Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un In vitro Mise en place pour l'investigation détaillée des interactions Neuron-glie

L’objectif global de ce test de coculture indirecte est d’étudier l’impact des astrocytes sur le développement des neurones. Notre laboratoire s’intéresse au rôle des interactions neurones-glies. On pense que les astrocytes contribuent à la formation des synapses, les structures de connexion du système nerveux central.

Afin d’étudier leur rôle, nous avons conçu un modèle in vitro où l’on peut combiner des astrocytes primaires et des neurones embryonnaires primaires, dans des compartiments séparés. Les compartiments sont reliés par une membrane perméable, qui permet d’analyser les échanges entre les deux types de cellules. En utilisant cette approche, nous avons été en mesure de surveiller la formation des synapses sur des périodes allant jusqu’à quatre semaines.

De plus, il est possible d’étudier les rôles individuels des astrocytes d’une part, et des neurones d’autre part, à l’aide de ce test. Et enfin, nous pouvons également étudier plus en détail le sécrétome de nos compartiments cellulaires qui contient des molécules qui médient l’influence réciproque des deux compartiments cellulaires dans ce système. Cette méthode peut fournir des informations sur les interactions entre les neurones et les astrocytes.

En outre, il peut être appliqué à d’autres organismes modèles, tels que les cellules de rat. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auraient du mal car l’expérience est nécessaire pour obtenir l’opération de maturation optimale du tissu hippocampique après la dissection. Pour disséquer les cortex, retirez la peau du crâne le long de la ligne médiane en partant du cou vers le niveau des yeux.

Ensuite, tenez la tête par l’extrémité rostrale à l’aide d’une paire de pinces et faites une incision le long de la ligne médiane du crâne. Ensuite, coupez les moitiés gauche et droite du crâne pour exposer le cerveau. Après cela, soulevez le cerveau du crâne et transférez-le dans une boîte de Pétri de 10 cm remplie de HBSS.

Procédez de la même manière avec les spécimens restants jusqu’à ce que tous les cerveaux soient rassemblés dans la boîte. Pour séparer les cortex, pincez la croûte postérieure à l’aide d’une paire de pinces. Faites une incision médiane entre les deux hémisphères.

Fixez soigneusement le cerveau et coupez le mésencéphale et le bulbe olfactif à l’aide d’une deuxième paire de pinces, ce qui entraîne deux moitiés corticales. Ensuite, fixez une moitié corticale à l’aide d’une paire de pinces et décollez les méninges en la détachant du bord latéral. Et par la suite, en le tirant de la surface corticale à l’aide d’une deuxième paire de pinces.

Orientez la moitié corticale avec sa surface vers le bas. Disséquez soigneusement et retirez l’hippocampe en forme de croissant. Transférez ensuite les cortex dans un tube conique de 15 ml.

Ajoutez un ml de denem et 0,1 % en poids de papaïne dans un tube de réaction de 2 ml. Incuber la suspension dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la solution soit claire. Ajoutez la L-cystéine et la DNAse au mélange et secouez doucement.

Ensuite, filtrez le mélange pour obtenir un ml de solution stérile, puis ajoutez-le au tissu cortical et incubez pendant 30 minutes à une heure à 37 degrés Celsius. Pour terminer la réaction de digestion, ajoutez un ml de milieu astrocytaire et titrez soigneusement le tissu digéré. Ensuite, ajoutez cinq ml de milieu astrocytaire à la suspension cellulaire.

Une fois que le tissu a été dissocié en une suspension unicellulaire, centrifugez-le pendant cinq minutes. Après cela, aspirez soigneusement le surnageant de la pastille résultante et remettez les cellules en suspension dans un ml de milieu astrocytaire. Ajouter la suspension cellulaire dans les flacons T75 remplis de neuf ml de milieu astrocytaire.

Après sept jours de culture, vérifiez si les cellules ont formé une monocouche confluente. Assurez-vous que la température est réglée à 37 degrés Celsius et que le filtre du ballon est scellé avec un film de laboratoire pour éviter l’évaporation du dioxyde de carbone. Afin de se débarrasser des cellules progénitrices et d’obtenir une culture d’astrocytes purs, placez les fioles T75 sur un agitateur orbital et agitez les cultures pendant la nuit à 250 rotations par minute.

Le lendemain, aspirez le milieu et ajoutez 10 ml de milieu de culture frais rempli de 20 micromolaires RSE pour éliminer les cellules résiduelles en division. Dans cette procédure, placez autant d’inserts que nécessaire dans la plaque à 24 puits. Enduire chaque insert de 10 microgrammes par ml de poly d’lysine et incuber pendant une heure.

Après une heure, lavez les inserts deux fois avec du PBS. Pendant ce temps, aspirez le milieu astrocytaire et lavez une fois la culture avec 10 ml de PBS pour vous assurer que le sérum résiduel est éliminé. Ensuite, ajoutez trois ml de trypsine EDTA à 0,05 % dans les flacons et incubez les cellules pour la trypsinisation pendant environ 10 minutes.

Ensuite, remettez doucement les cellules en suspension dans sept ml de milieu astrocytaire. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifugez pendant cinq minutes à 216 x g. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un ml de milieu astrocytaire.

Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Par la suite, remplissez la plaque de 24 puits avec 500 microlitres de milieu astrocytaire par puits. Aspirez le PBS et transférez 25 000 cellules et 500 microlitres de milieu astrocytaire dans chaque insert individuel et incubez la culture à 37 degrés Celsius.

Pour disséquer l’hippocampe, préparez trois plats de 10 cm remplis de milieu de préparation et un tube de 2 ml avec un ml de milieu de préparation. Disséquez l’hippocampe du cortex noyadees et collectez-les dans un tube de deux ml rempli de milieu de préparation. Il est essentiel que l’hippocampe soit isolé sans tissu adjacent à d’autres régions du SNC.

Par conséquent, après l’ablation de l’hippocampe, les tissus contaminants étrangers doivent être éliminés en plus. Après la dissection, transférez le tube sur un banc stérile à flux laminaire. Retirez soigneusement le milieu de préparation et digérez le tissu hippocampique d’un ml de solution de digestion contenant de la papaïne.

Après 15 minutes de digestion, prélevez délicatement la solution de digestion par aspiration douce avec la pipette. En raison de la grande sensibilité du neurone, il est essentiel de titrer soigneusement l’hippocampe afin d’éviter les bulles et d’obtenir l’intensité de titrage optimale. Lavez l’hippocampe trois fois avec un milieu neuronal en ajoutant et en aspirant soigneusement un ml de milieu de culture frais par cycle de lavage.

Après la dernière étape de lavage, titrez soigneusement le tissu dans un ml de milieu neuronal. Comptez ensuite les cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Plaquez 35 000 cellules dans 500 microlitres de neurones moyens par puits de la plaque à 24 puits et incubez les neurones à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Sortez maintenant de l’incubateur les inserts préparés, qui ont été ensemencés avec des monocouches d’astrocytes confluents. Remplacez le milieu en aspirant le milieu astrocytaire et en le remplaçant par 500 microlitres de milieu neuronal frais. Ensuite, placez soigneusement les inserts avec des astrocytes dans les puits qui contiennent les cultures de neurones à l’aide d’une pince stérile.

Par la suite, remettez la coculture indirecte d’astrocytes de neurones résultante dans l’incubateur jusqu’aux expériences. Cette image montre les monocouches formées par les astrocytes sur la membrane de l’insert de culture cellulaire. Les astrocytes sont immunomarqués pour GFAP et MMP2.

Le schéma illustre ici la configuration de la coculture indirecte. Bien que deux cultures soient physiquement séparées, elles partagent le même médium. Deux médiateurs moléculaires sécrétés des interactions neuronales gliales sont révélés dans le milieu de co-culture à l’aide du western blot avec plusieurs isoformes de TNC, un régulateur de croissance pur et simple, et de MMP2, un modificateur de matrice extracellulaire.

Cette image montre que les neurones primaires développent des réseaux hautement interconnectés au 14e jour de la culture. La colocalisation du basson marqueur présynaptique avec l’échafaudage postsynaptique PSD95 documente la formation synaptique structurellement achevée. En conclusion, en utilisant notre système de test, nous avons montré qu’il est possible de combiner les astrocytes primaires et les neurones primaires dans le modèle de coculture.

Les deux surtypes sont séparés mais partagent le même support. Par conséquent, nous pouvons également étudier le sécrétome des deux surtypes dans notre modèle. Dans ce modèle, les synapses se développent et mûrissent.

De plus, nous pouvons également montrer l’émergence de structures spécifiques supplémentaires telles que les réseaux périneuronaux. Ainsi, notre système modèle est bien adapté pour étudier l’influence des astrocytes sur la formation, la plasticité et la fonction des synapses.