Utilisant la technologie 3D Impression de fusion IRM avec histologie: Un protocole pour Brain Sectionnement

L'objectif général de ce protocole est d'aligner précisément des volumes d'images d'imagerie par résonance magnétique avec des sections histologiques grâce à la création de supports cérébraux personnalisés imprimés en 3D et de boîtes de découpage. Bien que cette vidéo se concentre sur les tissus cérébraux extraits du marmouset, ce protocole peut être appliqué à tout cerveau, qu'il provienne d'un rongeur, d'un primate non humain ou d'un humain. Préparez un poste de travail comme décrit dans le protocole.

Remplir le tube avec du Fomblin et du coton jusqu'au trait de 20 millilitres. Compresser le coton pour éliminer les bulles d'air au fur et à mesure. Sécher délicatement le cerveau du formol.

Ensuite, insérez le cerveau avec la face avant orientée vers le fond du tube. Fixez soigneusement le cerveau dans le tube à l'aide de gaze placée autour des côtés du cerveau afin d'assurer sa position. Remplissez le reste du tube avec de la gaze et du Fomblin.

Retirez soigneusement les bulles d'air au fur et à mesure. Ensuite, fixez le bouchon et scellez le tube avec du paraffine. Marquez le bouchon et la ligne selon la scissure interhémisphérique.

Ensuite, enveloppez le tube dans une serviette en papier et insérez-le dans la bobine avec la marque en position centrale supérieure. Insérez la bobine dans le scanner IRM. Après l'acquisition et le post-traitement, nous obtenons une image pondérée en T2 que nous pouvons utiliser pour créer un modèle numérique du cerveau.

Ouvrez l'IRM en orientation coronale. Ensuite, utilisez les outils de transformation pour rééchantillonner l'image en voxels isotropes d'1 millimètre. Appliquez ensuite un filtre de réduction du bruit non linéaire.

Sélectionnez la table de consultation des affichages. Ensuite, cliquez sur le bouton Seuil double. Faites glisser le curseur sur le graphique pour couvrir tout le cerveau.

Créez un masque binaire du cerveau à l'aide de l'algorithme de segmentation Seuil utilisant les valeurs min/max. Saisissez la valeur située dans le coin inférieur gauche du graphique d'intensité, juste en dessous de l'échelle, dans la case Limite inférieure. Ensuite, sélectionnez Binaire et décochez la case Inverser le seuil.

Sélectionnez l'algorithme morphologique, Remplir les trous. Cochez Traiter en 2,5D. Pour combler l'espace entre le cerveau postérieur et le cortex, sélectionnez la ligne VOI.

Tracer une connexion entre le cervelet et le cortex de chaque côté du cerveau au point le plus latéral. Poursuivre le tracé des connexions des volumes d'intérêt (VOI) à travers le cerveau. Convertir les volumes d'intérêt en une masque binaire.

Utilisez le calculateur d'image pour combiner les masques binaires de VOI et du cerveau en sélectionnant l'opération OU. Sélectionnez Promouvoir le type d'image de destination. Sélectionnez maintenant l'algorithme morphologique : Remplissage des trous.

Et vérifiez le traitement en 2,5D. Sélectionnez l'algorithme d'extraction de surface, sélectionnez l'image de masque, saisissez un nom, puis choisissez le type de fichier ply. Les espaces dans la boîte de découpe correspondent à l'emplacement du plan de coupe peuvent être positionnés à partir de l'avant du cerveau, de l'arrière du cerveau ou par rapport à une zone d'intérêt, comme les lésions observées ici dans la matière blanche.

À l'aide de la VOI de type boîte, dessinez un cadre autour du cerveau. Copiez et collez ce cadre sur le nombre de coupes IRM correspondant à l'épaisseur prévue des espaces entre plaques. Puis avancez du nombre de coupes IRM par section et répétez l'opération de placement du cadre comme précédemment afin de créer un nouvel espace entre plaques.

Répétez ce processus sur l'ensemble du cerveau. Inversez les volumes d'intérêt (VOI) en une masque binaire. Ensuite, extrayez la surface à l'aide de l'outil d'extraction de surface, comme précédemment pour le cerveau.

Sélectionnez le masque binaire de l'écartement de la lame. Utilisez le calcul d'image pour le multiplier par 10 000. Ensuite, utilisez la calculatrice d'image pour ajouter le masque binaire multiplié à l'IRM isotrope rééchantillonnée.

En sélectionnant maintenant la vue triplan, une carte IRM en lame montrant l'emplacement où le cerveau sera sectionné peut être visualisée selon trois plans orthogonaux. Dans Netfabb Professional, sélectionnez Ajouter une pièce. Puis sélectionnez le modèle d'espacement des lames et les modèles de cerveau au format ply.

Sélectionnez le modèle de cerveau et cliquez sur le mode de réparation. Utilisez le bouton de sélection de coque pour sélectionner le cerveau. Ensuite, basculez la sélection vers les autres coques et supprimez-les.

Ensuite, appliquez la réparation et retirez l'ancienne partie. Avec le cerveau sélectionné, sélectionnez Déplacer. Cliquez sur l'origine et enregistrez les paramètres dans les cases X, Y et Z.

Elles sont nécessaires pour maintenir le positionnement de l'écartement de la lame. Cliquez sur traduire. Et fermez la fenêtre.

Sélectionnez le modèle Écartement de la lame et traduisez-le en utilisant les paramètres enregistrés lors de l'étape précédente. Sélectionnez le modèle Cerveau et cliquez sur le mode réparation. Utilisez le bouton de sélection de coque pour sélectionner le cerveau.

Ensuite, sélectionnez Triangles lisses. Saisissez quatre comme nombre d'itérations. Et cochez Prévenir la réduction du volume.

Sélectionnez Réduire les triangles et saisissez 200000 dans la zone Nombre cible de triangles. Ensuite, sélectionnez Réparation automatique et effectuez une réparation par défaut. Appliquez la réparation.

Ensuite, exporter le modèle cérébral lissé au format STL. Importer le modèle cérébral lissé dans Meshmixer. Utiliser les outils de sculpture pour lisser les zones en dessinant avec les VOI en ligne.

Et corrigez tout autre défaut mineur du modèle. Importez le modèle cérébral lissé et modifié dans Netfabb Professional. Ensuite, ajoutez la pièce, les composants du découpeur cérébral pour le marmouset.

Sélectionnez les coques pour les séparer en pièces. Renommez ensuite chaque pièce comme décrit dans le protocole. À l’aide des paramètres de sélection décrits dans le protocole, cliquez et faites glisser les pièces afin de positionner le cerveau au centre de la boîte.

Cliquez et faites glisser les pièces pour ajuster la profondeur du cerveau dans la boîte. Sélectionnez le modèle de cerveau lissé et modifié, puis dans le modèle découpé de la boîte, sélectionnez l'opération booléenne. Cliquez sur le modèle de cerveau pour le rendre rouge.

Et sélectionnez la soustraction booléenne. Appliquez les calculs. Cochez la case pour les débords qui empêcheraient un positionnement adéquat du cerveau.

Se référer à la section supplémentaire du protocole pour une méthode permettant de les éliminer. Sélectionner le modèle d'écartement de lame et cliquer sur déplacer. Enregistrer à la position Z.

Ce sera la position de l'ouverture de lame la plus postérieure. Ensuite, fermez la fenêtre. Sélectionnez la pièce de lame parmi les composants du découpeur de cerveau et cliquez sur Déplacer.

Saisissez la valeur Z de l'étape précédente. Saisissez ensuite les valeurs de position actuelles X et Y. Sélectionnez la translation absolue, puis effectuez la translation.

Cliquez sur Dupliquer. Si l'épaisseur des sections est constante, comme indiqué ici, saisissez le nombre total de lames et le nombre total ainsi que le nombre Z, puis entrez l'épaisseur des sections dans la case Écart Z. Ensuite, sélectionnez dupliquer.

Sélectionnez la pièce de la lame du microtome parmi les composants du découpeur de cerveau. Répétez les mêmes étapes de déplacement et de duplication que celles effectuées pour la pièce de la lame. Sélectionnez toutes les lames de microtome ainsi que le support principal de lame, puis cliquez sur l'opération booléenne.

Sélectionnez toutes les lames de microtome pour les rendre rouges, puis cliquez sur la soustraction booléenne. Appliquez ensuite les calculs. Entrez en mode de réparation et sélectionnez la réparation automatique.

Effectuez une réparation étendue et appliquez-la. Exportez le support de lame au format STL. Sélectionnez toutes les lames, les boîtes principale et secondaire, ainsi que le modèle cérébral lissé et modifié, puis cliquez sur l'opération booléenne.

Utilisez la fenêtre de sélection des pièces pour rendre toutes les pièces rouges, à l'exception de la boîte principale. Ensuite, sélectionnez la soustraction booléenne. Appliquez les calculs.

Entrez en mode de réparation et cochez la case pour les arêtes vives qui pourraient blesser le cerveau. Celles-ci peuvent être réparées en mode de réparation de Netfabb ou à l’aide des outils de sculpture dans Meshmixer.

Ensuite, sélectionnez Réparation automatique. Effectuez une réparation étendue. Appliquez ensuite la réparation.

Exporter la boîte cérébrale au format STL. Dans Cura, sélectionnez Charger et importez la boîte cérébrale. Cliquez sur le bouton Rotation.

Ensuite, cliquez et faites glisser pour aplatir la boîte. Modifiez les paramètres d'impression comme indiqué dans le protocole. Puis enregistrez le chemin d'outil.

Suivez le même processus pour le support de lame et dupliquez également l'objet. Ensuite, enregistrez le chemin d'outil. Après avoir appliqué une fine couche de colle sur le plateau d'impression, imprimez la boîte cérébrale et les supports de lame sur l'imprimante 3D en utilisant les paramètres décrits dans le protocole.

Une fois les impressions terminées, le cerveau peut être préparé pour la découpe. Installez un poste de travail comme décrit dans le protocole. Placez soigneusement le cerveau dans la boîte et assurez-vous qu'il est bien fixé en place.

Placer les lames de microtome dans les supports de lame, puis insérer ceux-ci dans les fentes correspondantes de la boîte. En portant des gants de protection, appuyer fermement sur les supports de lame. Exercer une pression lente et uniforme pour couper le cerveau.

Retirez les tranches une par une en commençant par l'avant du cerveau. Bien que cette approche soit simple, la méthode nécessite de nombreuses étapes ainsi que l'utilisation de plusieurs types de logiciels, et les chercheurs doivent se familiariser avec les interfaces utilisateurs avant de commencer la procédure. Ce flux de travail résume le protocole de fabrication de la boîte de découpe du cerveau du marmouset.

Le cerveau est fixé avec du formol et une IRM pondérée en T2 est acquise à 150 microns. Les images sont traitées et seuillées pour créer un masque binaire. La surface est ensuite rendue dans un logiciel de modélisation 3D.

Une soustraction booléenne entre un modèle de découpe et le modèle numérique du cerveau permet de créer le modèle numérique du découpeur de cerveau. La boîte du découpeur de cerveau est ensuite imprimée sur une imprimante 3D. Le cerveau est alors placé fermement dans la boîte du découpeur pour être découpé.

Une fois que le cerveau est tranché, une comparaison visuelle entre les images IRM in vivo et post-mortem ainsi que les photographies des surfaces superficielles des tranches révèle une bonne concordance d'orientation à travers plusieurs tranches. Une comparaison plus approfondie entre l'IRM post-mortem haute résolution et les sections histologiques colorées à l'HE-MB de plusieurs tranches cérébrales démontre une concordance précise et constante à travers toutes les structures du cerveau du marmouset. Chez ce modèle animal de sclérose en plaques, les animaux développent des lésions de la substance blanche réparties dans tout le cerveau.

Grâce à cette technique, de petites lésions détectées par IRM in vivo peuvent être suivies aussi bien sur les sections d'IRM post-mortem que sur les coupes histologiques. L'histologie et l'IRM post-mortem peuvent également révéler des lésions passées inaperçues en IRM in vivo. Ici, l'IRM in vivo ne montrait pas de preuve convaincante de signal hyperintense normal, suggérant l'absence de lésions dans l'un ou l'autre des faisceaux optiques.

Néanmoins, lors de l'IRM post-mortem, des hyperintensités du signal dans le tractus optique ont été observées. Et ces régions correspondaient directement aux lésions myélinisées visibles sur la coupe histologique LFB CV. En conclusion, la méthodologie présentée ici permet aux chercheurs d'évaluer précisément la pathologie sous-jacente aux découvertes en IRM.

Nous pensons qu'il s'agit d'une approche prometteuse pour l'identification de nouveaux biomarqueurs de maladies impliquant le cerveau et de processus pathologiques spécifiques tels que l'inflammation et la remyélinisation.