Name: Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Apprenez à déterminer le nombre et l'activité cytotoxique des cellules NK dans le sang humain par cytométrie en flux. Cette méthode rapide et reproductible facilite la recherche en immunologie clinique.

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Ce projet a été soutenu par la subvention compétitive n° 2100-68003-30395 de l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA.

NOTE: Toutes les procédures de collecte de sang ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices énoncées par l'Appalachian State University Board Review (ASU) Institutionnel (CISR). 1. Toute la collection de sang <ol><li> Avoir un phlébotomiste certifié prélever du sang selon les directives de l'Organisation mondiale de la Santé. </li><li> Prélever le sang dans un tube de 4 ml de collecte de sang contenant de l' acide Dipotassique éthylènediaminetétraacétique (EDTA K 2). Invertir le tube de prélèvement de sang selon les instructions du fabricant. Gardez le tube de collecte de sang à la température ambiante sur une bascule paillasse jusqu'à la séparation. </li></ol> 2. Préparation des cellules cibles marquées DiO <ol><li> Cultiver des cellules K562 dans son Complete Iscove modifié Médias Dulbecco (IMDM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline streptomycine pendant plusieurs semaines avant l'essai pour assurer la santé des cellules. Réglez le concentration des cellules à 3 x 10 5 cellules / mL par jour grâce à la réalisation d'une cellule de comptage et le passage ultérieur des cellules. Effectuer un changement de support complet tous les 2 à 3 jours. </li><li> Le jour de l'essai, effectuer une numération cellulaire en utilisant un mélange 1: 1 hémocytomètre. <ol><li> Retirer 10 ul du flacon K562 et le placer dans le tube 1,5 ml. </li><li> Ajouter 10 pl de colorant bleu trypan dans le même tube de 1,5 ml pour un facteur de dilution de 1: 1. </li><li> Doucement le tube flick pour mélanger des cellules K562 et colorant bleu trypan. </li><li> Laisser K562 colorant bleu cellule trypan à incuber pendant 1 min à température ambiante. </li><li> Retirer 15 ul de cellules K562 colorées du tube. </li><li> Pipette sur hémocytomètre pour le nombre de cellules. </li><li> Compter les cellules dans les quatre cases de coins, ainsi que la place centrale pour un total de cinq places. </li><li> Calculer le nombre de cellules en utilisant l'équation suivante: cellules totales / ml = Total cellules comptées X (facteur de dilution / Nombre de places) X 10000 / mL </li></ol></li> Remettre en suspension les cellules cibles K562 à une densité finale de 1 x 10 6 cellules / ml dans un milieu de culture IMDM exempt de sérum. <li> Pour les cellules cibles K562 non marquées, ajouter 10 ml de cellules cibles K562 à une 15 tubes ml à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml pour un total de 10 x 10 6 cellules K562. Placer dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 jusqu'à ce que prêt à l' emploi. </li><li> Pour les cellules cibles DiO teinté K562, ajouter 10 ml de K562 cible les cellules à un 15 tube de ml à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml pour un total de 10 x 10 6 cellules K562. <ol><li> Ajouter 1 pl de DiO solution cellulaire étiquetage par ml de suspension cellulaire dans 15 ml tube désigné pour DiO coloration et doucement vortex. Par exemple, ajouter 10 ul de solution DiO cellule marquage à 10 x 10 6 cellules K562 / ml à un volume de 1 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Incuber solution K562-DIO pendant 20 min à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans un tube de 15 ml. </li></ol></li><li> Suivreing incubation, ajouter 3 ml de solution saline température ambiante tamponnée au phosphate (PBS) à la solution K562-DiO contenant 15 ml tube. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 135 xg à la température ambiante. </li><li> Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire avec un volume réglable pipette 1000 pi. </li><li> Ajouter 10 ml de IMDM frais à culot cellulaire contenant 15 ml tube. </li><li> Doucement tube vortex pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Répétez les étapes 2.7 à 2.10 deux fois plus. </li><li> Stocker les piles dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2 jusqu'à ce que prêt à l' emploi. Note: Les cellules peuvent être stockées dans l'incubateur pendant au moins 24 h, mais il est préférable de les utiliser sur le même jour. </li></ol> 3. Préparation des commandes <ol><li> Transférer le suivant dans 1,5 ml tubes séparés et étiquetés de manière appropriée: <ol><li> Ajouter 500 pi de IMDM frais contenant remis en suspension DiO marqué des cellules K562 dans le "Double positif" étiqueté tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 500 pi de IMDM frais contenant remis en suspension les cellules K562 DiO marquées dans le "DiO seulement" tube de 1,5 ml étiqueté. </li><li> Ajouter 500 pi de IMDM frais contenant des cellules K562 non marquées remises en suspension dans le "iodure de propidium (PI) que" tube de 1,5 ml étiqueté. </li></ol></li><li> Placer le positif Double et PI seulement tubes dans un bain d'eau à 55 ° C pendant 5 min. </li><li> Après 5 min écoulé, retirer les tubes et essuyez avec 70% d'éthanol. </li><li> Ajouter 10 L de PI à la Positive Double et PI seulement 1,5 ml tubes. </li><li> Placer tous les trois contrôles K562 de cellules cibles dans l'incubateur à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Après 30 minutes d'incubation est écoulée, centrifuger les trois K562 contrôles de cellules cibles pendant 2 min à 163 x g. </li><li> Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Resuspendre chaque contrôle avec 20 ul de milieu frais de culture cellulaire IMDM, et laisser dans le 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2 pendant au moins30 min pour le signal de DiO optimal. REMARQUE: Les contrôles sont maintenant prêts à être exécutés à travers le flux d'imagerie cytomètre. </li></ol> 4. cellules NK Séparation automatique <ol><li> Allumez séparateur de cellules et laisser le cycle de démarrage pour terminer. </li><li> Veiller à ce que toutes les bouteilles enluminures fluides sont verts et que la bouteille de déchets est vide. </li><li> Obtenir un rack tube mL température 15 ambiante. NOTE: La sélection est basée sur des volumes d'échantillons. Par exemple, pour un volume inférieur à 3 ml d'utiliser un support de tube de 15 ml et un volume de plus de 3 ml d'utiliser un support de tube de 50 ml. </li><li> tubes d'échantillons d'étiquettes en conséquence (Répéter par échantillon / participant): Participant 1 échantillon de sang; Participant 1 fraction négative; Participant 1 fraction positive. </li><li> pipette doucement 1,5 ml de sang total de l'étape 1.2 dans "échantillon de sang total" 15 ml tube. </li><li> Placez correctement étiquetés 15 ml "échantillon de sang total" tube de l'étape 4.5 et marqué 15 mL "Fraction négative" ettubes "Fraction positive" de l'étape 4.4 dans le rack du tube. Utilisez rack d'échantillons thefollowing set-up: Row (R1) A: échantillon de sang total, Rangée (R2) B: Négatif, fraction non marquée, Rangée (R4) C: Positif, fraction magnétiquement marqué. </li><li> Insérez le séparateur en rack sur le MiniSampler pour autolabeling. </li><li> Sélectionnez "réactif" dans le menu et mettre en évidence la position où le flacon sera placé dans le rack de séparation. </li><li> Sélectionnez "Lire réactif" pour activer le lecteur de code 2D. </li><li> Placer le flacon de réactif approprié devant le lecteur de code 2D entre 0,5-2,5 cm du couvercle du lecteur de code. REMARQUE: par exemple, le réactif nécessaire pour la séparation des cellules NK CD56. </li><li> Tenir flacon de réactif à un angle en face du lecteur de code 2D pour une lecture optimale. </li><li> Placer le flacon de réactif dans la position correcte de la grille de séparation. </li><li> Mettre en évidence les positions souhaitées sous l'onglet de séparation sur l'écran. </li><li> Dans le sous-menu d'étiquetage, d'attribuer une fille auprogramme de tolabeling. </li><li> Attribuer la cellule de séparation microbilles réactif CD56 à accumuler les positions 1, 2, 3 et 4. </li><li> Sélectionnez le programme de séparation "de posselwb". </li><li> Sélectionnez le "rinçage" programme de lavage. </li><li> Insérez un volume d'échantillon de 1500 pi dans le "Volume" sous-menu à l'aide du pavé numérique. </li><li> Sélectionnez l'option "Enter" sur le clavier. </li><li> Sélectionnez "Exécuter" pour commencer la séparation des cellules. </li><li> Sélectionnez "OK" pour confirmer que le tampon assez est disponible pour le traitement de tous les échantillons. </li></ol> 5. NK Cell Count Après séparation cellulaire <ol><li> Immédiatement après la séparation des cellules avec le séparateur de cellules, de récupérer la fraction positive. Laisser à température ambiante. Cette fraction contient la population de cellules NK pur souhaitée. </li><li> Pour chaque échantillon, effectuer un comptage des cellules en utilisant un hémocytomètre selon l' étape 2.2. <ol><li> Après les calculs, enregistrer le nombre de cellules. </li></ol></li></ol> 6. Essai de cytotoxicité Préparation d'échantillons <ol><li> Préparer et étiqueter les tubes de 1,5 mL pour chaque échantillon / participant en conséquence. </li><li> Pipette désiré rapport des cellules NK et les cellules K562 DiO-labled dans chaque tube. REMARQUE: par exemple, le rapport désiré de cellules cibles K562 et des cellules effectrices NK est de 1: 5. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 135 x g. </li><li> Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension NK-DIO marqué mélange de cellules K562 dans 500 ul de milieu de cellules NK sans interleukine-2 (IL-2) et 2-mercaptoéthanol (2-ME) (NK incomplète des milieux de culture cellulaire). NOTE: Le NK milieux de culture cellulaire incomplète est du milieu essentiel minimum d'Eagle avec du bicarbonate de sodium, sans L-glutamine, ribonucléosides et désoxyribonucléosides. </li><li> Ajouter 5 ul de PI à chaque tube. </li><li> Centrifugeuse pendant 2 min à 163 x g. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 h. </li><li> Après 2 heures d'incubation, centrifuge pendant 2 min à 163 x g. </li><li> Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Resuspendre les cellules dans 25 ul incomplet NK milieux de culture cellulaire. </li></ol> 7. Préparation de spontanée ( «S») Echantillon <ol><li> Pipette 500 pi de cellules K562 DiO marqués (concentration de 1 x 10 6 cellules / mL) en tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 10 pi de PI à chaque tube. </li><li> Tube à centrifuger pendant 2 min à 163 x g. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 h. </li><li> Après 2 heures d'incubation, centrifuger 2 min à 163 x g. </li><li> Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Resuspendre les cellules dans 25 ul incomplète Essential Medium (α-MEM) des milieux de culture de cellules alpha-minimum. </li></ol> 8. Acquisition de données avec imagerie cytomètre de flux <ol><li> Appuyez sur le bouton vert à l'intérieur de la porte d'entrée de l'imagerie cytomètre en flux pour allumer l'instrument. </li><li> Allumez all ordinateurs associés à l'imagerie du cytomètre en flux. </li><li> Lancer le flux d'imagerie cytomètre logiciel. </li><li> Cliquez sur le bouton "Démarrage" pour purger le système et préparer la ligne d'échantillon. </li><li> Une fois que le "démarrage" est terminée, fermez la fenêtre "étalonnages". </li><li> Attribuer canaux: sur le côté supérieur gauche, cliquez sur chaque canal afin de les affecter. </li><li> Du côté de la main droite, cliquez sur le bouton de nuage de points pour créer 4 diagrammes de dispersion: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 et FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Commencez l' analyse d' échantillons en utilisant d' abord la commande "Double Positive". <ol><li> Cliquez sur "Load". </li><li> Placer le tube de 1,5 ml avec l'échantillon "Double Positive" de Steps 3.4 à 3.9 dans l'échantillon chargeur. </li><li> Sélectionnez l'objectif 40X sous l'onglet «Grossissement». </li><li> Allumez le mW 405 etDes lasers à 642 mW. </li><li> Tourner sur le canal "Brightfield". </li><li> Cliquez sur "Sélectionner l'intensité." </li><li> Sur la base de l'échantillon de contrôle "Double positif", déterminer l'intensité souhaitée pour le laser de 405 mW de sorte que le détecteur ne soit pas surchargé. Remarque: Par exemple, l'intensité optimale pour cette expérience a été fixée à 11 mW. </li></ol></li><li> Après la mise en place souhaitée est atteinte, l' acquisition de données. <ol><li> Sous l'onglet "Fichier Acquisition", entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier. Sélectionnez un dossier pour enregistrer le fichier (s) de données. </li><li> Entrez le nombre de cellules d'acquérir à côté de "Collect". Généralement, ce nombre varie entre 1.000 à 10.000. </li><li> Cliquez sur "Acquire." NOTE: Une fois que le nombre souhaité de cellules est acquise, le fichier de données est automatiquement enregistrée dans le dossier sélectionné précédemment. </li></ol></li><li> Après l' acquisition terminée, charger le prochain échantillon de contrôle - DiO seul contrôle. </li><li> Cliquez sur "Load". </li><li> Placer le tube de 1,5 ml avec le "DiO seulement" échantillon dans le chargeur. </li><li> Laissez l'objectif 40X sous l'onglet «Grossissement» sélectionné. </li><li> Laisser le laser de 405 mW allumé. </li><li> Eteignez le laser 642 mW et le canal "Brightfield". NOTE: Maintenant que le set-up souhaité a été atteint, les données peuvent être acquises. </li><li> Sous l'onglet "Fichier Acquisition", entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier et sélectionnez un dossier pour enregistrer le fichier (s) de données. Entrez le nombre de cellules d'acquérir à côté de "Collect.". Généralement, ce nombre est de 1000. </li><li> Cliquez sur "Acquire." NOTE: Une fois que le nombre souhaité de cellules est acquise le fichier de données est automatiquement enregistrée dans le dossier sélectionné précédemment. </li></ol><li> Répétez l'étape 8.10 pour le "PI seulement" échantillon de contrôle. Les échantillons expérimentaux sont maintenant prêts à être collectés. </li><li> Manipuler les remaining échantillons expérimentaux, y compris les "échantillons" S "spontanées" comme suit: <ol><li> Laissez l'objectif 40X sous l'onglet «Grossissement» sélectionné. </li><li> Allumez le 405 mW et 642 mW lasers. </li><li> Allumez le canal "Brightfield". </li><li> Cliquez sur "Définir l'intensité." </li><li> Sous l'onglet "Fichier Acquisition", entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier et sélectionnez un dossier pour enregistrer le fichier (s) de données. Entrez dans un texte personnalisé de nom de fichier. </li><li> Entrez le nombre de cellules d'acquérir à côté de "Collect." </li><li> Cliquez sur le bouton "Acquire". NOTE: Une fois que le nombre souhaité de cellules est acquise le fichier de données est automatiquement enregistrée dans le dossier sélectionné précédemment. </li></ol></li><li> Répétez l'étape 8.12 pour tous les échantillons expérimentaux. </li><li> Après toutes les données expérimentales et les fichiers ont été collectés, cliquez sur le bouton "Arrêter" pour stériliser le système. </li> 9. Imaging cytomètre de flux Analyse d'échantillon <ol><li> Ouvrir le flux d'imagerie cytomètre application logicielle d'analyse. </li><li> Sous "Fichier", ouvrir un fichier .rif expérimental. </li><li> Construire une nouvelle matrice en utilisant les fichiers .rif de couleur unique (DIO uniquement contrôler et PI-seulement le contrôle, créé au cours des étapes 8.10 et 8.11) en sélectionnant «Créer un nouveau Matrix" sous l'onglet Compensation dans le flux d'imagerie cytomètre logiciel. REMARQUE: Le logiciel vous demandera la sélection des fichiers d'une seule couleur et de les fusionner pour créer un fichier de matrice (extension de fichier .ctm), qui doit être sélectionné pour appliquer une compensation de canal. </li><li> Créer des parcelles de points en utilisant la fonction "blocs de construction" du logiciel. <ol><li> Créer un point-plot (BrightFieldGradient_RMS vs fréquence) à la porte des cellules ciblées. Appelez la porte "Focus" (figure 1A). </li><li> Utilisation de la porte "Focus", créez un tracé de points de Bright Zone Champ vs brillant Champ Aspect Ratio à g mangé les cellules singlet. Appelez la porte "Single" (figure 1B). </li><li> Utilisation de la porte "Single", créer un terrain dot de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilisez ce terrain pour identifier et porte des cellules doubles positives (cibles, morts) DiO positif seules les cellules (cibles, vivant) et PI-DiO (figure 1C). NOTE: Toutes les parcelles décrites dans les étapes 9.4.1, 9.4.2 et 9.4.3 peuvent être créés en utilisant la fonction "blocs de construction" du logiciel. </li></ol></li><li> Cliquez sur la fonction statistique du tracé de points pour accéder aux numéros de cellules de chaque porte. </li><li> Calculer le pourcentage de cibles mortes dans l'échantillon spontanée et des échantillons expérimentaux utilisant la formule suivante: % des cibles mortes dans l'échantillon = (cibles de #dead x 100) / (# vivent cibles + #dead cibles) </li><li> Calculer la cytotoxicité en utilisant la formule suivante: % Cytotoxicité = [(expérimentale mort spontanée morts) / (100 morts-spontanée)] x100 </li></ol>_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg"> Figure 1: histogrammes représentatifs, des diagrammes de dispersion et des images pour l' analyse de l' activité cytotoxique. Analyse (A) de la cellule de mise au point. (B) seule analyse cellulaire. (C) Analyse de coloration de la cellule cible. Toutes les déterminations sont faites en utilisant l'image jointe à chaque événement. Cela peut être consulté dans le logiciel d'analyse en cliquant simplement sur l'événement sur les graphiques. (D) d'image représentative d'un événement de doublet, montrant une cellule apoptotique NK et une cible de K562 en direct. Ch01, Brightfield. Ch02, DiO. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode décrite dans cette étude mesure directement l&#39;activité spécifique des cellules NK d&#39;un individu en réponse à des stimuli (dans ce cas particulier, l&#39;exercice prolongé). Typiquement, les cellules NK sont isolées à partir de sang en utilisant un gradient de densité ou de tri cellulaire en utilisant une combinaison de marqueurs. Bien que ces méthodes sont largement utilisées, elles présentent de nombreux inconvénients: ils prennent beaucoup de temps, impliquent de multiples manipulations, et sont for...

Les cellules tueuses naturelles sont un élément essentiel du système immunitaire inné. Alors qu&#39;ils sont très réglementés, ils ont la capacité de reconnaître et d&#39; éliminer les cellules anormales par contact de cellule à cellule et sans activation préalable 1. En tant que tel, ils forment une ligne rapide de défense contre les infections. L&#39; exercice, surtout intense a été montré pour déprimer le système immunitaire transitoirement 2, 3, 4, 5. Les cellules NK sont particulièrement sujettes à cet effet , 4, 6, 7, créant ainsi une fenêtre d&#39; une sensibilité accrue aux maladies. Par conséquent, l&#39;étude des interventions avant, pendant ou après un exercice intense dans le but de réduire son impact sur la fonction des cellules NK est d&#39;un intérêt particulier pour le bien-être des athlètes post-concours. 8, à environ 1% du blanc compartiment des cellules sanguines; 2) Les cellules NK sont très sensibles au stress et reposent sur une exposition constante à des conditions physiologiques pour rester viable et stable au cours de l&#39;expérimentation; et 3) des tests standard pour déterminer la cytotoxicité des cellules NK, tels que les gradients de Ficoll 9 et libèrent des essais 10, ne sont pas fiables et incohérentes. La variabilité inhérente des échantillons humains ne font qu&#39;aggraver ces problèmes. échantillons humains frais prélevés lors d&#39;interventions sont assez réglementé et difficile à se procurer, au moins par rapport à des échantillons d&#39;animaux ou de lignées cellulaires immortalisées. Cela réduit les possibilités de répéter des expériences ou ajouter des participants à la cohorte de l&#39;étude pour atteindre les seuils statistiques significatives. Collectivement, ces questions prennent en charge la nécessité d&#39;un protocole simplifié qui permet for à la fois à haut débit et une analyse de haute fiabilité de NK activité lytique des cellules dans des échantillons humains. Nous avons établi un flux de travail qui réduit le temps nécessaire pour identifier, isoler et les cellules NK de test à partir de sang total humain, tout en minimisant l&#39;exposition à des facteurs externes. La méthode optimise l&#39;utilisation des deux instruments, un trieur magnétique à base de cellules et d&#39;un flux d&#39;imagerie cytomètre et un spécifique de test, T optimisé: rapport E pour permettre la détection d&#39;une diminution ou une augmentation de cytotoxicité des cellules NK.

<table><tbody><tr><td>Lymphoblastes K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Dulbecco’s modifié d’Iscove</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>Glycémie élevée, avec L-glutamine, avec HEPES, Alpha Minimum filtré stérile</td></tr><tr><td>Milieu essentiel</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Sans ribonucléosides ni désoxyribonucléosides mais avec 2 mM de L-glutamine et 1,5 g/L de bicarbonate de sodium</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan 0,4 %</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Qualité culture tissulaire</td></tr><tr><td>Solution de coloration à l’iodure Propridium</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’étiquetage cellulaire Vybranto DiO</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fonctionnement autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles de sang total CD56, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Cytomètre de flux d’imagerie</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0,4-0,7 % d’hypochlorite (stérilisateur)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70 % d’isopropanol (débulhateur)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (fluide de gaine)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>Sans calcium ni magnésium</td></tr><tr><td>Logiciel INSPIRE</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version Mark II, septembre 2013</td></tr><tr><td>Idées Logiciel d’application</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version 6.1, Juillet 2014</td></tr></tbody></table>

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Cytotoxicité des cellules NK est une mesure largement utilisée pour déterminer l&#39;effet d&#39;une intervention extérieure sur la fonction des cellules NK. Cependant, la précision et la reproductibilité de cet essai peut être considéré comme instable, soit à cause des erreurs de l&#39;utilisateur ou du fait de la sensibilité des cellules NK à une manipulation expérimentale. Pour éliminer ces problèmes, un flux de travail qui les réduit à un minimum a été créé et est présenté ici. Pour illustrer, nous avons obtenu des échantillons de sang, à divers moments, des coureurs (n = 4) qui ont été soumis à un combat intense d&#39;exercice. Tout d&#39;abord, les cellules NK sont simultanément identifiés et isolés par CD56 de marquage et de tri magnétique à base, directement à partir de sang total et d&#39;aussi peu que un millilitre. Les cellules NK triées sont retirées de tous les anticorps de réactifs ou de coiffage. Ils peuvent être comptés afin d&#39;établir un décompte précis des cellules NK par millilitre de sang. Deuxièmement, les cellules NK (cellules triées effecteurs ou E) peuvent être mélangés avec 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perchlorate (DIO) marqué des cellules K562 (cellules cibles ou T) à un 1 dosage optimal: 5 T: rapport E et analysé à l&#39;aide d&#39;un flux-cytomètre d&#39;imagerie qui permet la visualisation de chaque événement et l&#39;élimination de tout faux positif ou de faux négatifs (tels que des doublets ou des cellules effectrices). Ce flux de travail peut être complété en environ 4 h, et permet des résultats très stables, même lorsque l&#39;on travaille avec des échantillons humains. Lorsqu&#39;elles sont disponibles, les équipes de recherche peuvent tester plusieurs interventions expérimentales chez des sujets humains, et de comparer les mesures à travers plusieurs points de temps sans compromettre l&#39;intégrité des données.

Détermination de NK numération cellulaire L'effet de la course lourde sur NK numération des cellules dans le sang total a été mesurée en utilisant le protocole d'exercice décrit à la figure 2. Des échantillons de sang ont été prélevés avant l'exercice, immédiatement après l'exercice, 1,5 h après l'exercice, et enfin 24 et 48 h après le prélèvement sanguin initial. La concentration des cellules NK par ml de sang total a été mesurée pour chaque canal de coulée <strong...

Ce travail décrit un flux de travail avancé pour la détermination précise et rapide du nombre de cellules NK (Natural Killer) et de la cytotoxicité des cellules NK dans des échantillons de sang humain.

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NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

L’objectif global de cette expérience est de déterminer le nombre de cellules NK et les niveaux d’activation cytotoxique dans un échantillon de sang total humain de manière rapide, fiable et stable. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans les domaines immunologiques, telles que : Quels sont les effets des interventions extérieures sur la bioactivité des cellules NK ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et précise, tout en fournissant des résultats reproductibles à travers les expériences.Pour isoler les cellules NK du sang total humain, placez d’abord des tubes de 15 millilitres étiquetés Échantillon de sang total, Fraction négative et Fraction positive aux positions appropriées dans le support de tube de séparation de cellules. Lorsque tous les tubes sont chargés, insérez le support séparateur dans le mini-échantillonneur pour l’étiquetage automatique, puis sélectionnez Réactif dans le menu, pour mettre en évidence la position où le flacon sera placé sur le support. Sélectionnez Lire le réactif pour activer le lecteur de code 2D et tenez le flacon de réactif approprié devant le lecteur de code 2D à un angle de 0,5 à 2,5 centimètres par rapport au couvercle du lecteur de code.Placez le flacon de lecture dans la position appropriée du support séparateur. Ensuite, sous l’onglet Séparation, mettez en surbrillance les positions souhaitées. Ouvrez ensuite le sous-menu Étiquetage et sélectionnez un programme d’étiquetage automatique.Affectez les microbilles de réactif de séparation cellulaire aux positions 1, 2, 3 et 4 du rack. Et sélectionnez le programme de séparation Posselwb. Sélectionnez le programme Rinse Wash.Entrez 1500 microlitres pour le volume d’échantillon dans le sous-menu Volume, puis appuyez sur Entrée. Cliquez ensuite sur Exécuter pour commencer la séparation des cellules. Cliquez sur OK pour confirmer qu’il y a suffisamment de mémoire tampon disponible pour le traitement de tous les échantillons.Pour préparer un échantillon de test de cytotoxicité, il faut d’abord étiqueter des tubes de 1,5 millilitre pour chaque échantillon et/ou participant, le cas échéant, et répartir le rapport souhaité entre les cellules NK et les cellules K562 marquées DIO dans chaque tube. Collectez les cellules par centrifugation et retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Ensuite, mettez le mélange cellulaire en suspension dans 500 microlitres de milieu cellulaire NK incomplet et marquez les cellules de chaque tube avec 5 microlitres d’iodure de propidium.Collectez les cellules via une autre centrifugation et incubez la culture de rebut à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À la fin de l’incubation, centrifugez les cellules dans les mêmes conditions de centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 25 microlitres de milieu de culture cellulaire NK frais et incomplet. Pour analyser les cellules par cytométrie en flux, cliquez d’abord sur le bouton de démarrage dans le logiciel de cytomètre en flux d’imagerie pour vider le système.Ensuite, cliquez sur le bouton du nuage de points pour créer quatre nuages de points, et chargez le double tube de contrôle positif. À l’aide de l’échantillon de contrôle positif double, déterminez l’intensité souhaitée pour le laser de 405 milliwatts, afin que le détecteur ne soit pas surchargé, et réglez l’imageur pour qu’il acquière le nombre approprié de cellules. Le réglage du laser de 405 milliwatts à une intensité adaptée à la détection de DIO et de PI nécessitera de l’expérience avec les deux colorants et la plage de détection du cytomètre en flux.Une fois l’acquisition de l’échantillon de contrôle positif double terminée, chargez l’échantillon de contrôle DIO uniquement, sélectionnez l’objectif 40X et éteignez le laser de 642 milliwatts et le canal Brightfield. Élevez le nombre approprié de cellules et répétez l’acquisition pour l’échantillon d’iodure de propidium seulement. Lorsque tous les échantillons de contrôle ont été exécutés, réactivez le laser de 405 milliwatts et le canal Brightfield, puis cliquez sur Définir l’intensité.Ensuite, sous l’onglet Acquisition de fichiers, entrez un nom de fichier personnalisé et sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers de données. Entrez ensuite le nombre de cellules à acquérir. Chargez le premier tube d’échantillon expérimental et cliquez sur le bouton Acquérir.Une fois que tous les échantillons ont été analysés, ouvrez l’application logicielle d’analyse du cytomètre en flux d’imagerie et ouvrez un seul fichier RIF expérimental. Sous l’onglet Compensation, sélectionnez Créer une matrice. Le logiciel vous demandera de sélectionner les fichiers de couleur unique et de les fusionner pour créer un fichier matriciel à sélectionner pour l’application de la compensation de canal.Utilisez la fonction Building Blocks pour configurer les diagrammes à points appropriés. Cliquez ensuite sur la fonction statistiques pour accéder aux numéros de cellule dans chaque porte. Dans cette expérience représentative, des échantillons de sang ont été prélevés comme indiqué et la concentration de cellules NK par millilitre de sang total a été mesurée pour chaque coureur, et en moyenne pour chaque point temporel.Trois coureurs sur quatre ont présenté une légère augmentation similaire du nombre de cellules NK après l’exercice. Immédiatement suivie d’une forte diminution, avant de revenir lentement à la normale, 24 à 48 heures après la fin de l’événement. En moyenne, le nombre de cellules NK a diminué 1,5 heure après l’exercice, mais est revenu à des niveaux proches de la normale après 24 heures.Après avoir calculé le nombre de cellules, l’activité cytotoxique des cellules NK a été immédiatement analysée comme cela vient d’être démontré, avec une diminution moyenne de la cytotoxicité des cellules NK immédiatement, et 1,5 heure après la fin de l’exercice, qui a augmenté de manière significative 24 heures après l’exercice. La cytotoxicité des NK est restée élevée par rapport aux niveaux d’avant l’exercice, bien que de manière non significative. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en quatre heures environ lorsqu’elle est exécutée correctement.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir et de caractériser le nombre de cellules NK et l’activité cytotoxique à partir d’échantillons de sang humain de manière hydropique reproductible.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre l’activité lytique des cellules tueuses naturelles contre les cellules cibles colorées par fluorescence. La méthode permet de mesurer la cytotoxicité induite par les cellules NK en colorant les cellules mortes et en utilisant un cytomètre en flux pour quantifier les cellules cibles vivantes et mortes.

Préparation d’un échantillon pour un test de cytotoxicité à médiation cellulaire tueuse naturelle pour l’analyse cytométrique en flux

Cette vidéo montre la réalisation d’un test de libération de lactate déshydrogénase pour déterminer la cytotoxicité des cellules tueuses naturelles (NK) par rapport aux cellules cancéreuses cibles. Le test quantifie la libération de l’enzyme cytoplasmique lactate déshydrogénase par les cellules cancéreuses en mesurant l’absorbance du produit de couleur rouge formé.

Un test in vitro pour évaluer la cytotoxicité des cellules tueuses naturelles contre les cellules cancéreuses

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

L’évasion de l’éradication des cellules par le tueur naturel (NK) par les cellules cancéreuses est importante pour l’initiation et la progression du cancer. Ici, nous présentons deux protocoles non radioactivité-basés pour évaluer la cytotoxicité cellule-négociée de NK vers les cellules hépatiques de tumeur. En outre, un troisième protocole est présenté pour analyser la migration des cellules NK.

Mesure de la cytotoxicité et de la migration à médiation cellulaire naturelle dans le contexte des cellules tumorales hépatiques

Un protocole d’étude des événements induits par FcγRIIIa par des anticorps thérapeutiques dans des cellules tueuses naturelles humaines est décrit ici. Cette plate-forme de stimulation artificielle permet d’interroger les fonctions effectrices en aval telles que la dégranulation, la production de chimiokines / cytokines et les voies de signalisation médiées par les parties FcγRIIIa et Fc des anticorps impliqués dans la liaison.

Évaluation des événements des cellules tueuses naturelles humaines provoquées par l’engagement de FcγRIIIa en présence d’anticorps thérapeutiques

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les cellules humaines primaires de tueur naturel (NK) isolées du sang périphérique, au repos ou après l’activation induite par l’IL15. Le protocole décrit pourrait être facilement étendu aux cellules NK humaines primaires activées par d’autres cytokines ou stimuli solubles.

Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines

Ce protocole décrit une méthode sans marquage pour l’analyse rapide sur cellule unique du nombre et de l’activité des cellules tueuses naturelles (NK) à l’aide de la technologie d’imagerie des ombres sans lentille. Cette méthode quantifie les changements morphologiques dans les cellules NK individuelles par l’analyse informatisée de leurs modèles de diffraction.

Plate-forme d’imagerie sans lentille déployable sur le terrain pour une analyse rapide sans marquage de l’activation des cellules tueuses naturelles

Ce protocole fournit un flux de travail standardisé in vitro. pour une mesure cohérente de la cytotoxicité naturelle, médiée par les récepteurs antigéniques chimériques et dépendante des anticorps des cellules humaines naturelles tueuses grâce à l’imagerie des cellules vivantes et à la cytométrie en flux.

Quantification de la cytotoxicité des cellules NK potentialisée par des récepteurs antigéniques chimériques et des anticorps thérapeutiques à l’aide d’imagerie à cellules vivantes et de cytométrie en flux

Apprenez à déterminer le nombre et l'activité cytotoxique des cellules NK dans le sang humain par cytométrie en flux. Cette méthode rapide et reproductible facilite la recherche en immunologie clinique.

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