Une nouvelle méthode d'analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

L’objectif général de ce protocole est d’utiliser la microscopie pour analyser la formation de biofilms bactériens sur les hyphes filamenteux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la formation de biofilms bactériens sur les hyphes, leur spécificité et leur composition. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier la formation de biofilms bactériens sur les hyphes fongiques à plusieurs échelles, du nanomètre au centimètre.

La démonstration de la procédure sera réalisée par Cora Miquel Guennoc de mon laboratoire, et Christophe Rose, l’ingénieur en microscopie électronique de la plateforme INRA PTEF. Pour commencer, préparez des membranes de cellophane du même diamètre que les boîtes de Pétri, puis placez-les dans de l’EDTA bouillant pendant 30 minutes. Utilisez ensuite de l’eau déminéralisée pour rincer les feuilles et autoclavez-les deux fois.

Pour préparer des pré-cultures fongiques, inoculer le champignon sur un milieu gélosé recouvert d’une membrane de cellophane prétraitée à l’EDTA. Incuber les cultures à une température optimale pour obtenir des colonies d’environ un centimètre de diamètre. À partir de la pré-culture, inoculez une boîte de Pétri avec un milieu gélosé approprié, recouverte de la membrane de cellophane EDTA en grattant doucement la zone externe d’une colonie de pré-culture à l’aide d’un scalpel, puis en transférant les hyphes sur la plaque de gélose.

Incuber les plaques à une température optimale jusqu’à ce que les colonies aient environ un centimètre de diamètre. Pour préparer des cultures bactériennes telles que P. fluorescens BBc6, utilisez une boucle stérile pour recueillir deux à trois colonies bactériennes individuelles dans un milieu gélosé et inoculez 25 millilitres de LB. Incuber la culture à une température optimale pendant la nuit. Après avoir cultivé les bactéries pendant la nuit, centrifugez la culture à 5 000 fois g pendant trois minutes.

Ensuite, suspendez la pastille dans 25 millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium de 0,1 molaire. Après avoir répété la centrifugation, utilisez le même tampon pour ajuster la concentration bactérienne finale à 10 à neuf cellules par millilitre. Remplissez une microplaque à six puits avec cinq millilitres de suspension bactérienne.

À l’aide d’une lame de rasoir stérile, coupez la membrane de cellophane de la culture fongique en carrés, avec une seule colonie sur chaque membrane. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement les carrés de cellophane contenant des hyphes du milieu solide et transférez-les dans des puits individuels de la suspension bactérienne. Secouez doucement la microplaque jusqu’à ce que les colonies fongiques se détachent de la cellophane.

Retirez ensuite les feuilles de cellophane en laissant les colonies fongiques dans la plaque. Incuber la microplaque en l’agitant doucement à 20 degrés Celsius pendant un certain temps en fonction des souches utilisées et de l’étape à analyser. Pour P. fluorescens BBc6 RA L.bicolor, incubez les cultures pendant 30 minutes pour obtenir des biofilms à un stade précoce, et jusqu’à 16 heures pour les biofilms matures.

Pour éliminer les bactéries planctoniques et les bactéries fixées électrostatiquement aux hyphes, rincez le champignon en le transférant dans une nouvelle microplaque à six puits remplie d’une solution saline forte. Secouez doucement l’assiette pendant une minute. Transférez le champignon dans une nouvelle microplaque à six puits contenant cinq millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium à 0,1 molaire.

Secouez doucement l’assiette pendant deux minutes, puis transférez le champignon dans un tampon frais. Tout en gardant la colonie fongique en tampon, utilisez un scalpel pour couper la colonie environ en deux. Transférez la moitié de la colonie à colorer dans une boîte de Pétri contenant un millilitre d’eau stérile, complétée par un colorant fluorescent approprié pour visualiser le réseau fongique, tel que l’agglutinine de germe de blé conjuguée à Alexa Fluor 633.

Ensuite, incubez l’échantillon dans l’obscurité. Après la coloration, rincez l’échantillon en le transférant dans un couvercle de boîte de Pétri contenant 10 millilitres de tampon stérile de phosphate de potassium de 0,1 molaire, et secouez doucement pendant une minute. Immergez à moitié une lame dans le couvercle de la boîte de Pétri et positionnez délicatement la section coupée pour qu’elle flotte au-dessus de la lame.

Ensuite, soulevez lentement la lame de la solution tampon, permettant à l’échantillon de se déposer doucement sur la lame. L’aspect le plus délicat est le positionnement de l’échantillon sur la lame. Pour éviter la description du biofilm, l’échantillon et la lame doivent être immergés lors du positionnement de l’échantillon, et l’échantillon ne doit plus être déplacé avant l’imagerie.

Enfin, ajoutez 10 microlitres de milieu de montage anti-décoloration à l’échantillon et couvrez-le d’une lamelle en verre. Examinez les lames à l’aide d’un microscope laser confocal équipé d’un objectif 10x ou 40x. Utilisez une combinaison de balayage de tuiles et des fonctions Z-stack pour obtenir des vues globales et 3D de la colonie fongique et des biofilms.

Pour effectuer la microscopie électronique, après avoir rincé le champignon dans une solution saline forte comme précédemment, transférez le champignon dans de l’eau stérile plutôt que tampon pour éviter la formation de cristaux de sel pendant l’étape de déshydratation. Transférez les biofilms dans un porte-échantillon et retirez l’excès d’eau. Ensuite, transférez les échantillons dans la chambre d’un microscope électronique à balayage à pression variable.

Sur une platine de refroidissement Peltier, congelez l’échantillon à moins 50 degrés Celsius, ce qui lui permet de se lyophiliser lentement directement dans la chambre MEB, avec 100 Pascals de pression variable réglée pendant 15 heures. Récupérez l’échantillon et transférez-le dans un système de dépôt de film sous vide poussé. Enduisez ensuite l’échantillon de deux nanomètres de platine sous plasma d’argon.

Observez l’échantillon revêtu à l’aide d’un microscope électronique à balayage, d’un canon à émission de champ à l’aide du détecteur à haute résolution intégré à l’objectif et d’une haute tension électronique d’un kilovolt. Cette analyse méso-échelle des biofilms met en évidence la distribution hétérogène du biofilm de P. fluorescens BBc6 en vert sur les hyphes de L.bicolor S238N, représentés en rouge. L’analyse a également permis de suivre la formation du biofilm au fil du temps, depuis les premières étapes dans lesquelles seules quelques bactéries marquées à la GFP étaient attachées aux hyphes, indiqués en rouge, jusqu’à la formation d’un biofilm épais et mature.

Comme le montre ici, les images à haute résolution à méso-échelle ont également été utilisées pour effectuer des analyses à micro-échelle, afin d’obtenir des architectures de colonies. De plus, dans cette projection 2D haute résolution d’intensité maximale d’une image confocale 3D, le marquage spécifique avec SYPRO Ruby, représenté en rouge, indique la présence de protéines dans la matrice, avec des bactéries BBc6 marquées à la GFP et des champignons marqués FUN-1 en vert foncé. Après déshydratation et codage du même échantillon, d’autres détails de la structure du biofilm ont été obtenus par imagerie MEB.

Les pointes de flèches vertes pointent vers des cellules bactériennes dans le biofilm, et les pointes de flèches jaunes pointent vers des hyphes fongiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ deux heures et demie pour un échantillon, sans compter le temps d’incubation pour la formation du biofilm et la culture de micro-organismes. En tentant cette procédure, il est important de se rappeler que le succès de la méthode dépend fortement de la capacité à obtenir des colonies fongiques très minces, composées de seulement quelques couches d’hyphes.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes, telles que la mutagénèse ou l’hybridation in situ, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, comme la caractérisation fonctionnelle ou chimique du biofilm, ou pour étudier des biofilms multi-espèces. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs de plusieurs domaines tels que la médecine, les sciences de l’environnement, l’industrie alimentaire, etc., pour explorer la formation de biofilms lors d’interactions fongiques bactériennes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver et d’analyser la formation de biofilm bactérien sur les hyphes fongiques.