Hybrid-Cut: Une méthode Sectionnement améliorée pour les échantillons de tissus végétaux récalcitrantes

L’objectif global de la méthode de coupe de tissu hybride est d’améliorer l’intégrité des tissus végétaux récalcitrants sectionnés, ceux avec des fibres dures et des cristaux de silice, afin de créer des échantillons de tissus appropriés pour les études anatomiques et biologiques. Les plantes qui contiennent un niveau élevé de cristal et de silice peuvent souffrir d’une grave déchirure de paraffine et de problèmes lors de la coupe. Cette méthode améliore considérablement l’intégrité des tissus.

Le principal avantage de cette technique est que le sectionnement à très basse température dans le cryostat durcit le bloc de paraffine, réduisant considérablement le problème de cisaillement des cristaux. L’application de cette technique peut s’étendre à l’hybridation in situ, à la FISH et à l’évaluation interne, entre autres. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes permettant de s’assurer que le bloc de paraffine adhère étroitement à une étape peuvent s’avérer difficiles.

Pour commencer, sélectionnez des plantes d’orchidées phalaenopsis matures au stade de cinq feuilles. Retirez délicatement les feuilles en les déchirant le long de la côte médiane. À l’aide d’un scalpel bien aiguisé, retirez soigneusement les bourgeons axillaires de la base de la troisième ou de la quatrième feuille sur le système monopodial.

Placez immédiatement les échantillons dans un flacon à scintillation en verre contenant 15 millilitres de fixateur PFA glacé. Appliquez un vide sur les échantillons dans le fixateur à quatre degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. De petites bulles seront libérées des échantillons.

Répétez cette étape jusqu’à ce que la plupart des échantillons coulent après la libération du vide. Enfin, maintenez l’aspirateur pendant la nuit et relâchez-le lentement le lendemain. Ensuite, plongez les échantillons fixés dans 15 millilitres de PBS et placez-les sur de la glace pendant 15 minutes.

Déshydratez les échantillons dans 15 millilitres d’éthanol en une série de concentrations croissantes. 30%50%70%85%95 %et enfin 100 %Infiltrez les échantillons avec 15 millilitres d’un mélange de deux à un volume d’éthanol et de xylène à température ambiante. Poursuivez l’infiltration en plaçant séquentiellement les échantillons dans 15 millilitres de chacun des éléments suivants.

Un mélange volume à volume d’éthanol et de substitut de xylène, un mélange volume à volume d’éthanol et de substitut de xylène, et enfin, un substitut de xylène pur. Ensuite, incubez les tissus dans un four à 60 degrés Celsius. Infiltrer les échantillons avec 15 millilitres de substitut de xylène et de mélange de paraffine à 60 degrés Celsius.

Enfin, infiltrez la paraffine dans 15 millimètres de paraffine pure deux fois pendant 12 heures chacune à 60 degrés Celsius. Répétez cette étape le lendemain. Pour commencer l’incorporation, réchauffez d’abord les moules métalliques à 62 degrés Celsius, puis versez environ 13 millilitres de cire fondue dans la base du moule.

À l’aide d’une pince chauffée, transférez un échantillon de tissu dans le moule et orientez-le dans la position souhaitée. Déplacez délicatement le moule sur la plaque de refroidissement et laissez-le reposer jusqu’à ce que la cire soit solidifiée. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper le bloc d’échantillon de paraffine en une colonne de taille appropriée avec une surface trapézoïdale au sommet.

Ajoutez 800 microlitres de composé de température de coupe optique, ou OCT, au centre de l’étage du cryostat. Placez le bloc de paraffine sur la platine et orientez rapidement le bloc de tissu dans la position souhaitée. Transférez le bloc de paraffine et l’étage dans une chambre à crystat.

Congelez rapidement l’OCT à moins 42 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, refroidissez l’adaptateur de crystat et la température de la chambre à moins 20 degrés Celsius et moins 16 degrés Celsius respectivement. Fixez le bloc et l’étage à l’adaptateur crystat.

Maintenant, sectionnez les tissus à 10 micromètres d’épaisseur. À l’aide d’une pince, prélevez les sections de tissu et placez-les de manière à ce qu’elles flottent sur 800 microlitres d’eau traitée au DEPC sur une lame recouverte de poly-l-lysine. Transférez les lames sur une plaque chauffante réglée à 42 degrés Celsius.

Laissez les sections s’aplatir et utilisez du papier filtre pour absorber l’eau des bords. Laissez l’échantillon sur la plaque chauffante à 42 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre au tissu de se monter sur la lame. Pour déparaffiniser les échantillons, placez d’abord les lames de tissu montées dans un support de coloration.

Ajoutez 150 millilitres de xylène dans un bocal de coloration et plongez le rack de lames pendant cinq minutes. Ensuite, réhydratez les échantillons en les plaçant à des concentrations décroissantes d’éthanol, 150 millilitres chacun pendant trois minutes à la fois à température ambiante. Enfin, plongez les échantillons dans de l’eau double distillée pendant trois minutes.

Colorez les échantillons en plaçant les lames dans 150 millilitres de solution d’hématoxyline pendant 1,5 minute. Rincez pendant quelques secondes dans 150 millilitres d’eau double distillée contenant une à deux gouttes d’acide chlorhydrique N, puis lavez brièvement les lames avec de l’eau double distillée. Déshydratez à nouveau les échantillons à l’aide d’une série de 150 millilitres de concentrations croissantes d’éthanol pendant trois minutes à température ambiante.

Immergez les échantillons dans 150 millilitres de xylène pendant cinq minutes. Enfin, montez les échantillons en ajoutant délicatement 600 microlitres de milieu de montage à base de xylène sur chaque lame, puis en plaçant une lamelle sur l’échantillon. En utilisant cette méthode, des coupes de tissus d’orchidées phalaenopsis ont été générées, y compris le bourgeon axillaire généralement difficile à sectionner, qui contient des niveaux élevés de cristaux.

Les structures détaillées ont été préservées, permettant de visualiser les corps protéiques. La coupe hybride a également produit une coupe claire pour la visualisation du méristème apical de la pousse de la graine germée. Ces images montrent la préparation de coupes transversales de feuilles de plants de riz et de blé à l’aide des techniques traditionnelles de coupe à la paraffine par rapport aux techniques hybrides.

Ces cultures contiennent généralement des niveaux élevés de silice, ce qui les rend difficiles à sectionner. L’intégrité tissulaire dans les coupes coupées hybrides a été considérablement améliorée, et les structures clés souvent déformées, ou difficiles à trouver dans les échantillons de paraffine, ont été préservées dans leur intégralité dans le tissu coupé hybride. De plus, une déchirure n’a été observée que dans les échantillons coupés en paraffine.

De plus, la forte rétention de l’anatomie rend les tissus coupés hybrides utiles pour l’étude des modèles d’expression génique spatiale. Ici, l’hybridation in situ avec Actin et Cyclin B1:1 a été réalisée sur des coupes hybrides des deuxième et troisième bourgeons axillaires des orchidées phalaenopsis. L’amélioration de la préservation anatomique a permis de détecter des niveaux d’expression plus élevés des gènes cibles dans les cellules méristématiques en développement des troisièmes bourgeons axillaires.

Lors de cette procédure, il est important de maintenir une température à moins 16 degrés centigrades pour durcir le bloc de paraffine. Cela devrait se traduire par une coupe de tissu de bonne qualité. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode après avoir échoué à plusieurs reprises à réaliser avec succès une section d’orchidée en utilisant la méthode traditionnelle de paraffine ou de cryosection.

Suite à cette procédure, toutes les expériences telles que l’hybridation in situ et FISH peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, y compris l’étude de la localisation spatiale et de la fonction des gènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une section tissulaire de haute qualité dans un échantillon de plante récalcitrante.