Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire

L’objectif global de ce protocole expérimental est d’effectuer une cartographie optique du nœud sino-auriculaire de la souris à partir d’un cœur intact perfusé par Langendorff ou d’une préparation auriculaire isolée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’électrophysiologie et de la physiopathologie du nœud sinusal sino-auriculaire sur les mécanismes des anomalies du stimulateur cardiaque, du syndrome des sinus malades et de diverses maladies associées aux arythmies auriculaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier de multiples paramètres dans les tissus intacts avec une très haute résolution spatiale et atemporelle.

Après avoir confirmé le niveau approprié d’anesthésie par pincement des orteils, utilisez des ciseaux Mayo incurvés de 5,5 pouces et une pince hémostatique Kelly de 5,5 pouces pour faire une incision d’un centimètre sur l’avant du thorax. À l’aide d’une pince à iris incurvée de quatre pouces, saisissez rapidement le tissu pulmonaire et utilisez des ciseaux à iris de quatre tiers de pouce pour découper le poumon, le thymus et le cœur ensemble, ainsi que le péricarde. Lavez les mouchoirs dans une solution de Tyrode modifiée à 37 degrés Celsius

Ensuite, utilisez des ciseaux Vannas Tubingen incurvés de trois pouces et une pince numéro cinq de quatre tiers de pouce pour retirer le poumon, le thymus et le tissu adipeux du cœur. Ensuite, utilisez une canule de calibre 21 sur mesure et deux pinces incurvées de 4,3 pouces numéro cinq B pour canuler l’aorte et perfuser et superfusionner simultanément le cœur avec une solution Tyrode à 37 degrés Celsius dirigeant la solution à travers un filtre en nylon en ligne de 11 microns avant la perfusion pour éviter l’obstruction de la circulation coronaire. Ensuite, connectez un transducteur de pression à un verrou Luer sur la conduite de perfusion via un robinet d’arrêt à trois voies pour surveiller la pression aortique, en ajustant la vitesse de perfusion pour maintenir la pression aortique entre 60 et 80 millimètres de mercure si nécessaire.

Pour la cartographie optique du nœud sino-auriculaire à partir d’un cœur perfusé par Langendorff, positionnez l’organe dans une orientation horizontale avec la face postérieure vers le haut dans une chambre de bain d’organe en tissu de verre et utilisez des broches de 0,1 millimètre de diamètre pour fixer l’apex ventriculaire au fond de la chambre recouvert de silicone afin d’empêcher le mouvement induit par le flux pendant l’expérience. Insérez un petit tube en silicone dans le ventricule gauche via la veine pulmonaire, les oreillettes gauches et la valve mitrale et utilisez une suture en soie 40 pour fixer le tube au tissu conjonctif environnant. Ensuite, utilisez une autre suture en soie de 40 pour faire couler la veine cave supérieure et inférieure et épinglez le bord de l’appendice auriculaire droit au bas de la chambre.

Étirez et épinglez l’autre extrémité de la suture au fond de la chambre et placez une électrode de stimulation sur mesure sur le bord de l’appendice auriculaire droit. Placez ensuite deux électrodes monopolaires à aiguille d’électrocardiogramme de 12 millimètres près de la base des ventricules droit et gauche et placez l’électrode d’électrocardiogramme au sol près de l’apex du ventricule. Pour colorer le tissu, injectez le colorant dilué dans un orifice de perfusion en ligne de la ligne de perfusion coronaire pour une administration sur une période de cinq à sept minutes.

Après 20 minutes de stabilisation, ajoutez 0,5 millilitre de blébbistatine à 37 degrés Celsius dans le perfusat, suivi de l’injection de 0,1 millilitre de blebbistatine diluée dans 1 millilitre de solution de Tyrode à 37 degrés Celsius dans la ligne de perfusion coronaire pendant cinq à sept minutes supplémentaires à l’aide d’un port d’injection Luer lock en ligne. La blébbistatine doit être utilisée avec prudence. Pour éviter la précipitation de l’inhibiteur, dissolvez d’abord la blébbistatine dans un milieu qui a été chauffé à 37 degrés et remuez vigoureusement le mélange.

Pour cartographier optiquement l’échantillon, fixez d’abord un petit verre couvert sur la surface de la solution au-dessus du tissu afin de réduire les artefacts de mouvement de la solution vibrante. Ensuite, à l’aide d’un guide de lumière bifurqué flexible avec une lumière d’excitation fournie par une lampe halogène à courant constant et à faible bruit, dirigez le faisceau lumineux filtré sur le tissu et imagez le signal fluorescent résultant. Après avoir canulé le cœur comme nous venons de le démontrer, disséquez les ventricules en l’éloignant de la face antérieure et ouvrez l’oreillette droite à travers la valve tricuspide le long de la valve tricuspide dans l’axe supérieur de la veine cave, suivie d’une incision à travers le membre médial de la crête terminale.

Pour ouvrir la paroi auriculaire antérieure libre, faites une incision de la ligne médiane de l’incision du membre médial jusqu’au bord du coin inférieur droit de l’appendice auriculaire droit et épinglez la paroi auriculaire aplatie au fond d’une chambre recouverte de silicone. Pour ouvrir l’appendice auriculaire gauche, coupez la valve mitrale le long du coin supérieur de la valve mitrale de l’appendice auriculaire gauche. Ensuite, épinglez l’oreillette gauche ouverte comme cela a été fait précédemment pour l’oreillette droite.

Ensuite, retirez partiellement le tissu ventriculaire. Conservez un rebord de tissu ventriculaire pour épingler la préparation afin d’éviter d’endommager les oreillettes et épinglez le tissu au fond d’une chambre recouverte de Sylgard. Maintenant, soulevez la préparation finale d’environ 0,5 millimètre du fond de la chambre recouverte de silicone pour permettre la superfusion à partir des surfaces épicardique et endocardique et superfusionnez l’échantillon avec une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius.

Placez ensuite une électrode de chlorure d’argent sur mesure sur le bord de l’appendice auriculaire droit disséqué. Placez une électrode monopolaire à aiguille d’électrocardiogramme de 12 millimètres près de chacun des appendices auriculaires droit et gauche, et placez l’électrode d’électrocardiogramme au sol près de la jonction ventriculaire auriculaire. Pour colorer le tissu cardiaque, utilisez une pipette de 1 millimètre pour libérer lentement le colorant sensible au voltage dilué dans une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius directement sur le tissu.

Ensuite, immobilisez l’échantillon avec l’application directe de blebbistatine diluée sur le tissu, suivie de l’administration de 0,5 millilitre supplémentaire de blebbistatine via le perfusat et cartographiez optiquement l’échantillon comme cela vient d’être démontré. Les étapes de coloration tissulaire et d’inhibition de la blébbistatine sont essentielles et nécessitent une mise en œuvre précise et une procédure de coloration précise afin que les paramètres physiologiques auriculaires, y compris la fréquence cardiaque, l’attribution du stimulateur cardiaque principal et la conduction auriculaire, ne soient pas affectés. Ici, une carte typique du contour de l’activation auriculaire droite reconstruite pour le rythme sinusal spontané pour un cœur de souris perfusé par Langendorff avec deux cartes de contour auriculaire droit correspondantes acquises à des taux d’échantillonnage de 1 et 0,5 milliseconde est présentée.

Le point d’activation précoce est situé dans la région intercavale, près de la veine cave supérieure, où le nœud sino-auriculaire est défini anatomiquement. Dans cette expérience, après une stimulation de l’appendice auriculaire droit pendant au moins une minute à 10 à 12 Hertz, la stimulation électrique a été arrêtée et le temps de récupération du nœud sino-auriculaire a été calculé comme l’intervalle de temps entre le dernier potentiel d’action capturé et le premier potentiel d’action spontanée. L’activation de la préparation auriculaire isolée pendant le rythme sinusal spontané permet d’identifier la zone précise de l’emplacement principal du stimulateur cardiaque.

Si la chirurgie et les procédures de mise en charge du colorant sont suivies de manière appropriée, aucun changement significatif dans les caractéristiques physiologiques de l’oreillette ne doit être observé. Bien que la coloration artérielle puisse nécessiter une plus grande quantité de colorant, le signal fluorescent dans le tissu de la zone du nœud sino-auriculaire semble être plus stable par cette méthode de charge avec un temps de décroissance de l’intensité du signal après la coloration coronaire presque deux fois plus long que celui après la coloration de surface. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 40 minutes si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, prenez soin de localiser l’anatomie auriculaire avant de faire une incision pour éviter d’endommager le tissu auriculaire et le ganglion sinusal. À la suite de cette procédure, d’autres mesures, telles que l’enregistrement conventionnel d’électrodes mitrales en verre, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les caractéristiques du potentiel transmembranaire commutatif. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie de l’intellect pour explorer les arythmies auriculaires, y compris le dysfonctionnement du nœud sino-auriculaire dans le cœur.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une cartographie optique haute résolution de la préparation d’un nœud sinusal de souris.