Name: Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Découvrez la cartographie optique haute résolution du nœud sino-auriculaire de souris par cœur perfusé de Langendorff. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes des anomalies du pacemaker et des arythmies atriales avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

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Toutes les expériences ont été menées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (NIH Pub. N ° 80-23). Toutes les méthodes et les protocoles utilisés dans ces études ont été approuvées par l&#39;Université du Wisconsin Animal Care et utilisation Comité du Protocole suivant les directives sur les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire publiées par le NIH (publication n ° 85-23, révisée en 1996). Tous les animaux utilisés dans cette étude ont reçu des soins humains en conformité avec le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Heart Enlèvement et Langendorff Perfusion <ol><li> Avant l&#39;isolement du coeur, une solution de Tyrode chaude à 37 ° C en utilisant un bain d&#39;eau et d&#39;une chemise d&#39;eau. </li><li> Anesthésier la souris avec 5% d&#39; isoflurane / 95% de O 2. </li><li> Veiller à ce niveau approprié de l&#39;anesthésie en vérifiant la perte de réflexe de la douleur. </li><li> Effectuer thoracotomie. Ouvrez le coffre à l&#39;aide de courbes 5.5 &quot;ciseaux Mayo et 5.5&quot; hémostatique KellyCèpes pour faire 1 cm découpés sur le devant du thorax. <ol><li> extraire rapidement le cœur de la poitrine (à moins de 30 secondes). Utilisez 4 &quot;courbes pince Iris pour saisir le tissu pulmonaire et découper le poumon, le thymus et le cœur en même temps que le péricarde en utilisant 4.3&quot; ciseaux Iris. Ne pas saisir directement le cœur. </li><li> Laver en oxygéné (95% O 2/5% CO 2), à température constante (36,8 ± 0,4 ° C) a modifié la solution de Tyrode. Utiliser la composition suivante en solution (en mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl2, 1,3 CaCl2, 20,0 NaHCO 3 et du glucose 11,1 (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Tout en baignant dans une même solution, d&#39;identifier les poumons, le thymus et les tissus adipeux. les disséquer avec soin du cœur. Utilisez courbe 3 &quot;ciseaux Vannas-Tübingen et 4.3&quot; # 5 forceps. </li><li> Ensuite, identifier l&#39;aorte et canuler il sur un 21 G canule sur-mesure. Utilisez deux 4.3 vigueur # 5B courbe &quot;ps. </li><li> Après canulation perfuser simultanément (par le biais de la canule à un débit d&#39;environ 5 ml / min, ce qui devrait être ajustée en fonction de la pression aortique, voir ci-dessous) et superfuse (dans le bain à un débit d&#39;environ 50 ml / min) le coeur avec la solution de Tyrode chauffée et filtrée à travers toute l&#39;expérience. Passer la solution de perfusion à travers un filtre en nylon de 11 pm en ligne pour éviter le colmatage de la circulation coronaire. </li><li> À l&#39;aide d&#39;un transducteur de pression (ou un manomètre) relié par l&#39;intermédiaire d&#39;un robinet à 3 voies Luer à la ligne de perfusion, de surveiller la pression aortique et la maintenir entre 60 et 80 mmHg. Ajustez la vitesse de perfusion si nécessaire pour maintenir la pression aortique dans cette plage. </li></ol> 2. Cartographie optique du SAN du Langendorff perfusé Coeur entier <ol><li> Instrumentation <ol><li> Placer horizontalement le coeur et la broche de la pointe du ventricule au fond siliconé de la chambre à l&#39;aide de 0,1 mm de diamètre à goupilles prevent mouvement pendant l&#39;expérience induite par flux. 12 </li><li> Insérer une petite (0,012 &quot;ID x 0,005&quot;), le tube de silicium dans le ventricule gauche (VG) par l&#39;intermédiaire de la veine pulmonaire, l&#39;oreillette gauche (LA) et la valve mitrale (MV). Fixer le tube par une suture de soie (4-0) pour le tissu conjonctif de sondage. </li><li> Positionner le coeur avec son côté postérieur vers le haut (figure 1A, panneau de gauche). </li><li> Broche le bord de l&#39;appendice RA (RAA) au fond de la chambre de silicium en utilisant des broches de diamètre minuties 0,1 mm. Régler son niveau afin de rendre la surface postérieure de la RA plat et lui permettre d&#39;être situé plan focal de la caméra. Cela va permettre des mesures optiques à partir de la surface maximale de l&#39;atrium. </li><li> Noose supérieure (SVC) et inférieure (VCI) de la veine cave par une suture de soie (4-0), étirer et épingler l&#39;autre extrémité de la suture au fond d&#39;une chambre de siliconé (voir la figure 3A). Assurez-vous que les sutures ne bloquent pas lachamp de vue optique. </li><li> Placez l&#39;électrode de stimulation sur mesure sur le bord de la RAA. Pour rendre les électrodes, l&#39;utilisation du silicium revêtu de 0,25 mm de diamètre des fils en argent, avec 0,5 mm de distance inter-électrodes et dépourvue de silicium pour une longueur de 1 mm à l&#39;extrémité de stimulation. Ensuite, placez deux aiguilles mm ECG 12 (29 gauge) électrodes monopolaires près de la base des ventricules droit et gauche. Placer le sol ECG électrode à proximité du sommet des ventricules. </li></ol></li><li> tachant <ol><li> Comme les deux colorants fluorescents et électro-mécanique découplant blebbistatin sont sensibles à la lumière, effectuer toutes les procédures décrites ci-dessous dans une pièce sombre. Préparer d&#39;abord sensible à la tension de colorant RH-237 ou di-4-ANNEPS comme une solution mère, 1,25 mg / ml dans du diméthylsulfoxyde (2,5 mM), aliquote il (30 pi chacun) et stocker les aliquots à -20 ° C. </li><li> Diluer 5-10 pi de solution de colorant disponible dans 1 ml de réchauffé (37 ° C) une solution de Tyrode, puis l&#39;injecter dans la ligne de perfusion coronairesur une période de 5-7 minutes en utilisant un orifice d&#39;injection en ligne Luer. </li><li> Préparer blebbistatin comme une solution mère (2 mg / ml dans le diméthylsulfoxyde, 6,8 mM) à l&#39;avance et le stocker à 4 ° C. </li><li> Après 20 minutes de stabilisation, ajouter 0,5 ml de réchauffé (37 ° C) blebbistatin dans le perfusat et diluer 0,1 ml de blebbistatin dans 1 ml de réchauffé (37 ° C), la solution de Tyrode. Puis injecter dans la ligne de perfusion coronaire pendant une période de 5-7 minutes en utilisant un orifice d&#39;injection en ligne Luer. </li></ol></li></ol> 3. cartographie optique du SAN du Atrial Préparation isolé <ol><li> Instrumentation <ol><li> Pour la préparation auriculaire isolée, isoler et cathétériser le cœur comme décrit ci-dessus dans les étapes 1.1-1.5 pour la préparation entière cœur. </li><li> Disséquer les ventricules loin de la face antérieure. Voir Figure 1A, panneau de droite, coupé # 1 pour plus de détails. </li><li> Ouvrez le RA en coupant à travers le va tricuspideLVE (TV) le long de l&#39;axe TV-SVC. Voir Figure 1A, panneau de droite, coupé # 2 pour plus de détails. </li><li> Couper la branche médiane de la crête terminale pour ouvrir le RAA. Voir Figure 1A, panneau de droite, coupé # 3. </li><li> Ouvrez la paroi libre auriculaire antérieure en effectuant une coupe de la ligne médiane de la coupe précédente n ° 3 sur le bord du coin inférieur droit du RAA, aplatir et épingler la paroi libre auriculaire au fond d&#39;une chambre de silicium revêtu. Voir la direction indiquée par la flèche creuse dans la figure 1A, coupe n ° 4. Préserver un rebord du tissu ventriculaire pour épingler la préparation pour éviter d&#39;endommager les oreillettes. </li><li> De même, ouvert LA en coupant à travers le MV le long du coin MV supérieur de l&#39;appendice LA (LAA). </li><li> Pour ouvrir le LAA, coupé à partir du milieu de l&#39;AAL ouvert, à travers la paroi libre auriculaire antérieure jusqu&#39;à près d&#39;un rebord milieu de la LAA. </li><li> Ouvrez la partie antérieure auriculaire paroi alo libreng la même direction, puis aplatir et épingler au fond d&#39;une chambre Sylgard revêtu. </li><li> Déposer partiellement le tissu septal interauriculaire. Cela permettra de réduire la diffusion du signal optique à partir de tissus qui ne sont pas au point. Par conséquent, à la fois le LA et RA ainsi que le réseau SAN et auriculo-ventriculaire jonction (AVJ) , sont accessibles dans cette préparation (figure 1B). </li><li> Soulever la préparation finale d&#39;environ 0,5 mm à partir du fond de la chambre de silicium revêtu afin de permettre surfusion à partir des deux surfaces épicardique et endocardique. </li><li> Superfuse la préparation avec réchauffé (37 ° C) une solution de Tyrode à une vitesse constante de ~ 12 ml / min pour un débit concentré situé près du SVC et ~ 30 ml / min pour une surfusion de bain. </li><li> Placez le Ag / AgCl 2 électrodes de stimulation sur mesure (0,25 mm de diamètre) sur le bord de la RAA disséqués. Ensuite, placez deux aiguilles ECG 12 mm (29G) des électrodes (monopolaire) près de la RAA et LAA, respectivement. Placez le sol ECG élusmonté près du AVJ. </li></ol></li><li> tachant <ol><li> Effectuer une application directe du colorant sensible à la tension (RH-237 ou di-4-ANNEPS). Pour cela, diluer 1-2 ul de la solution de colorant de stock en 1 mm de réchauffé (37 ° C) une solution de Tyrode et relâchez lentement le colorant dilué sur la surface de la préparation à l&#39;aide d&#39;un 1 mm pipette. </li><li> En variante, effectuer une coloration auriculaire avec le colorant sensible à la tension à travers une perfusion coronaire du coeur perfusé de Langendorff similaire à celle décrite ci-dessus pour la préparation entière cardiaque (étapes 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Après la coloration de la perfusion coronaire, isoler la préparation auriculaire comme décrit. Effectuer supplémentaire coloration de la surface en cas de besoin pour atteindre un niveau de fluorescence satisfaisante. l&#39;isolement auriculaire rapide ne pas l&#39;eau de Javel du colorant et n&#39;a aucune incidence sur la qualité de la coloration. </li></ol></li><li> Immobiliser la préparation avec l&#39;électro-mécanique découplant, blebbistatin. Diluer 3-5 pi blebbistatin solution mère dans le réchauffé (37 ° C) une solution de Tyrode et lentement libérer le blebbistatin dilué sur la surface de la préparation et de la solution environnante. Depuis blebbistatin a été montré pour être sensible, 13,14 éviter une exposition prolongée à la lumière la lumière lors de la préparation et la coloration. </li><li> Effectuer application blebbistatin supplémentaire autant que nécessaire pour supprimer la contraction. Normalement jusqu&#39;à 3 applications supplémentaires (3-5 pi par chaque application) peut être utilisé pour supprimer l&#39;artefact de mouvement suffisamment pour reconstituer avec précision SAN et activation auriculaire. </li><li> Ajouter 0,5 ml supplémentaires de blebbistatin réchauffé dans le perfusat. Au cours de cette procédure, mettre en pause la surfusion pendant 30 secondes pour permettre au colorant / blebbistatin pour colorer le tissu auriculaire. </li></ol></li></ol> 4. Cartographie optique Set Up NOTE:. Une description détaillée du système de cartographie optique est prévue ailleurs 12 <ol><li> Utilisez un appareil photo avec un systèmeporal résolution de 2000 images / s ou plus, et une série de lentilles de condenseur pour atteindre une résolution spatiale de 100 um / pixel ou plus. Cela est nécessaire pour reconstruire l&#39;activation SAN et la propagation intranodale. </li><li> Pour réduire l&#39;artefact de mouvement de la solution vibrante, fixer un petit verre de couverture sur la surface de la solution sur le cœur / isolé préparation auriculaire. </li><li> Utiliser la lumière d&#39;excitation (520 ± 45 nm de longueur d&#39;onde) fournie par une lampe à halogène à faible bruit de courant constant. Diriger le faisceau de lumière filtrée sur la préparation à l&#39;aide d&#39;un guide de lumière bifurquée flexible. </li><li> Filtrer la fluorescence émise par un filtre passe-haut (&gt; 715 nm). Collecter, numériser et enregistrer le signal fluorescent acquis sur un logiciel d&#39;ordinateur à l&#39;aide fournie par le fabricant de l&#39;appareil. </li></ol> 5. Traitement des données REMARQUE: Les données de cartographie optique est collectée et stockée sous forme d&#39;une série de matrices d&#39;intensité de fluorescence à différents moments. Chaque pixel represeNTS une mesure de l&#39;intensité de fluorescence recueillie à partir d&#39;un emplacement spécifique sur la préparation de tissu à un point de temps spécifique. la fluorescence d&#39;arrière-plan est automatiquement retiré par pixel afin de permettre une meilleure visualisation des changements de fluorescence produites par les variations de tension de la membrane et vers le bas pour correspondre à des potentiels d&#39;action (PA) mesurés par les systèmes de micro-électrodes. Les détails des différentes étapes du traitement des données d&#39;imagerie optique, y compris la segmentation d&#39; images, filtrage spatial, filtrage temporel, et la dérive retrait de la ligne de base, sont fournis dans la revue ciblée 15. <ol><li> Manuellement ou en utilisant l&#39;algorithme spécial (par exemple, une détection de seuil ou le bord) 15 pour déterminer les limites de tissus, créer un masque binaire de 1 (pixels inclus) et 0 (pixels exclus) et appliquer le masque à chaque trame dans la séquence. Ce processus crée une image binaire qui met en lumière des domaines d&#39;intérêt pour un traitement ultérieur. </li><li> Pour améliorer le rapport signal-bruit de l&#39;optdonnées iques, filtrer les signaux dans les zones d&#39;intérêt sélectionnées. Pour cela, utilisez l&#39; espace (ie la moyenne des pixels fluorescents voisins tels que définis par un bac de convolution désiré ou noyau, par exemple 3 x 3 ou, pour les données bruitées, 5 x 5) et / ou filtrage temporel (par exemple, Butterworth, le type Chebyshev 1, Chebyshev type 2, Elliptic etc.) (Figure 2). Gardez à l&#39;esprit la possibilité d&#39;artefacts filtrés induite par l&#39;interprétation des données. Pour plus de détails, voir la revue 15. </li><li> Retirer la dérive de la ligne de base dans les enregistrements optiques en cas de besoin (en utilisant le filtrage passe-haut ou d&#39;un raccord polynôme du signal original), puis normaliser chaque signal de pixel de 0 (fluorescence minimum) à 1 (fluorescence maximale). </li><li> Sélectionner une fenêtre temporelle qui englobe le temps d&#39;activation de tous les pixels d&#39;une seule propagation AP. Attribuez à chaque pixel de son temps d&#39;activation comme le temps de dérivé upstroke maximale (dF / dt max, où F est fluorescenl&#39;intensité de la CE). En utilisant tous les temps d&#39;activation de pixel, reconstruire la carte d&#39;activation isochrone. Chaque isochrone va donc montrer les pixels activés en même temps. </li><li> Pour reconstituer la carte de répartition durée AP (TTA) pour chaque pixel , calculer la durée entre le temps d&#39;activation et du temps à un niveau spécifique de la repolarisation (par exemple, à 80% de repolarisation, APD 80). En utilisant toutes les valeurs APD de pixels, reconstituer la carte de distribution isochrone APD. Chaque isochrone va donc montrer les pixels avec le même APD. </li><li> Pour calculer la vitesse de conduction pour la propagation AP, adapter à une surface de la préparation des données de temps d&#39;activation calculées en 5.4. Pour cela, utilisez polynôme surface de montage ou local lissage de surface du noyau, puis calculer des vecteurs de vitesse de conduction locale du gradient de la surface équipée. </li><li> Pour créer la carte de repolarisation, attribuer à chaque pixel son temps de repolarisation, définie comme la dérivée seconde maximale (d 2 F / dt2) du signal optique à l&#39;extrémité de la PAO, ou le temps de 90% de repolarisation. </li></ol>

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<li>Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+heart+rate+in+a+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart.</a> J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).</li>
<li>Kanlop, N., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+study+of+blebbistatin-induced+chaotic+electrical+activities+in+isolated+rat+atrium+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations.</a> J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).</li>
<li>Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’est déclaré.

Ici, nous avons présenté deux types de préparations souris SAN: 1) intact SAN dans le coeur entier Langendorff perfusé, et 2) SAN dans l&#39;isolement, ouvert préparation auriculaire. Ces deux types de préparations servent différentes fins expérimentales. Dans la préparation du cœur entier Langendorff perfusé, la structure auriculaire intacte est préservée ce qui le rend possible l&#39;étude des troubles du rythme auriculaire complexes , telles que la fibrillation auriculaire, ainsi que les interactions entre le réseau ...

Les nouvelles percées scientifiques qui conduisent à des bonds dans la compréhension de la physiologie humaine sont souvent précédées de progrès technologiques. La cartographie optique fluorescente, par exemple, permet d’étudier de multiples paramètres physiologiques dans les cellules et les tissus. 1,2 Il a considérablement amélioré notre compréhension de la façon dont la structure anatomique est associée aux fonctions et aux dysfonctionnements électrophysiologiques. Dans le cœur, le stimulateur cardiaque naturel et les systèmes de conduction tels que le nœud sino-auriculaire (SAN) et la jonction auriculo-ventriculaire sont constitués de myocytes ganglionnaires qui sont isolés par les myocytes auriculaires environnants. 3-5 Une telle organisation crée des structures tridimensionnelles complexes avec des propriétés électriques spécialisées. Il a été reconnu que le remodelage structurel et fonctionnel de ces structures de stimulateur cardiaque forme des hétérogénéités électrophysiologiques significatives. 6,7 Comprendre le mécanisme sous-jacent à la façon dont de telles hétérogénéités entraînent des dysfonctionnements du SAN et de l’arythmogenèse auriculaire bénéficiera considérablement au traitement clinique de ces maladies. Elle nécessite une technique pour visualiser la propagation des signaux électriques au niveau tissulaire, comme la cartographie optique. 
Récemment, l’accumulation de preuves a prouvé l’avancement de la cartographie optique dans les études d’électrophysiologie et de pathologie auriculaires. 2 Cependant, les études nouvelles et rigoureuses dépendent de l’interprétation précise des données expérimentales, dont la validité et la stabilité dépendent de protocoles d’expérience minutieux. Les souris génétiquement modifiées sont largement utilisées pour la recherche en tant que modèles animaux de maladies humaines, notamment le syndrome des sinus malades, les anomalies des stimulateurs cardiaques et les arythmies auriculaires. 6,8-11 Ainsi, la combinaison de la cartographie optique fluorescente avec des modèles de souris transgéniques fournit un outil puissant pour étudier les anomalies électriques cardiaques associées à diverses pathologies. Dans cet article, nous présentons un protocole de cartographie optique à haute résolution du SAN et de l’oreillette de la souris. Plus précisément, nous discutons et comparons différentes approches de chargement de colorant, les effets du temps sur le blanchiment et la stabilité de la fréquence cardiaque pendant l’expérience.

<table><tbody><tr><td>chemise d’eau</td><td>Radnoti</td><td>série 1660 Bain de tissu pour procédures d’isolement de grands organes ou de cellules uniques Bain-marie</td><td></td></tr><tr><td>/ circulateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amplificateur de pression AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> NY1102500 <td></td></tr><tr><td>Transducteur de pression</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>goupilles Minutien en acier inoxydable - 0,1 mm de diamètre</td><td>Outils de sciences fines</td><td>26002-10&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à perfusion</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à superfusion</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas Tübingen.</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Mayo</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Pince hémostatique Kelly</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Pince à iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris ciseaux</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG Aiguilles de 12 mm (calibre 29) électrodes (monopolaires)&nbsp ;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>port d’injection Luer en ligne</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L Caméra CMOS&nbsp ;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>lampe halogène</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

haute résolution de cartographie optique de la souris noeud sino-auriculaire

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Les dysfonctionnements des ganglions sino-auriculaires (SAN) et les complications associées constituent des causes importantes de morbidité chez les patients atteints de maladies cardiaques. Le développement de nouvelles thérapies pharmacologiques pour guérir ces patients repose sur une compréhension approfondie de la physiologie normale et de la physiopathologie du SAN. Parmi les études de stimulation cardiaque, le SAN de souris est largement utilisé en raison de sa faisabilité pour des modifications de l’expression de différents gènes codant pour les canaux ioniques SAN ou les protéines de manipulation du calcium. De nouvelles preuves issues d’études électrophysiologiques et histologiques ont également prouvé la représentativité et la similitude de la structure et des fonctions du SAN de souris avec celles des mammifères plus grands, y compris la présence de voies de conduction spécialisées du SAN à l’oreillette et une hiérarchie complexe des stimulateurs cardiaques au sein du SAN. Récemment, la technique de cartographie optique a grandement facilité l’exploration et l’étude de l’origine de l’excitation et de la conduction à l’intérieur et à partir du SAN de souris, ce qui a permis d’élargir la compréhension du SAN et de bénéficier aux traitements cliniques des maladies associées au dysfonctionnement du SAN. Dans ce manuscrit, nous avons décrit en détail comment effectuer la cartographie optique du SAN de souris à partir du cœur intact perfusé par Langendorff et de la préparation auriculaire isolée. Ce protocole est un outil utile pour améliorer la compréhension de la physiologie et de la physiopathologie des SAN chez la souris.

Cartographie optique du SAN Intact du Coeur de Langendorff perfusé Un exemple typique d&#39;une carte de contour d&#39;activation de la RA reconstruit pour un rythme sinusal spontané est représenté sur la figure 3 pour un coeur de souris Langendorff perfusé. Le point d&#39;activation précoce est situé dans la région intercaval près du SVC où le SAN est anatomiquement défini. 3,16 Deux RA cartes de contours d&#39;activation acquis à 1,0 ...

Ici, nous présentons un protocole de cartographie optique de l&#39;activité électrique de l&#39;oreillette droite de la souris et en particulier le nœud sino-auriculaire, à une résolution spatiale et temporelle.

Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

L'objectif général de ce protocole expérimental est d'effectuer une cartographie optique du nœud sinusal chez la souris à partir d'un cœur intact perfusé selon la méthode de Langendorff ou d'une préparation auriculaire isolée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'électro- et de la physiopathologie du nœud sinusal, notamment concernant les mécanismes des anomalies du pacemaker, du syndrome du sinus malade et des diverses maladies associées aux arythmies auriculaires. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à étudier plusieurs paramètres dans des tissus intacts avec une résolution spatiale très élevée et une résolution temporelle précise.Après avoir confirmé le niveau approprié d'anesthésie par une pincée du orteil, utilisez des ciseaux courbes Mayo de 5,5 pouces et des pinces hémostatiques Kelly de 5,5 pouces pour pratiquer une incision d'un centimètre à l'avant du thorax. À l'aide de pinces courbes Iris de quatre pouces, saisissez rapidement le tissu pulmonaire et utilisez des ciseaux Iris d'un tiers de quatre pouces pour enlever ensemble le poumon, le thymus et le cœur, ainsi que le péricarde. Lavez les tissus dans une solution de Tyrode modifiée oxygénée à 37 degrés Celsius.Ensuite, utilisez des ciseaux courbes Vannas Tubingen de trois pouces et une pince numéro cinq de quatre tiers de pouce pour retirer les poumons, le thymus et le tissu adipeux du cœur. Puis, utilisez une canule personnalisée de calibre 21 et deux pinces courbes B numéro cinq de 4,3 pouces pour canuler l'aorte et perfuser simultanément et superfuser le cœur avec une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius, en dirigeant la solution à travers un filtre en nylon de 11 microns en ligne avant la perfusion afin d'éviter l'obstruction de la circulation coronaire. Ensuite, reliez un transducteur de pression à un raccord Luer lock sur la ligne de perfusion via un robinet en té à trois voies pour surveiller la pression aortique, et ajustez la vitesse de perfusion selon les besoins afin de maintenir la pression aortique entre 60 et 80 millimètres de mercure.Pour la cartographie optique du nœud sinusal à partir d’un cœur perfusé selon Langendorff, positionnez l’organe horizontalement avec la face postérieure orientée vers le haut dans une chambre en verre pour bain tissulaire, puis utilisez des broches de 0,1 millimètre de diamètre pour fixer l’apex ventriculaire au fond recouvert de silicone de la chambre afin d’empêcher tout déplacement induit par le flux durant l’expérience. Insérez un petit tube en silicone dans le ventricule gauche par l’intermédiaire de la veine pulmonaire, de l’oreillette gauche et de la valve mitrale, puis utilisez une suture en soie 40 pour fixer le tube au tissu conjonctif environnant. Ensuite, utilisez une autre suture en soie 40 pour ligaturer les veines caves supérieure et inférieure et fixez le bord de l’appendice de l’oreillette droite au fond de la chambre.Étirez et fixez l'autre extrémité du fil de suture au fond de la chambre, puis placez une électrode de stimulation sur mesure sur le bord de l'appendice auriculaire droit. Ensuite, placez deux électrodes aiguilles monopolaires de 12 millimètres pour électrocardiogramme près de la base des ventricules droit et gauche, et positionnez l'électrode de mise à la terre de l'électrocardiogramme près de l'apex du ventricule. Pour colorer le tissu, injectez le colorant dilué dans un port de perfusion en ligne de la ligne de perfusion coronaire afin de l'administrer sur une période de cinq à sept minutes.Après 20 minutes de stabilisation, ajouter 0,5 millilitre de blebbistatine à 37 degrés Celsius dans le perfusat, puis injecter 0,1 millilitre de blebbistatine diluée dans 1 millilitre de solution de Tyrode à 37 degrés Celsius dans la ligne de perfusion coronaire sur une durée supplémentaire de cinq à sept minutes à l’aide d’un port d’injection Luer lock en ligne. La blebbistatine doit être utilisée avec précaution. Pour éviter la précipitation de l’inhibiteur, dissoudre d’abord la blebbistatine dans un milieu réchauffé jusqu’à devenir clair à 37 degrés et agiter vigoureusement le mélange.Pour cartographier optiquement l'échantillon, fixez d'abord un petit morceau de verre recouvert sur la surface de la solution au-dessus du tissu afin de réduire les artefacts de mouvement dus aux vibrations de la solution. Ensuite, à l'aide d'un guide de lumière bifurqué flexible éclairé par une lampe halogène à courant constant et à faible bruit, dirigez le faisceau lumineux filtré vers le tissu et enregistrez le signal fluorescent résultant. Après avoir canulé le cœur comme vient de l'être démontré, disséquez les ventricules depuis le côté antérieur et ouvrez l'oreillette droite en passant par la valve tricuspide selon l'axe valve tricuspide–veine cave supérieure, puis pratiquez une incision à travers la branche médiale de la crête terminale.Pour ouvrir la paroi libre antérieure de l'oreillette, pratiquer une incision partant du milieu de l'incision du bord médial jusqu'au bord inférieur droit de l'appendice de l'oreillette droite, puis fixer la paroi libre de l'oreillette aplaties au fond d'une chambre recouverte de silicone. Pour ouvrir l'appendice de l'oreillette gauche, couper à travers la valve mitrale le long du coin supérieur de la valve mitrale de l'appendice de l'oreillette gauche. Ensuite, fixer l'oreillette gauche ouverte comme cela avait été fait précédemment pour l'oreillette droite.Ensuite, retirez partiellement le tissu ventriculaire. Conservez un rebord de tissu ventriculaire pour fixer la préparation afin d'éviter tout dommage aux oreillettes, puis fixez le tissu au fond d'une chambre recouverte de Sylgard. Soulevez maintenant la préparation finale d'environ 0,5 millimètre du fond de la chambre recouverte de silicone pour permettre la perfusion des surfaces épicardique et endocardique, et perfusez l'échantillon avec une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius.Ensuite, placer une électrode personnalisée de stimulation en chlorure d'argent sur le bord de l'appendice auriculaire droit disséqué. Placer une électrode aiguille monopolaire de 12 millimètres pour électrocardiogramme près de chacun des appendices auriculaires droit et gauche, et placer l'électrode de mise à la terre pour électrocardiogramme près de la jonction auriculo-ventriculaire. Pour colorer le tissu cardiaque, utiliser une pipette de 1 millimètre pour libérer lentement un colorant sensible à la tension dilué dans une solution de Tyrode à 37 degrés Celsius directement sur le tissu.Ensuite, immobilisez l'échantillon en appliquant directement du blebbistatin dilué sur le tissu, suivi de l'administration d'un autre 0,5 millilitre de blebbistatin via le perfusat, puis cartographiez optiquement l'échantillon comme vient de l'être démontré. Les étapes de coloration du tissu et d'inhibition par le blebbistatin sont critiques et exigent une mise en œuvre précise ainsi qu'une procédure de coloration exacte afin que les paramètres physiologiques atriaux, notamment la fréquence cardiaque, la localisation du pacemaker dominant et la conduction atriale, ne soient pas affectés. Ci-dessous, une carte typique des lignes de niveau d'activation atriale droite reconstruite pour un rythme sinusal spontané chez un cœur de souris perfusé selon la méthode de Langendorff, accompagnée de deux cartes des lignes de niveau atriales droites correspondantes obtenues à des fréquences d'échantillonnage de 1 et 0,5 milliseconde, sont présentées.Le point d'activation précoce se situe dans la région intercave près de la veine cave supérieure, où le nœud sinusal est défini anatomiquement. Dans cette expérience, après un rythme de stimulation de l'oreillette droite pendant au moins une minute à une fréquence de 10 à 12 hertz, la stimulation électrique a été interrompue et le temps de récupération du nœud sinusal a été calculé comme l'intervalle de temps entre le dernier potentiel d'action capté et le premier potentiel d'action spontané. L'activation de la préparation atriale isolée durant un rythme sinusal spontané permet d'identifier précisément la zone du pacemaker principal.Si les procédures chirurgicales et de chargement au colorant sont correctement suivies, aucun changement significatif des caractéristiques physiologiques de l'oreillette ne devrait être observé. Bien que la coloration artérielle puisse nécessiter une quantité plus importante de colorant, le signal fluorescent dans le tissu de la région du nœud sinusal semble plus stable avec cette méthode de chargement, le temps de décroissance de l'intensité du signal après coloration coronaire étant presque deux fois plus long que celui observé après coloration superficielle. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 40 minutes si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à identifier l'anatomie atriale avant de pratiquer une incision afin d'éviter d'endommager le tissu atrial et le nœud sinusal. Après cette procédure, d'autres mesures, telles que les enregistrements conventionnels par électrode mitrale en verre, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant les caractéristiques du potentiel transmembranaire commutatif. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la physiologie intellectuelle d'explorer les arythmies atriales, notamment le dysfonctionnement du nœud sino-auriculaire dans le cœur.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une cartographie optique à haute résolution d'une préparation du nœud sinusal de souris.

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Biologie

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Enregistrement par réseau de microélectrodes de la vitesse de tir du nœud sino-auriculaire pour identifier les défauts cardiaques intrinsèques de la fabrication du rythme chez la souris

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L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs

Découvrez la cartographie optique haute résolution du nœud sino-auriculaire de souris par cœur perfusé de Langendorff. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes des anomalies du pacemaker et des arythmies atriales avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

Haute résolution de cartographie optique de la souris Noeud sino-auriculaire

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