Capsules à base de plantes Extraction de microencapsulation pour Applications

L'objectif général de cette procédure est d'établir un processus simplifié d'extraction de capsules d'exine sporopollinique, ou SEC, destinées à des applications de microencapsulation. Cette méthode permet d'obtenir rapidement des SEC propres pour des applications dans les domaines alimentaire et de la santé. Le principal avantage de cette technique réside dans la réduction significative du temps nécessaire à l'extraction des SEC, permettant ainsi de produire des capsules propres et intactes.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le processus d'extraction simplifié de la SEC et une caractérisation détaillée étape par étape, elle peut également être utilisée pour explorer des évaluations fondamentales de la microstructure et de la morphologie de différents biomatériaux d'origine végétale. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison du processus d'extraction classique, qui dure de 8 à 10 jours et implique des acides fortement corrosifs à des températures élevées. Pour commencer cette procédure, préparez un montage à reflux dans une hotte, équipé d’un condenseur en verre, d’un système de circulation d’eau et d’un bain-marie.

Étant donné que le processus d'extraction par CEC implique l'utilisation d'acides fortement corrosifs et de solvant organique, il doit être effectué avec des équipements de protection individuelle adéquats, tels que des lunettes de protection, une blouse de laboratoire, un masque facial et des gants, ainsi qu'une signalisation des dangers. Peser soigneusement 100 grammes de spores de L. clavatum sans produire de poussière et à l'écart de toute source d'inflammation. Ensuite, transférer lentement les spores dans un ballon en PTFE d'un litre équipé d'un barreau aimanté pour agitation magnétique.

Ajoutez 500 millilitres d'acétone aux spores et agitez doucement le flacon pour former une suspension homogène. Placez ensuite le flacon dans un bain-marie réglé à 50 degrés Celsius et raccordé à un condenseur à reflux. Chauffez la suspension à reflux pendant six heures avec agitation à 200 tr/min.

Après avoir laissé la suspension refroidir à température ambiante, filtrez-la à l’aide de papier filtre sous vide et récupérez les spores désengraissées dans de grandes boîtes de Pétri en verre. Séchez les spores à température ambiante en recouvrant les boîtes de Pétri de papier d’aluminium perforé pour permettre l’évaporation du solvant. Après avoir transféré les spores sèches et désengraissées dans un flacon en PTFE d’un litre, ajoutez 500 millilitres de solution d’acide phosphorique à 85 %.

Placer le ballon dans un bain-marie réglé à 70 degrés Celsius et le relier au condenseur à reflux. Chauffer la suspension au reflux pendant 30 heures sous agitation. Une fois la suspension refroidie à température ambiante, la diluer avec 500 millilitres d'eau désionisée tiède et recueillir les SEC par filtration sous vide à l'aide de papier filtre.

Après cela, transférez les SEC dans un bécher en verre de trois litres afin d'effectuer une série de lavages. Dans la hotte, ajoutez 800 millimètres d'eau déionisée chaude aux SEC et mélangez doucement pendant 10 minutes. Ensuite, filtrez la suspension à l'aide de papier filtre sous vide.

Transférez les SEC dans un bécher en verre propre de trois litres. Après avoir répété les étapes précédentes cinq fois, ajoutez 600 millilitres d'acétone chaude aux SEC et agitez doucement pendant 10 minutes. Recueillez les SEC par filtration sous vide et transférez-les dans un bécher en verre propre de trois litres.

Après avoir répété les étapes précédentes avec les solvants appropriés, transférez les SEC propres dans six grandes boîtes de Pétri en verre et faites-les sécher dans une hotte aspirante à température ambiante pendant 24 heures afin d'éliminer toute l'eau. Ensuite, séchez les SEC dans une étuve sous vide à 60 degrés Celsius et à une pression de un millibar pendant 10 heures, ou jusqu'à obtention d'un poids constant. Puis, transférez les SEC séchés dans un flacon en polypropylène pour les conserver dans une armoire sèche.

Préparez 1,2 millilitre d'une solution d'albumine sérique bovine, ou BSA, dans de l'eau déionisée, et transférez-la dans un tube en polypropylène de 50 millilitres. Ajoutez 150 milligrammes de SECs à la solution de BSA. Agitez le mélange au vortex pendant 10 minutes afin d'obtenir une solution homogène.

Après avoir recouvert le tube avec du papier filtre, transférez-le dans un flacon de lyophilisateur et séchez-le pendant quatre heures sous vide à un millibar. Une fois les SEC chargées en BSA complètement sèches, éliminez les agglomérats à l’aide d’un mortier et d’un pilon. Transférez ensuite les SEC chargées en BSA dans un tube de 50 millilitres et ajoutez deux millilitres d’eau déionisée afin d’éliminer la BSA résiduelle.

Récupérez les SEC par centrifugation à 4 704 ×g pendant cinq minutes. Une fois terminé, jetez le surnageant. Répétez le lavage avec de l'eau déionisée.

Ensuite, couvrir le tube contenant les SEC chargés en BSA avec du papier filtre. Puis, transférer les SEC dans un congélateur pendant une heure. Lyophiliser les SEC pendant 24 heures.

Conserver les SECs au congélateur jusqu'à leur caractérisation ultérieure. Utiliser cinq milligrammes des SECs chargés avec la BSA dans un tube en polypropylène de deux millilitres. Ajouter 1,4 millilitre de PBS et vortexer pendant cinq minutes.

Après cela, soniquer l'émulsion à 40 % d'amplitude pendant trois cycles de dix secondes. Une fois terminé, filtrer la solution à l'aide d'un filtre en polyéthersulfone de 0,45 micron. Après avoir effectué les étapes précédentes avec les SEC du placebo, mesurer l'absorbance des SEC chargées en BSA à 280 nanomètres en utilisant le placebo comme blanc.

Enfin, quantifiez la quantité de BSA encapsulée à l’aide d’une courbe standard de BSA dans le tampon PBS. Les images MEB indiquent des spores intactes présentant une microstructure unique et, avant traitement, des organites sporoplasmiques à l’échelle micrométrique ont été observés sur l’image en coupe transversale. Après dégraissage des spores et traitement alcalin, aucune modification morphologique ou structurale n’a été observée.

Les images de MEB après acidolyse montrent des SEC intacts dépourvus de matériaux sporoplasmiques. Aucune élimination importante de matériaux protéiques n'est observée dans les SEC désengraissés et traités à l'alcali par analyse CHN. La majorité des matériaux protéiques est éliminée par l'acidolyse.

L'analyse DIPA montre une distribution uniforme de la taille des SEC après acidolyse pendant jusqu'à 30 heures. L'intégrité structurale des SEC diminue avec une acidolyse prolongée. Les données de MEB et de DIPA montrent que, après l'étape de défatage, l'acidolyse produit des SEC intacts présentant une distribution homogène de taille.

Les données de microscopie confocale à balayage laser indiquent que les SEC non traitées présentent une auto-fluorescence due aux constituants du sporoplasme à l'intérieur de la cavité sporale. Après traitement uniquement par acidolyse, tous les contenus sporoplasmiques sont éliminés. Après encapsulation de la FITC-BSA, une fluorescence verte est observée à l'intérieur des SEC.

Les images de MEB montrent des micro-ravines intactes après la charge en BSA. Aucun changement significatif n'a été observé concernant le diamètre, la circularité et le rapport d'aspect après la charge en BSA dans les SEC. La quantification de la BSA à partir des SEC encapsulées confirme la reproductibilité du processus de microencapsulation, avec une charge de 0,170 ± 0,01 gramme de BSA par gramme de SEC.

Une fois maîtrisé, ce procédé d'extraction par CEC peut être réalisé en 48 heures s'il est effectué correctement. Lors de l'application de cette méthode à divers spores et pollens végétaux, il est essentiel de se rappeler d'évaluer étape par étape l'analyse structurale, morphologique et élémentaire afin d'obtenir des capsules intactes et pures. Après cette procédure, d'autres méthodes d'extraction impliquant des enzymes alcalines peuvent être réalisées afin de vérifier la faisabilité du protocole optimisé pour diverses capsules d'origine végétale.

Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la microencapsulation, de la vectorisation de médicaments et du génie tissulaire pour explorer diverses SEC d'origine végétale comme biomatériaux de nouvelle génération. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'extraire et de caractériser les SEC provenant des spores végétales et des grains de pollen, ainsi que de réaliser l'encapsulation de médicaments et de biomacromolécules dans les SEC.