Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la

L'objectif général de cette étude est d'établir un système de culture in vitro basé sur des cellules de mammifères infectées par le virus Zika afin d'étudier la réplication du virus Zika, ainsi que d'utiliser cette plateforme in vitro pour le développement de médicaments. Ce protocole détaillé, étape par étape, du système de culture cellulaire infectieuse par le virus Zika peut contribuer à élucider les mécanismes de la pathogenèse induite par le virus Zika et l'évolution de la virulence virale. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre une production à grande échelle du virus Zika pour le développement de traitements et de vaccins.

Commencez par récolter les cellules Vero à une densité de 80 % dans un flacon de culture T75 en aspirant le milieu du flacon et en rinçant les cellules avec deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Ajoutez deux millilitres de trypsine à 0,25 % et incubez le flacon à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l'incubation, ajoutez huit millilitres de milieu de croissance contenant du sérum afin d'inactiver la trypsine. Ensuite, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Prélevez ensuite 10 microlitres de cellules et mélangez-les avec un volume équivalent de bleu de trypan à 0,4 %. Chargez le mélange préparé sur la lame de chambre de comptage et déterminez le nombre de cellules viables à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé. Ensemencez un total de sept millions de cellules dans un flacon T160 avec un volume de 30 millilitres. Le jour suivant, préparez une multiplicité d'infection appropriée d'inoculum du virus Zika dans 10 millilitres de milieu de culture sans sérum par flacon.

La manipulation sécuritaire du virus est essentielle pour prévenir la propagation de l'infection.

Retirer le milieu usé du flacon T160, puis ajouter les 10 millilitres complets de l'inoculum viral fraîchement préparé. Incuber les flacons inoculés à 37 degrés Celsius avec 5 %CO2 pendant quatre à six heures. Répartir l'inoculum en inclinant doucement le flacon sur le côté toutes les heures durant l'incubation. À la fin de l'incubation, remplacer l'inoculum par 30 millilitres de milieu de croissance chaud supplémenté en sérum. Puis poursuivre la culture virale pendant les 96 heures suivantes. Après quatre jours, vérifier l'évolution de l'infection en observant l'apparition de plaques virales sur la monocouche cellulaire, à l'aide d'un microscope à contraste de phase. Prendre des images selon les besoins aux grossissements 40x et 200x.

Récolter les surnageants de culture cellulaire au point temporel de 96 heures et centrifuger le surnageant à 300 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius afin d'éliminer les débris cellulaires. Après la centrifugation, retirer soigneusement les surnageants sans perturber les débris en pellet, puis les transférer dans des tubes de 15 millilitres.

Conserver les surnageants de culture virale en plusieurs aliquotes à moins 80 degrés Celsius.

Pour titrer le virus, semez d'abord des cellules Vero naïves dans une plaque de 12 puits à raison de un fois dix puissance cinq cellules par puits, dans un volume de deux millilitres. Le jour suivant, préparez des dilutions sérielles dix fois consécutives de surnageants viraux prélevés à partir du flacon T160 à l'aide d'un milieu sans sérum.

Lors de la préparation de dilutions sériées du surnageant de culture virale pour les dosages de titres, manipulez le virus en toute sécurité afin de prévenir toute infection.

Ensuite, retirez le milieu usé de chaque puits de la plaque 12 puits contenant les cellules Vero, puis ajoutez 400 microlitres de l'inoculum dilué sur les cellules Vero en triplets. Incubez les plaques inoculées dans l'incubateur de culture tissulaire pendant quatre à six heures.

À la fin de l'incubation, remplacez l'inoculum par deux millilitres de milieu supplémenté en sérum par puits. À 48 heures post-inoculation, dénombrez les foyers viraux aux dilutions appropriées, en utilisant un microscope à contraste de phase. Calculez la titration virale en unités formant des plaques par millilitre.

Après avoir inoculé des cellules Vero dans une plaque de 12 puits avec des titres élevés et faibles du virus Zika, puis incubé pendant 48 et 96 heures, la réplication du génome est évaluée par PCR quantitative pour l'expression du génome du virus Zika, et par immunocytochimie pour l'ARN double brin.

Pour l'immunocytochimie, retirez le milieu des puits de la plaque de 12 puits et ajoutez un millilitre de méthanol dans chaque puits. Laissez les cellules fixer à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les cellules fixées trois fois avec du PBS 1x. Puis ajoutez le tampon de blocage et incubez pendant une heure à température ambiante. Diluez l'anticorps primaire monoclonal de souris anti-ARN double brin J2 au ratio de un à 100 dans le tampon de blocage, ajoutez-le aux cellules et incubez les cellules dans cette solution toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, diluez l'anticorps secondaire IgG-594 de chèvre anti-souris au ratio de un à 1 000 dans le tampon de blocage, puis après avoir lavé les cellules avec du PBS 1x, ajoutez-le aux cellules et incubez-les pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé les cellules avec du PBS 1x, réalisez la coloration des noyaux à l'aide du colorant Hoechst et observez les cellules au microscope à fluorescence avec un grossissement de 100x.

Six heures après avoir ensemencé une plaque de 12 puits avec des cellules Vero naïves, comme précédemment, ajoutez les cytokines d'intérêt aux concentrations indiquées, en doubles biologiques. Douze heures après le traitement, réalisez l'infection par le virus Zika et incluez des puits témoins négatifs non infectés. Quatre heures après l'infection, remplacez l'inoculum viral par du milieu traité aux cytokines, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 44 heures supplémentaires. À 48 heures post-infection, dénombrez les plaques virales à l'aide d'un microscope à contraste de phase et acquérez des images représentatives des cellules infectées à un grossissement de 40x.

Ce graphique montre la charge génomique du virus Zika mesurée par RT-qPCR. Les amorces des génotypes Pan et de la souche PRVABC-59 ont montré une sensibilité et une spécificité équivalentes. Comme prévu, les amorces virales du virus de l'hépatite C n'ont amplifié aucun produit.

Cinétiques de croissance virale du Zika aux points temporels indiqués dans des cellules infectées à faible et forte charge virale, comparées à celles du témoin non infecté (mock), sont présentées ici. Les résultats de l'essai d'immunocytochimie montrent qu'à 48 heures post-infection, les cellules infectées se regroupent en quelques agrégats, tandis qu'à 96 heures post-infection, la majorité des cellules sont infectées. Ce graphique illustre la modulation de la croissance virale du Zika par diverses cytokines, comparée à celle du témoin véhicule.

Ces images en contraste de phase montrent des cellules infectées par le virus Zika, avec ou sans traitement par cytokine. Les plaques virales formées par les cellules infectées apparaissent comme des foyers. Notez que les puits traités avec de l'interféron ne présentent pas de plaques virales.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que la cartographie à haute résolution des domaines du virus Zika pour la localisation des protéines virales et la réplication dans des cellules de moustiques et humaines, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'élucidation du mécanisme de la pathogenèse de la maladie et l'évolution de la virulence virale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en place d'un système de culture in vitro basé sur des cellules de mammifères infectées par le virus Zika afin d'étudier la réplication du virus, ainsi que de l'utilisation de cette plateforme in vitro pour le développement de médicaments et de vaccins.