Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain
17 mars 2017
Ce travail décrit un flux de travail avancé pour la détermination précise et rapide du nombre de cellules NK (Natural Killer) et de la cytotoxicité des cellules NK dans des échantillons de sang humain.
L’objectif global de cette expérience est de déterminer le nombre de cellules NK et les niveaux d’activation cytotoxique dans un échantillon de sang total humain de manière rapide, fiable et stable. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans les domaines immunologiques, telles que : Quels sont les effets des interventions extérieures sur la bioactivité des cellules NK ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide et précise, tout en fournissant des résultats reproductibles à travers les expériences.
Pour isoler les cellules NK du sang total humain, placez d’abord des tubes de 15 millilitres étiquetés Échantillon de sang total, Fraction négative et Fraction positive aux positions appropriées dans le support de tube de séparation de cellules. Lorsque tous les tubes sont chargés, insérez le support séparateur dans le mini-échantillonneur pour l’étiquetage automatique, puis sélectionnez Réactif dans le menu, pour mettre en évidence la position où le flacon sera placé sur le support. Sélectionnez Lire le réactif pour activer le lecteur de code 2D et tenez le flacon de réactif approprié devant le lecteur de code 2D à un angle de 0,5 à 2,5 centimètres par rapport au couvercle du lecteur de code.
Placez le flacon de lecture dans la position appropriée du support séparateur. Ensuite, sous l’onglet Séparation, mettez en surbrillance les positions souhaitées. Ouvrez ensuite le sous-menu Étiquetage et sélectionnez un programme d’étiquetage automatique.
Affectez les microbilles de réactif de séparation cellulaire aux positions 1, 2, 3 et 4 du rack. Et sélectionnez le programme de séparation Posselwb. Sélectionnez le programme Rinse Wash.
Entrez 1500 microlitres pour le volume d’échantillon dans le sous-menu Volume, puis appuyez sur Entrée. Cliquez ensuite sur Exécuter pour commencer la séparation des cellules. Cliquez sur OK pour confirmer qu’il y a suffisamment de mémoire tampon disponible pour le traitement de tous les échantillons.
Pour préparer un échantillon de test de cytotoxicité, il faut d’abord étiqueter des tubes de 1,5 millilitre pour chaque échantillon et/ou participant, le cas échéant, et répartir le rapport souhaité entre les cellules NK et les cellules K562 marquées DIO dans chaque tube. Collectez les cellules par centrifugation et retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Ensuite, mettez le mélange cellulaire en suspension dans 500 microlitres de milieu cellulaire NK incomplet et marquez les cellules de chaque tube avec 5 microlitres d’iodure de propidium.
Collectez les cellules via une autre centrifugation et incubez la culture de rebut à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À la fin de l’incubation, centrifugez les cellules dans les mêmes conditions de centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 25 microlitres de milieu de culture cellulaire NK frais et incomplet. Pour analyser les cellules par cytométrie en flux, cliquez d’abord sur le bouton de démarrage dans le logiciel de cytomètre en flux d’imagerie pour vider le système.
Ensuite, cliquez sur le bouton du nuage de points pour créer quatre nuages de points, et chargez le double tube de contrôle positif. À l’aide de l’échantillon de contrôle positif double, déterminez l’intensité souhaitée pour le laser de 405 milliwatts, afin que le détecteur ne soit pas surchargé, et réglez l’imageur pour qu’il acquière le nombre approprié de cellules. Le réglage du laser de 405 milliwatts à une intensité adaptée à la détection de DIO et de PI nécessitera de l’expérience avec les deux colorants et la plage de détection du cytomètre en flux.
Une fois l’acquisition de l’échantillon de contrôle positif double terminée, chargez l’échantillon de contrôle DIO uniquement, sélectionnez l’objectif 40X et éteignez le laser de 642 milliwatts et le canal Brightfield. Élevez le nombre approprié de cellules et répétez l’acquisition pour l’échantillon d’iodure de propidium seulement. Lorsque tous les échantillons de contrôle ont été exécutés, réactivez le laser de 405 milliwatts et le canal Brightfield, puis cliquez sur Définir l’intensité.
Ensuite, sous l’onglet Acquisition de fichiers, entrez un nom de fichier personnalisé et sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers de données. Entrez ensuite le nombre de cellules à acquérir. Chargez le premier tube d’échantillon expérimental et cliquez sur le bouton Acquérir.
Une fois que tous les échantillons ont été analysés, ouvrez l’application logicielle d’analyse du cytomètre en flux d’imagerie et ouvrez un seul fichier RIF expérimental. Sous l’onglet Compensation, sélectionnez Créer une matrice. Le logiciel vous demandera de sélectionner les fichiers de couleur unique et de les fusionner pour créer un fichier matriciel à sélectionner pour l’application de la compensation de canal.
Utilisez la fonction Building Blocks pour configurer les diagrammes à points appropriés. Cliquez ensuite sur la fonction statistiques pour accéder aux numéros de cellule dans chaque porte. Dans cette expérience représentative, des échantillons de sang ont été prélevés comme indiqué et la concentration de cellules NK par millilitre de sang total a été mesurée pour chaque coureur, et en moyenne pour chaque point temporel.
Trois coureurs sur quatre ont présenté une légère augmentation similaire du nombre de cellules NK après l’exercice. Immédiatement suivie d’une forte diminution, avant de revenir lentement à la normale, 24 à 48 heures après la fin de l’événement. En moyenne, le nombre de cellules NK a diminué 1,5 heure après l’exercice, mais est revenu à des niveaux proches de la normale après 24 heures.
Après avoir calculé le nombre de cellules, l’activité cytotoxique des cellules NK a été immédiatement analysée comme cela vient d’être démontré, avec une diminution moyenne de la cytotoxicité des cellules NK immédiatement, et 1,5 heure après la fin de l’exercice, qui a augmenté de manière significative 24 heures après l’exercice. La cytotoxicité des NK est restée élevée par rapport aux niveaux d’avant l’exercice, bien que de manière non significative. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en quatre heures environ lorsqu’elle est exécutée correctement.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir et de caractériser le nombre de cellules NK et l’activité cytotoxique à partir d’échantillons de sang humain de manière hydropique reproductible.
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Aperçu
Ce travail décrit un flux de travail avancé permettant la détermination précise et rapide du nombre de cellules NK (Natural Killer) et de la cytotoxicité des cellules NK dans des échantillons sanguins humains. La méthode vise à fournir des résultats fiables qui peuvent améliorer la compréhension dans le domaine de la recherche immunologique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Recherche clinique
Contexte
- Les cellules NK jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire.
- La compréhension de l'activité des cellules NK peut guider des interventions thérapeutiques.
- Les méthodes actuelles peuvent manquer de rapidité et de précision.
- Cette étude présente une nouvelle approche pour remédier à ces limites.
Objectif de l'étude
- Déterminer le nombre de cellules NK dans des échantillons sanguins humains.
- Évaluer les niveaux d'activation cytotoxique des cellules NK.
- Développer une méthode rapide et fiable pour la recherche immunologique.
Méthodes utilisées
- Isolation des cellules NK à partir d'échantillons de sang total.
- Utilisation d'un séparateur cellulaire pour le traitement des échantillons.
- Étiquetage automatique des échantillons pour garantir la précision.
- Activation d'un lecteur de code 2D pour l'identification des réactifs.
Résultats principaux
- La méthode fournit des résultats reproductibles entre les expériences.
- Dosage rapide du nombre de cellules NK et de leur cytotoxicité.
- Des données fiables pouvant soutenir des études immunologiques ultérieures.
- Un potentiel pour répondre à des questions concernant la bioactivité des cellules NK.
Conclusions
- Ce protocole améliore l'étude des cellules NK dans les échantillons humains.
- Il offre un équilibre entre rapidité, précision et reproductibilité.
- La méthode peut faciliter la recherche sur les interventions ciblant les cellules NK.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mesure précise et reproductible de la cytotoxicité des cellules Natural Killer (NK) est essentielle pour évaluer les interventions immunomodulatrices en développement préclinique et clinique. Ce protocole permet une quantification rapide et stable du nombre de cellules NK et de leur activité lytique à partir de faibles volumes de sang total humain, facilitant ainsi la validation ciblée et la réduction des risques mécanistiques dans les filières d'immunothérapie. En réduisant la variabilité des tests et les erreurs dépendant de l'opérateur, cette méthode améliore la fiabilité prédictive dans les contextes de recherche exploratoire et translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques concernant la bioactivité des cellules NK après une intervention pharmacologique ou biologique.
- Valeur opérationnelle : Fournit une quantification reproductible des cellules NK et des mesures de cytotoxicité à partir d'à peine 1 mL de sang total humain, réduisant ainsi les besoins en échantillons.
- Valeur prédictive : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en reliant l'activité des cellules effectrices à des résultats cytotoxiques mesurables dans un système pertinent pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives basées sur la cytométrie en flux avec imagerie permettant de distinguer les véritables événements cytotoxiques des faux positifs tels que les doublets ou les débris.
- Valeur opérationnelle : Standardise le rapport effecteurs-cibles (E:C) à 1:5 à l’aide de cellules cibles K562 marquées au DiO, permettant la reproductibilité du test à différents points temporels et dans diverses conditions expérimentales.
- Valeur de la plateforme : Compatible avec les plateformes de cytométrie en flux dotées d’imagerie, permettant la visualisation de chaque événement et l’élimination des faux négatifs, et soutenant des protocoles de criblage évolutifs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la surveillance longitudinale de l'activité des cellules NK chez des sujets humains, facilitant la corrélation entre les modifications cytotoxiques et les paramètres pharmacodynamiques ou cliniques.
- Valeur opérationnelle : Autorise le test de plusieurs interventions expérimentales à différents points temporels sans compromettre l'intégrité des données, soutenant ainsi des plans d'étude adaptatifs.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les découvertes mécanistiques de la phase exploratoire et la validation préclinique en fournissant des données fonctionnelles sur les cellules NK pertinentes pour l'humain.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs et à l'évaluation préclinique, en particulier pour les agents immunomodulateurs dont le mécanisme d'action implique l'activation des cellules NK.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en mesurant l'activation cytotoxique des cellules NK comme paramètre fonctionnel de la modulation immunitaire.
- Criblage : Fournit des cellules NK purifiées et prêtes à l'emploi, avec des étiquetages standardisés et des contrôles de compensation, garantissant la reproductibilité dans le criblage de composés ou de produits biologiques.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives de variables dépendantes (nombre de cellules NK par mL, pourcentage d'activation cytotoxique) qui alimentent l'analyse statistique et les comparaisons entre conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les tests de cytotoxicité in vitro aux réponses immunitaires ex vivo dans le sang humain, améliorant ainsi la valeur prédictive pour la translation clinique.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un flux de travail réutilisable et standardisé pour l'évaluation fonctionnelle des cellules NK à travers différents projets, réduisant ainsi le besoin de redévelopper des méthodes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les mécanismes médiés par les cellules NK, réduisant ainsi les fausses pistes dans le développement d'immunothérapies.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats rapides et stables (~4 heures) avec un temps d'intervention minimal, améliorant le débit du laboratoire.
- Valeur stratégique : Permet de prendre de meilleures décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant dès les premières étapes du processus des données immunodynamiques fiables.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des candidats en se basant sur une modulation reproductible de l'activité des cellules NK.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en séparation cellulaire, en compensation en cytométrie en flux et en analyse basée sur l'imagerie.
- Dépend de l'accès à un séparateur cellulaire doté d'un étiquetage automatique et à un cytomètre en flux à imagerie possédant des capacités de détection par laser et par fluorescence.
- Exige une standardisation des volumes de réactifs, des durées d'incubation et des stratégies de sélection des événements entre les utilisateurs et les sites.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter la validation des marqueurs des cellules NK et la compatibilité des cellules cibles.
- Les limites pratiques incluent la sensibilité des cellules NK aux retards de manipulation et la nécessité d'échantillons sanguins frais pour maintenir leur viabilité et leur fonctionnalité.
