Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire

L'objectif général de ce protocole expérimental est d'effectuer une cartographie optique du nœud sinusal chez la souris à partir d'un cœur intact perfusé selon la méthode de Langendorff ou d'une préparation auriculaire isolée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'électro- et de la physiopathologie du nœud sinusal, notamment concernant les mécanismes des anomalies du pacemaker, du syndrome du sinus malade et des diverses maladies associées aux arythmies auriculaires. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à étudier plusieurs paramètres dans des tissus intacts avec une résolution spatiale très élevée et une résolution temporelle précise.

Après avoir confirmé le niveau approprié d'anesthésie par une pincée du orteil, utilisez des ciseaux courbes Mayo de 5,5 pouces et des pinces hémostatiques Kelly de 5,5 pouces pour pratiquer une incision d'un centimètre à l'avant du thorax. À l'aide de pinces courbes Iris de quatre pouces, saisissez rapidement le tissu pulmonaire et utilisez des ciseaux Iris d'un tiers de quatre pouces pour enlever ensemble le poumon, le thymus et le cœur, ainsi que le péricarde. Lavez les tissus dans une solution de Tyrode modifiée oxygénée à 37 degrés Celsius.

Ensuite, utilisez des ciseaux courbes Vannas Tubingen de trois pouces et une pince numéro cinq de quatre tiers de pouce pour retirer les poumons, le thymus et le tissu adipeux du cœur. Puis, utilisez une canule personnalisée de calibre 21 et deux pinces courbes B numéro cinq de 4,3 pouces pour canuler l'aorte et perfuser simultanément et superfuser le cœur avec une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius, en dirigeant la solution à travers un filtre en nylon de 11 microns en ligne avant la perfusion afin d'éviter l'obstruction de la circulation coronaire. Ensuite, reliez un transducteur de pression à un raccord Luer lock sur la ligne de perfusion via un robinet en té à trois voies pour surveiller la pression aortique, et ajustez la vitesse de perfusion selon les besoins afin de maintenir la pression aortique entre 60 et 80 millimètres de mercure.

Pour la cartographie optique du nœud sinusal à partir d’un cœur perfusé selon Langendorff, positionnez l’organe horizontalement avec la face postérieure orientée vers le haut dans une chambre en verre pour bain tissulaire, puis utilisez des broches de 0,1 millimètre de diamètre pour fixer l’apex ventriculaire au fond recouvert de silicone de la chambre afin d’empêcher tout déplacement induit par le flux durant l’expérience. Insérez un petit tube en silicone dans le ventricule gauche par l’intermédiaire de la veine pulmonaire, de l’oreillette gauche et de la valve mitrale, puis utilisez une suture en soie 40 pour fixer le tube au tissu conjonctif environnant. Ensuite, utilisez une autre suture en soie 40 pour ligaturer les veines caves supérieure et inférieure et fixez le bord de l’appendice de l’oreillette droite au fond de la chambre.

Étirez et fixez l'autre extrémité du fil de suture au fond de la chambre, puis placez une électrode de stimulation sur mesure sur le bord de l'appendice auriculaire droit. Ensuite, placez deux électrodes aiguilles monopolaires de 12 millimètres pour électrocardiogramme près de la base des ventricules droit et gauche, et positionnez l'électrode de mise à la terre de l'électrocardiogramme près de l'apex du ventricule. Pour colorer le tissu, injectez le colorant dilué dans un port de perfusion en ligne de la ligne de perfusion coronaire afin de l'administrer sur une période de cinq à sept minutes.

Après 20 minutes de stabilisation, ajouter 0,5 millilitre de blebbistatine à 37 degrés Celsius dans le perfusat, puis injecter 0,1 millilitre de blebbistatine diluée dans 1 millilitre de solution de Tyrode à 37 degrés Celsius dans la ligne de perfusion coronaire sur une durée supplémentaire de cinq à sept minutes à l’aide d’un port d’injection Luer lock en ligne. La blebbistatine doit être utilisée avec précaution. Pour éviter la précipitation de l’inhibiteur, dissoudre d’abord la blebbistatine dans un milieu réchauffé jusqu’à devenir clair à 37 degrés et agiter vigoureusement le mélange.

Pour cartographier optiquement l'échantillon, fixez d'abord un petit morceau de verre recouvert sur la surface de la solution au-dessus du tissu afin de réduire les artefacts de mouvement dus aux vibrations de la solution. Ensuite, à l'aide d'un guide de lumière bifurqué flexible éclairé par une lampe halogène à courant constant et à faible bruit, dirigez le faisceau lumineux filtré vers le tissu et enregistrez le signal fluorescent résultant. Après avoir canulé le cœur comme vient de l'être démontré, disséquez les ventricules depuis le côté antérieur et ouvrez l'oreillette droite en passant par la valve tricuspide selon l'axe valve tricuspide–veine cave supérieure, puis pratiquez une incision à travers la branche médiale de la crête terminale.

Pour ouvrir la paroi libre antérieure de l'oreillette, pratiquer une incision partant du milieu de l'incision du bord médial jusqu'au bord inférieur droit de l'appendice de l'oreillette droite, puis fixer la paroi libre de l'oreillette aplaties au fond d'une chambre recouverte de silicone. Pour ouvrir l'appendice de l'oreillette gauche, couper à travers la valve mitrale le long du coin supérieur de la valve mitrale de l'appendice de l'oreillette gauche. Ensuite, fixer l'oreillette gauche ouverte comme cela avait été fait précédemment pour l'oreillette droite.

Ensuite, retirez partiellement le tissu ventriculaire. Conservez un rebord de tissu ventriculaire pour fixer la préparation afin d'éviter tout dommage aux oreillettes, puis fixez le tissu au fond d'une chambre recouverte de Sylgard. Soulevez maintenant la préparation finale d'environ 0,5 millimètre du fond de la chambre recouverte de silicone pour permettre la perfusion des surfaces épicardique et endocardique, et perfusez l'échantillon avec une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius.

Ensuite, placer une électrode personnalisée de stimulation en chlorure d'argent sur le bord de l'appendice auriculaire droit disséqué. Placer une électrode aiguille monopolaire de 12 millimètres pour électrocardiogramme près de chacun des appendices auriculaires droit et gauche, et placer l'électrode de mise à la terre pour électrocardiogramme près de la jonction auriculo-ventriculaire. Pour colorer le tissu cardiaque, utiliser une pipette de 1 millimètre pour libérer lentement un colorant sensible à la tension dilué dans une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius directement sur le tissu.

Ensuite, immobilisez l'échantillon en appliquant directement du blebbistatin dilué sur le tissu, suivi de l'administration d'un autre 0,5 millilitre de blebbistatin via le perfusat, puis cartographiez optiquement l'échantillon comme vient de l'être démontré. Les étapes de coloration du tissu et d'inhibition par le blebbistatin sont critiques et exigent une mise en œuvre précise ainsi qu'une procédure de coloration exacte afin que les paramètres physiologiques atriaux, notamment la fréquence cardiaque, la localisation du pacemaker dominant et la conduction atriale, ne soient pas affectés. Ci-dessous, une carte typique des lignes de niveau d'activation atriale droite reconstruite pour un rythme sinusal spontané chez un cœur de souris perfusé selon la méthode de Langendorff, accompagnée de deux cartes des lignes de niveau atriales droites correspondantes obtenues à des fréquences d'échantillonnage de 1 et 0,5 milliseconde, sont présentées.

Le point d'activation précoce se situe dans la région intercave près de la veine cave supérieure, où le nœud sinusal est défini anatomiquement. Dans cette expérience, après un rythme de stimulation de l'oreillette droite pendant au moins une minute à une fréquence de 10 à 12 hertz, la stimulation électrique a été interrompue et le temps de récupération du nœud sinusal a été calculé comme l'intervalle de temps entre le dernier potentiel d'action capté et le premier potentiel d'action spontané. L'activation de la préparation atriale isolée durant un rythme sinusal spontané permet d'identifier précisément la zone du pacemaker principal.

Si les procédures chirurgicales et de chargement au colorant sont correctement suivies, aucun changement significatif des caractéristiques physiologiques de l'oreillette ne devrait être observé. Bien que la coloration artérielle puisse nécessiter une quantité plus importante de colorant, le signal fluorescent dans le tissu de la région du nœud sinusal semble plus stable avec cette méthode de chargement, le temps de décroissance de l'intensité du signal après coloration coronaire étant presque deux fois plus long que celui observé après coloration superficielle. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 40 minutes si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à identifier l'anatomie atriale avant de pratiquer une incision afin d'éviter d'endommager le tissu atrial et le nœud sinusal. Après cette procédure, d'autres mesures, telles que les enregistrements conventionnels par électrode mitrale en verre, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les caractéristiques du potentiel transmembranaire commutatif. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la physiologie intellectuelle d'explorer les arythmies atriales, notamment le dysfonctionnement du nœud sino-auriculaire dans le cœur.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une cartographie optique à haute résolution d'une préparation du nœud sinusal de souris.