en une poudre sèche prête à être purifiée par HPLC en phase inverse. Après la culture des parasites Leishmania mexicana et la transformation au stade d’amastigote axénique, commencer l’essai de cytotoxicité en préparant des solutions mères composées comme indiqué dans le protocole textuel. Ajoutez deux microlitres de solution mère de peptoïdes de cinq millimolaires, de contrôle de l’amphotéricine B et du contrôle DMSO à la rangée supérieure d’une plaque à 96 puits, comme indiqué dans le protocole de texte.

À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 48 microlitres de fluide frais sur la rangée supérieure. Ajouter 25 microlitres de milieu frais à toutes les autres rangées. Ensuite, effectuez une dilution en série en pipetant 25 microlitres de solution à partir de la rangée supérieure, en l’ajoutant à la rangée inférieure et en mélangeant.

Répétez les dilutions pour l’ensemble de la plaque, en jetant les derniers 25 microlitres pipetés à partir de la rangée inférieure. Ensuite, transférez une culture de parasite dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger pendant cinq minutes à 447 fois g.

Videz l’ancien milieu et ajoutez 10 millilitres de milieu frais. Ensuite, à l’aide d’une pipette, remettez doucement en suspension la pastille de parasites dans le nouveau milieu. Comptez à l’aide d’un hémocytomètre amélioré Neubauer et diluez la culture à huit millions de parasites par millilitre.

Une fois la culture diluée, ajoutez 25 microlitres de parasites dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 60 minutes à 32 degrés Celsius. Une fois l’incubation terminée, prélever 40 microlitres de solution de chaque puits.

Ajoutez 90 microlitres de milieu frais dans chaque puits et incubez à 32 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de solution de viabilité cellulaire à base de résazurine dans chaque puits. Incuber à 32 degrés Celsius pendant quatre heures.

Une fois l’incubation terminée, utilisez un lecteur de plaques pour mesurer la fluorescence. Analysez les données en supprimant le bruit de fond moyen et en comparant la fluorescence des puits après normalisation avec résection aux contrôles DMSO. Dans cette étude, deux peptoïdes sont synthétisés à l’aide de 120 milligrammes de résine d’amide de patinoire chacun.

Les produits sont purifiés par chromatographie liquide à haute pression en phase inverse, et les fractions correspondant à la masse cible sont combinées et obtenues sous forme de poudres blanches. La quantité recueillie pour les deux peptoïdes est indiquée ici avec des rendements d’environ 30 % pour les fractions pures de plus de 90 %. La pureté du produit est évaluée à l’aide d’une HPLC analytique en phase inverse et visualisée à 220 nanomètres, l’absorbance du squelette amide.

Les peptoïdes sont tous deux considérés comme homogènes. Les résultats représentatifs des tests de cytotoxicité contre L Mexicana sont présentés ici. Des solutions mères de cinq millimolaires des composés sont fabriquées dans du DMSO de qualité culture cellulaire et testées en trois exemplaires au moins deux fois pour garantir des données fiables.

On peut voir que le peptoïde B est plus efficace que le peptoïde A pour réduire le pourcentage de parasites viables, les deux ayant un effet dose-dépendant. Après avoir regardé cette méthode, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de synthétiser, de caractériser et de purifier des peptoïdes contenant à la fois des monomères de type lysine et de type arginine et comment les utiliser dans des tests de cytotoxicité contre Leishmania mexicana. Notre méthode pour ajouter une fonctionnalité cationique double dans les peptoïdes n’ajoute qu’une étape simple supplémentaire à la méthode de synthèse des peptoïdes sous sous-monomère couramment utilisée.

En suivant cette méthode, des sous-monomères de type lysine ou arginine de différentes longueurs peuvent être ajoutés pour aider à augmenter la diversité de la bibliothèque, par exemple, avec des chaînes latérales de deux à six carbones de longueur. Lors de la tentative de synthèse peptoïde, il est vraiment important de se rappeler de bien laver la résine entre les étapes pour éviter les produits d’ajout ou de suppression indésirables. Cette méthode ouvre la voie aux chercheurs pour explorer l’activité biologique des peptoïdes mixtes fonctionnalisés cationiquement et pour comparer cette activité à celles qui contiennent exclusivement des monomères de type lysine ou arginine.

Enfin, n’oubliez pas que les parasites et plusieurs des réactifs utilisés dans ce protocole peuvent être extrêmement dangereux. Par conséquent, il est important de toujours utiliser un équipement de protection individuelle adéquat et de travailler à l’intérieur d’une hotte ou d’une enceinte de sécurité microbiologique le cas échéant.