Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

L’objectif global de cette procédure est de visualiser le cytosquelette d’actine dans les cellules de mammifères adhérents au niveau ultrastructurel, à l’aide d’une méthode de microscopie tridimensionnelle à super résolution appelée iPALM. L’imagerie iPALM fournit une résolution spatiale nanométrique inférieure à la tendance dans les trois dimensions. Cela permet de visualiser les ultrastructures à l’aide de sondes de fluorescence, ce qui permet une spécificité de marquage élevée.

La procédure présentée dans cette vidéo devrait être rapidement adaptable et instructive pour visualiser d’autres caractéristiques ultrastructurales dans les cellules par localisation de molécules uniques basée sur la microscopie à super résolution. Commencez cette procédure en préparant les cellules sur des verres de couverture dans une plaque à six puits. Pour assembler l’échantillon d’imagerie, à l’aide d’une pince fine, retirez délicatement le verre de couverture de l’échantillon du puits tampon.

Ensuite, tapotez rapidement et doucement l’excès de tampon en touchant le bord du verre de protection avec du papier absorbant plié. Placez le verre de couverture, côté cellule vers le haut, sur une feuille de papier à lentille propre. Rincez l’échantillon en plaçant 30 à 50 microlitres de tampon d’imagerie sur l’échantillon.

Retirez l’excès de tampon en l’inclinant et en tapotant avec du papier absorbant plié. Après avoir répété l’étape de rinçage plusieurs fois, placez 30 à 50 microlitres de tampon d’imagerie sur l’échantillon. Séchez le bord de la vitre de protection et placez plusieurs très petits points d’époxy à durcissement rapide sur la zone séchée.

Abaissez lentement un autre verre de protection numéro 1,5 pré-nettoyé au centre de la cellule contenant un verre de protection de 22 millimètres. Laissez le tampon d’imagerie mouiller les deux verres de couverture par capillarité. Les petits points d’époxy à durcissement rapide doivent adhérer aux deux verres de couverture.

Appuyez doucement sur l’échantillon assemblé à l’aide d’un papier absorbant plié pour répartir uniformément la pression. Utilisez une pression suffisante pour rendre la cellule d’échantillon mince et uniforme, mais pas au point d’écraser les cellules. Mesurez l’épaisseur appropriée en observant le motif des anneaux de Newton.

Assurez-vous d’effectuer cette étape en douceur pour minimiser les bulles d’air. Si nécessaire, entraînez-vous plusieurs fois à l’avance avec des lunettes de protection vides. Ensuite, scellez l’échantillon avec de la vaseline lanoline paraffine fondue.

Rincez ensuite l’échantillon scellé avec de l’eau déminéralisée. Séchez l’échantillon à l’air comprimé pour le préparer à être monté sur le microscope. Déplacez la lentille supérieure de l’objectif à ressort vers le haut pour permettre le retrait du porte-échantillon.

Placez l’échantillon scellé sur le porte-échantillon et fixez-le à l’aide de plusieurs petits aimants en terres rares. Appliquez de l’huile d’immersion des deux côtés de l’échantillon d’imagerie. Remettez le porte-échantillon dans le chemin optique et abaissez doucement la lentille supérieure de l’objectif.

Allumez les lasers d’excitation. Allumez également les caméras EMCCD en mode de transfert d’images. Ensuite, faites pivoter les filtres d’émission appropriés.

Activez un obturateur mécanique pour bloquer la trajectoire du faisceau supérieur et ouvrir la trajectoire du faisceau inférieur. Faites la mise au point sur la lentille de l’objectif inférieur par translation par petits incréments à l’aide de l’actionneur piézoélectrique. Une fois que le repère est mis au point, ouvrez le trajet du faisceau supérieur tout en bloquant le trajet du faisceau inférieur et faites la mise au point de la lentille de l’objectif supérieur de la même manière.

Surveillez la largeur du repère sur l’écran de l’ordinateur pour une mise au point optimale. Pour un centrage correct, ouvrez les trajets des faisceaux supérieur et inférieur. Ajustez manuellement l’objectif supérieur pendant que l’objectif inférieur est maintenu constant à l’aide d’une paire de vis de réglage microfines jusqu’à ce que les images repères se chevauchent le plus fidèlement possible, idéalement à un pixel près.

Par la suite, effectuez des ajustements précis de sorte que les images repères se chevauchent à un dixième de pixel EMCCD. Ajustez les miroirs montés piézoélectriques sur les deux axes supérieurs via le logiciel de contrôle tout en maintenant constants les objectifs et les miroirs réfléchissants inférieurs. Comparez les centres des repères des vues d’objectif supérieure et inférieure via l’écran de l’ordinateur pour guider le processus.

Lorsque les lasers sont allumés, que les caméras diffusent en continu et que les trajets de faisceau supérieur et inférieur sont ouverts, faites osciller le porte-échantillon Z piézo à l’aide d’une forme d’onde de tension sinusoïdale générée par le logiciel de contrôle pour une oscillation continue de l’axe Z sur une magnitude de 400 nanomètres. Faites glisser manuellement l’ensemble séparateur de faisceau motorisé vers le haut ou vers le bas jusqu’à ce que l’intensité du repère oscille. En raison de l’effet d’interférence d’un seul photon souhaité, cela signifie que les longueurs du chemin optique sont étroitement adaptées.

Un rapport pic/vallée supérieur à 10 peut être atteint dans les cas optimaux. Pour vous assurer que l’amplitude et la phase à chaque surface sont aussi uniformes que possible sur le terrain, ajustez le miroir inférieur de l’ensemble séparateur de faisceau par petites étapes pour affiner l’écart et les angles d’inclinaison. Effectuez un alignement fin du séparateur de faisceau en traduisant l’échantillon en pas de huit nanomètres en Z sur 800 nanomètres.

Surveillez l’intensité des points de repère entre les caméras un à trois. Ajustez la hauteur, la position et l’inclinaison du miroir inférieur à l’intérieur de l’ensemble séparateur de faisceau par petits pas de sorte que la phase d’oscillation de la caméra un par rapport à la caméra deux soit maximisée, idéalement à 120 degrés. Une fois l’alignement initial terminé, transférez l’échantillon à balayer pour trouver un champ de vision approprié qui contient à la fois les cellules à imager et plusieurs repères à proximité.

Placez un boîtier autour du système pour bloquer la lumière parasite et les perturbations ambiantes. Une fois la zone d’imagerie trouvée, transférez à nouveau l’échantillon et enregistrez la courbe d’étalonnage pour l’utiliser dans les extractions ultérieures de coordonnées Z. À l’aide de la commande d’acquisition de l’étalonnage, les balayages en fonction de la position piézoélectrique de l’échantillon dans l’interface principale.

Une fois qu’une zone souhaitée est trouvée et que la courbe d’étalonnage est obtenue, entrez les noms de fichiers appropriés dans le logiciel. Ouvrez les trajets supérieur et inférieur du faisceau, puis augmentez la puissance d’excitation du laser de 642 nanomètres au maximum. Pour Alexa Fluor 647, une période initiale d’arrêt du Fluor-4 peut être nécessaire.

Exposer avec une excitation constante de 642 nanomètres pendant cinq minutes, ou plus si nécessaire, jusqu’à ce qu’un clignotement de la molécule unique soit observé. Le logiciel permet une augmentation automatique de 405 nanomètres de photoactivation au cours de l’acquisition. Un grand nombre de trames d’acquisition sont généralement nécessaires pour que les caractéristiques filamenteuses soient clairement visibles.

Lorsque vous êtes prêt, commencez l’acquisition d’ensembles d’images brutes à l’aide de la commande start iPALM acquisition dans l’interface principale. Pendant l’acquisition, réglez le niveau d’activation de la photo en ajustant l’intensité du laser de 405 nanomètres pour maintenir la densité de clignotement appropriée au besoin. Lorsque la lamelle de recouvrement de l’échantillon est correctement assemblée, les anneaux de Newton peuvent être observés à l’œil nu sous la lumière ambiante ou un éclairage fluorescent standard.

L’extraction des positions axiales des émetteurs de fluorescence nécessite une interférence multiphasée simultanée dans l’imagerie iPALM, qui est calibrée par les changements d’intensité d’un repère donné dans trois EMCCD. Les intensités sont ensuite normalisées et ajustées pour déterminer les différences de phase. Voici l’image de reconstruction iPALM avec chaque coordonnée de localisation rendue par une gaussienne 2D dont la largeur correspond à l’incertitude de localisation.

La coordonnée Z est colorée en fonction de la barre de couleur. Des zones de caractéristiques filamenteuses denses et clairsemées peuvent être observées. On voit ici des images de reconstruction iPALM du cytosquelette d’actine des cellules HUVEC marquées par la phalloidine Alexa Fluor 647.

La couleur de l’image indique les coordonnées Z en fonction de la barre de couleur. L’histogramme de la section transversale est généré à partir des coordonnées de localisation XY le long de l’axe long de la zone encadrée. L’ajustement gaussien montre la pleine largeur à la moitié maximum de 43,88 nanomètres associée à la section transversale.

Cet histogramme correspond à la position Z des coordonnées de localisation dans la zone encadrée. Le raccord gaussien montre la pleine largeur à la moitié maximum de 17,50 nanomètres. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 90 minutes si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment visualiser le cytosquelette d’actine au niveau de l’ultrastructurel à l’aide d’iPALM grâce à une préparation et un montage simples, à l’alignement optique, à l’acquisition de données brutes et à l’analyse ultérieure pour reconstruire des images à super résolution. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer l’architecture à l’échelle nanométrique du cytosquelette d’actine, ainsi que les structures d’adhésion cellulaire telles que les adhésions focales.