Name: Utilisant la technologie 3D Impression de fusion IRM avec histologie: Un protocole pour Brain Sectionnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Découvrez un protocole d'alignement précis entre IRM et histologie utilisant des boîtes de coupe cérébrales imprimées en 3D. Cette méthode, validée sur cerveau de ouistiti, permet une corrélation radiologique-histopathologique reproductible pour la recherche en neuroimagerie.

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Le programme de recherche intra-muros du NINDS a soutenu cette étude. Nous remercions l’installation d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle des NIH. Nous remercions Jennifer Lefeuvre et Cecil Chern-Chyi Yen pour leur aide dans l’acquisition de l’IRM post-mortem. Nous remercions John Ostuni et la Section de l’instrumentation pour leur aide avec l’impression 3D. La figure 1 de ce travail a utilisé des instantanés de MeshLab, un outil développé avec le soutien du projet 3D-CoForm.

<ol><li>Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MRI+in+clinical+trials+of+multiple+sclerosis%3A+comparison+of+image+processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques.</a> Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).</li>
<li>'t Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primate+autoimmune+encephalomyelitis+model%3B+a+bridge+between+mouse+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man.</a> Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).</li>
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<li>Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+fit+3D-printed+brain+holders+for+comparison+of+histology+with+MRI+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets.</a> J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).</li>
<li>Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+registration+of+magnetic+resonance+image+data+to+histological+sections+with+model-based+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation.</a> Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).</li>
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<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+MR%2C+fluorescence+and+histology+imaging+strategy+in+a+human+breast+tumor+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model.</a> NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole décrit ici permet une comparaison précise entre IRM et coupes histologiques. Le protocole est présenté dans un format unifié qui peut être appliqué sur des cerveaux humains ou de petits animaux, tels que les ouistitis ou les rongeurs. Les différences spécifiques à la grande (humaine) et petits (primate non humain et les rongeurs) cerveaux sont mis en évidence, et dans la vidéo et les figures d&#39;accompagnement, nous démontrons l&#39;application dans le ouistiti. Bien que la méthode est simple, le procédé nécessite de nombreuses étapes, ainsi que l&#39;utilisation de plusieurs types de logiciels. En outre, plusieurs questions touchant potentiellement la précision de cette méthode sont importants à mentionner. La qualité de l&#39;IRM in vivo d&#39;image est un facteur important. Pour réduire au minimum la disparité dans la résolution d&#39;image entre les images IRM et histologiques digitalisés, la plus petite taille possible IRM voxel doit être utilisé. Ce concept est également valable pour la qualité de l&#39;IRM post-mortem d&#39;image. Alors que l&#39;augmentationtemps d&#39;acquisition en IRM post-mortem permet beaucoup plus haute résolution d&#39;image, la préparation peut introduire des artefacts d&#39;image tels que les pertes de signal focaux liés à des bulles d&#39;air. Ces artefacts peuvent masquer les zones du tissu ainsi que affecter son contour. Par ailleurs, les dimensions du tissu à l&#39;IRM post-mortem sont susceptibles d&#39;être affectées par le processus de fixation et la durée. Alors que le in vivo ex vivo IRM match peut être étroitement approchée en utilisant des repères anatomiques dans la configuration de la géométrie de coupe lors de l&#39; acquisition, un enregistrement non linéaire serait encore nécessaire pour atteindre un plus haut degré de précision dans ces deux images correspondant à l&#39; IRM. La conception du porte-cerveau et trancheuse est aussi une étape cruciale. Lors de la création du modèle numérique du cerveau, un algorithme de lissage est appliqué, qui élargit légèrement le modèle par rapport à la tête fixe. Ceci permet une insertion facile du cerveau dans son support et trancheuse et réduit les arêtes vives dans le support &amp;le contour; # 39. Cependant, si le modèle est trop grand (par exemple plus de 5%), le cerveau peut se déplacer au cours de l&#39;IRM post-mortem et / ou le sectionnement. Un autre point important est d&#39;adapter la conception du modèle de cerveau de sorte que le cervelet est correctement placé à l&#39;intérieur de l&#39;objet 3D imprimé. Cela peut être particulièrement difficile lorsque le cervelet a été endommagé lors de l&#39;extraction du cerveau à l&#39;autopsie. Lors de l&#39;impression du trancheur du cerveau et le support, le type d&#39;imprimante 3D doit également être choisi avec soin. Certaines imprimantes à jets multiples nécessitent un post-traitement à l&#39;aide d&#39;un four pour éliminer le matériau de support. Bien que ces imprimantes peuvent produire des objets qui sont étanches à l&#39;eau et relativement plus durable que bureau fusionné modélisation de dépôt imprimantes (FDM), le processus de chauffage pour éliminer les supports peuvent légèrement déformer la boîte, ce qui crée des lacunes de la lame qui ne sont pas parfaitement perpendiculaire au contour du cerveau. Le processus du cerveau sectionnant est une autre étape cruciale. Avant ème coupee cerveau entier en plaques, il est important de faire en sorte que le cerveau est assis bien à l&#39;intérieur du trancheuse du cerveau: il devrait y avoir aucun mouvement quand une légère pression est appliquée sur le cerveau. Ainsi, il sera possible pour les lames pour couper à travers le cerveau à l&#39;endroit précis fixé par les enquêteurs. Une pression équilibrée continue devrait être appliqué aux deux supports de lame lors de la coupe. En fonction du tranchant des lames et de la rigidité du tissu, un léger mouvement de coupe transversale pourrait être avantageux pour l&#39;entretien de surfaces planes découpées. Le procédé de paraffine-enrobage peut également être une source de défaut d&#39;alignement entre l&#39;IRM et l&#39;histologie. Si la dalle de tissu ne siège plat contre la cassette pendant le processus d&#39;incorporation, il y aura une inclinaison entre le plan de coupe du microtome et la place de la dalle de surface. Il faudra couper des sections inutilisables pour trouver une surface plane dans laquelle tout le tissu est exposé. Une façon de corriger l&#39;inclinaisonest en changeant l&#39;angle du plan d&#39;observation sur le post-mortem IRM haute isotrope résolution. Toutefois, cela est presque impossible à réaliser sur l&#39;IRM in vivo dans qui est généralement acquise à la résolution anisotrope (typiquement des coupes coronales d&#39;épaisseur). Finalement, le tissu peut subir une certaine déformation au cours de la période de fixation au formol et inclusion dans la paraffine (retrait), ainsi que lors de la préparation des lames (pliage, des fissures, des rides). Certaines de ces déformations peut être corrigée en mettant les sections 4-5 um dans un bain d&#39;eau avant de les transférer sur des lames. D&#39;autres déformations peuvent être partiellement résolus en effectuant l&#39;image déformable coregistration des images numérisées histologiques aux images IRM post-mortem. Néanmoins, en minimisant les déformations à la pratique attentive et qualifiée est l&#39;approche la plus efficace pour correspondre volumes IRM à histologie sections. En conclusion, la méthodologie introduite ici permet investigators pour évaluer avec précision la pathologie sous-jacente des résultats de l&#39;IRM. Plus généralement, il est une approche prometteuse pour l&#39;identification et / ou la validation de nouveaux biomarqueurs d&#39;IRM pour les études de recherche qui ciblent les processus pathologiques spécifiques, tels que l&#39;inflammation ou la remyélinisation.

L’IRM in vivo fournit une mesure non invasive et sensible de l’intégrité tissulaire au niveau macroscopique. Les changements dans l’intensité du signal IRM observés in vivo sont des mesures de résultats dans de nombreux essais cliniques en cours. 1 Bien que les changements d’intensité observés par IRM puissent identifier des zones d’anomalie dans le contexte de l’ensemble du cerveau, ils ne sont souvent pas suffisamment spécifiques pour différencier les processus pathologiques. C’est particulièrement vrai pour les processus dynamiques impliquant de multiples pathologies. Par exemple, dans la sclérose en plaques (SEP) ou son modèle animal, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), l’inflammation, l’œdème, la dégradation de la myéline, la destruction axonale, la gliose et la mort neuronale se chevauchent. 2, 3 Pour obtenir la spécificité nécessaire concernant la pathologie sous-jacente, il faut tenir compte du contexte, ainsi que de la connaissance de l’histologie des tissus anormaux identifiés par IRM.
Cependant, même dans les expériences bien contrôlées sur des animaux, l’appariement de l’histologie avec l’IRM in vivo est fondamentalement difficile pour diverses raisons. Tout d’abord, la différence d’échelles dimensionnelles entre les coupes d’histologie et l’IRM est de plusieurs ordres de grandeur. 4 Deuxièmement, pour une comparaison correcte, l’orientation du plan de coupe de l’IRM doit correspondre au plan de coupe du tissu cérébral lorsqu’il est coupé. En raison de la forme du cerveau, il est très difficile de faire des coupes droites et précises lorsque le cerveau est assis sur une surface plane. Troisièmement, la grande taille du cerveau par rapport à une zone d’intérêt potentiellement petite (lésion, tumeur, etc.) crée un scénario d'« aiguille dans une botte de foin » pour le pathologiste qui traite le tissu. Quatrièmement, même lorsque le tissu cible est trouvé, il est généralement traité de telle manière qu’il est pratiquement impossible toute association avec les données IRM originales. Enfin, la section pathologique traditionnelle du tissu cérébral est souvent imprécise et incohérente, ce qui complique encore la comparaison entre les coupes histologiques et les images IRM. 
 Les tentatives précédentes pour surmonter ces défis reposaient sur l’utilisation d’algorithmes de déformation pour co-enregistrer les données et/ou le placement de marqueurs repères à l’intérieur ou autour du tissu comme référence. 5, 6, 7, 8 La première approche nécessite des modèles informatiques complexes qui sont particulièrement sensibles aux complications dues au formatage des données, aux artefacts d’imagerie et aux modifications causées par le traitement des tissus. 4 D’autre part, cette dernière approche introduit la possibilité de contaminer ou d’endommager d’une autre manière le tissu lui-même. 9
L’approche décrite ici améliore la transition entre les modalités grâce à l’utilisation de l’IRM post-mortem pour combler le fossé entre l’IRM in vivo et l’histologie. L’IRM post-mortem fournit des images tridimensionnelles (3D) du cerveau à une résolution plus élevée que celle obtenue in vivo et fournit en outre les données nécessaires à la production d’un modèle morphologiquement précis de la surface du cerveau. Ce modèle numérique peut ensuite être utilisé pour créer un support personnalisé imprimé en 3D pour le cerveau. Grâce à un positionnement soigneux, le support de cerveau permet une section cérébrale précise et orientée IRM, réduisant ainsi le besoin d’algorithmes mathématiques complexes, et permet de se concentrer sur des régions spécifiques pour un échantillonnage ciblé. 
Notre laboratoire a récemment introduit de nouvelles méthodes pour créer des supports et des trancheurs de cerveau personnalisés à l’aide de l’IRM post-mortem et de la technologie d’impression 3D pour les cerveaux humains10 et de ouistitis. 4 Les deux méthodes permettent une corrélation plus précise entre l’IRM et l’histologie dans un cadre de recherche et, en fin de compte, permettent une compréhension plus approfondie de la pathologie spécifique sous-jacente aux anomalies de l’IRM. Des expériences soigneusement conçues, dans lesquelles le cerveau est échantillonné à plusieurs reprises au fil du temps in vivo, peuvent fournir un contexte pour l’interprétation de la pathologie, ce qui peut à son tour ajouter de la spécificité à l’interprétation de l’IRM. Ici, nous présentons un protocole modifié dans un cadre unifié qui peut être appliqué à n’importe quel tissu cérébral, qu’il provienne de primates non humains, de rongeurs ou d’humains. Nous fournissons des instructions détaillées, ainsi qu’une vidéo correspondante, pour le sectionnement des ouistitis. Bien que le protocole global s’applique à tout type de cerveau, en raison des différences dans l’acquisition de l’IRM et la taille des tissus, ainsi que des défis rencontrés lorsqu’il s’agit de types de cerveau spécifiques, il existe certaines différences dans l’approche en fonction du type de cerveau traité. Dans cette présentation, les sections avec « humain » indiqueront les différences de protocole spécifiques au cerveau humain.

<table><tbody><tr><td>7T/30cm USR AVIII Bruker MRI</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>38 mm Bruker Biospin bobine volumique</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fomblin</td><td>Solvay Solexis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylène, Stérile</td><td>Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Éponges de gaze</td><td>Fisher Scientrific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Film de laboratoire polyvalent</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica RM2235 microtome rotatif&nbsp ;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Lames jetables, profil bas (819)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acétate, 0,1 %</td><td>Microscopie</td> électronique aqueuse Sciences <td>26089-01</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue, 0,1 % dans 95 % d’alcool</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>26056-15</td><td></td></tr><tr><td>ETOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2 Extended&nbsp ;</td><td>Ultimaker.75</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kg Officiel Ultimaker de marque PLA&nbsp ; Filament, 2,85 mm, Argent métallisé</td><td>Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Netfabb Professional 5.0.1</td><td>Netfabb</td><td>http://www.netfabb.com/professional.php</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer 10.9.332</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/download.html</td><td></td></tr><tr><td>Mipav 7.2</td><td>NIH CIT</td><td>http://mipav.cit.nih.edu</td><td></td></tr><tr><td>Cura</td><td>Ultimaker</td><td>https://ultimaker.com/en/products/cura-software</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisant la technologie 3d impression de fusion irm avec histologie: un protocole pour brain sectionnement

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet de délimiter les tissus normaux et anormaux à une échelle macroscopique, en échantillonnant un volume tissulaire entier en trois dimensions. Bien que l’IRM soit un outil extrêmement sensible pour détecter les anomalies tissulaires, l’association des changements de signal avec un processus pathologique sous-jacent n’est généralement pas simple. Dans le système nerveux central, par exemple, l’inflammation, la démyélinisation, les lésions axonales, la gliose et la mort neuronale peuvent toutes induire des résultats similaires à l’IRM. En tant que tel, l’interprétation de l’IRM dépend du contexte, et la corrélation radiologique-histopathologique est donc de la plus haute importance. Malheureusement, la section pathologique traditionnelle du tissu cérébral est souvent imprécise et incohérente, ce qui complique la comparaison entre les coupes histologiques et l’IRM. Cet article présente une nouvelle méthodologie pour sectionner avec précision les tissus cérébraux des primates et permettre ainsi une correspondance précise entre l’histologie et l’IRM. Le protocole détaillé décrit dans cet article aidera les chercheurs à appliquer cette méthode, qui repose sur la création de trancheurs de cerveau imprimés en 3D. Légèrement modifié, il peut être facilement mis en œuvre pour les cerveaux d’autres espèces, y compris les humains.

Le flux de travail de cette méthode est résumée dans la figure 1. Une fois que le cerveau est découpé en tranches, une comparaison visuelle entre les images IRM et images des surfaces superficielles des dalles montre un bon match d&#39;orientation sur plusieurs dalles (Figure 2). Une fois que les plaques sont noyées dans de la paraffine, ils sont coupés au microtome et colorées. Une comparaison plus approfondie entre la haute résolution post-mortem IRM et les coupes histologiques colorées démontre une correspondance précise et cohérente à travers toutes les structures du cerveau ouistiti (Figure 3). Dans ce modèle animal de la sclérose en plaques, les animaux développent des lésions de la substance blanche répartis dans la substance blanche cérébrale. Ces lésions peuvent être détectées de manière non invasive en effectuant l&#39;IRM. La figure 4 démontre la capacité de cette technique à élucider le substrat pathologique des résultats de l&#39;IRM. Les petites lésions détectées à l&#39; IRM in vivo peutêtre suivis à la fois sur l&#39;IRM post-mortem et de l&#39;histologie. Comme on le voit dans les encarts, démyélinisation à l&#39;intérieur des lésions est une des principales composantes d&#39;entraînement du changement de signal RM (hypersignal en comparaison avec le tissu environnant). L&#39;histologie et post - mortem IRM peut aussi présenter des lésions manquées sur IRM in vivo (Figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig1.jpg" /> Figure 1. Flux de travail pour la création d&#39; une boîte de trancheuse ouistiti cerveau. Le cerveau est fixé au formol (A1) et une IRM pondérées en T2 sont acquises avec des voxels isotropes de 150 um par arête (A2). Les images sont traitées et seuillés pour créer un masque binaire (A3). La surface est ensuite rendue dans le logiciel de modélisation 3D (A4). Une soustraction Booléenne entre un modèle de trancheuse et le modèle de cerveau crée un modèle numérique de la trancheuse du cerveau (B1). La boîte de trancheuse du cerveau est imprimé sur une imprimante 3D (B2). Le cerveau est alors placé fermement dans la boîte de trancheuse pourcoupe (B3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig2.jpg" /> Figure 2. De gauche à droite: In vivo IRM, post - mortem IRM, et la photographie de la dalle de tissu. Avions Tranchage ont été établies sur la base de l&#39;IRM post - mortem (B) et par rapport à la correspondante in vivo IRM tranche (A) visuellement. Le cerveau est alors coupé et les plaques résultantes ont été jugées cohérentes (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig3.jpg" /> Figure 3. haute résolution post - mortem IRM et l&#39; histologiesection correspondante. Dalles ont été inclus dans la paraffine, coupés avec un microtome en 4 sections um et colorées avec le bleu et le violet de crésyl rapide (B). Les sections ont ensuite été visuellement en correspondance avec le T2 * 100 um weighted IRM basée sur les structures du cerveau (A). Détails pour l&#39;acquisition de cette image sont dans la section supplémentaire du protocole et le tableau 1. Les structures du cerveau: (1) flèche rouge = capsule interne, flèche bleue = commissure antérieure; (2) flèche rouge = putamen, flèche bleue = tractus optique; (3) flèche rouge = caudé, flèche bleue = hippocampe; (4) flèche rouge = corps calleux, flèche bleue = aqueduc cérébral; (5) flèche rouge = colliculus inférieur, flèche bleue = faisceau pyramidal. La boîte en pointillés B1 indique une tranche où, que ce soit lors de la coupe du cerveau ou de la paraffine plongement, une erreur a provoqué une légère rotation autour de l&#39;axe Y, conduisant à décalage de la commissure antérieure sur la gauche. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une</a>une plus grande version de ce chiffre. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig4.jpg" /> Figure 4. Suivi des lésions de l&#39; IRM in vivo à la section de l&#39; histologie. L&#39;IRM in vivo en a montré aucune preuve convaincante de signal hypersignal anormal de suggérer des lésions dans les deux voies optiques (A1). Cependant, l&#39;IRM haute résolution post-mortem montre hyper intenses lignes claires dans les deux voies optiques (A2). Le jeûne bleu / violet de crésyl tache d&#39;une section de 4 pm histologie montre que les zones hyperintenses visibles sur l&#39;ex vivo IRM sont démyélinisation (A3). Dans la substance blanche cérébrale, l&#39;IRM in vivo montre hyperintensité subtile bilatéralement (B1, élargie dans les encadrés). Les zones hyperintenses sont plus évidentes sur la haute résolution post-mortem IRM (B2). La tache LFB d&#39;une section 4 um d&#39;histologie montre que ces zones sont de démyélinisation (B3). Après comparaison avec la ligne de base in vivo IRM et une tache hématoxyline-et-éosine, le côté droit a été déterminé à être une anomalie anatomique, pas une lésion démyélinisée. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="fichiers de code supplémentaires" src="/files/ftp_upload/54780/54780supplementalfiles.jpg" /> Fichiers de code supplémentaires. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a> Brain_Slicer_Parts_Human.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Human.stl" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a> Cap_Insert.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Cap_Insert.stl" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

L&#39;objectif global de ce protocole est d&#39;aligner avec précision imagerie par résonance magnétique (IRM) des volumes d&#39;image avec coupes histologiques par la création de supports de cerveau personnalisés 3D-imprimés et les boîtes de trancheuse.

Utilisant la technologie 3D Impression de fusion IRM avec histologie: Un protocole pour Brain Sectionnement

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

L'objectif général de ce protocole est d'aligner précisément des volumes d'images d'imagerie par résonance magnétique avec des sections histologiques grâce à la création de supports cérébraux personnalisés imprimés en 3D et de boîtes de découpage. Bien que cette vidéo se concentre sur les tissus cérébraux extraits du marmouset, ce protocole peut être appliqué à tout cerveau, qu'il provienne d'un rongeur, d'un primate non humain ou d'un humain. Préparez un poste de travail comme décrit dans le protocole.Remplir le tube avec du Fomblin et du coton jusqu'au trait de 20 millilitres. Compresser le coton pour éliminer les bulles d'air au fur et à mesure. Sécher délicatement le cerveau du formol.Ensuite, insérez le cerveau avec la face avant orientée vers le fond du tube. Fixez soigneusement le cerveau dans le tube à l'aide de gaze placée autour des côtés du cerveau afin d'assurer sa position. Remplissez le reste du tube avec de la gaze et du Fomblin.Retirez soigneusement les bulles d'air au fur et à mesure. Ensuite, fixez le bouchon et scellez le tube avec du paraffine. Marquez le bouchon et la ligne selon la scissure interhémisphérique.Ensuite, enveloppez le tube dans une serviette en papier et insérez-le dans la bobine avec la marque en position centrale supérieure. Insérez la bobine dans le scanner IRM. Après l'acquisition et le post-traitement, nous obtenons une image pondérée en T2 que nous pouvons utiliser pour créer un modèle numérique du cerveau.Ouvrez l'IRM en orientation coronale. Ensuite, utilisez les outils de transformation pour rééchantillonner l'image en voxels isotropes d'1 millimètre. Appliquez ensuite un filtre de réduction du bruit non linéaire.Sélectionnez la table de consultation des affichages. Ensuite, cliquez sur le bouton Seuil double. Faites glisser le curseur sur le graphique pour couvrir tout le cerveau.Créez un masque binaire du cerveau à l'aide de l'algorithme de segmentation Seuil utilisant les valeurs min/max. Saisissez la valeur située dans le coin inférieur gauche du graphique d'intensité, juste en dessous de l'échelle, dans la case Limite inférieure. Ensuite, sélectionnez Binaire et décochez la case Inverser le seuil.Sélectionnez l'algorithme morphologique, Remplir les trous. Cochez Traiter en 2,5D. Pour combler l'espace entre le cerveau postérieur et le cortex, sélectionnez la ligne VOI.Tracer une connexion entre le cervelet et le cortex de chaque côté du cerveau au point le plus latéral. Poursuivre le tracé des connexions des volumes d'intérêt (VOI) à travers le cerveau. Convertir les volumes d'intérêt en une masque binaire.Utilisez le calculateur d'image pour combiner les masques binaires de VOI et du cerveau en sélectionnant l'opération OU. Sélectionnez Promouvoir le type d'image de destination. Sélectionnez maintenant l'algorithme morphologique : Remplissage des trous.Et vérifiez le traitement en 2,5D. Sélectionnez l'algorithme d'extraction de surface, sélectionnez l'image de masque, saisissez un nom, puis choisissez le type de fichier ply. Les espaces dans la boîte de découpe correspondent à l'emplacement du plan de coupe peuvent être positionnés à partir de l'avant du cerveau, de l'arrière du cerveau ou par rapport à une zone d'intérêt, comme les lésions observées ici dans la matière blanche.À l'aide de la VOI de type boîte, dessinez un cadre autour du cerveau. Copiez et collez ce cadre sur le nombre de coupes IRM correspondant à l'épaisseur prévue des espaces entre plaques. Puis avancez du nombre de coupes IRM par section et répétez l'opération de placement du cadre comme précédemment afin de créer un nouvel espace entre plaques.Répétez ce processus sur l'ensemble du cerveau. Inversez les volumes d'intérêt (VOI) en une masque binaire. Ensuite, extrayez la surface à l'aide de l'outil d'extraction de surface, comme précédemment pour le cerveau.Sélectionnez le masque binaire de l'écartement de la lame. Utilisez le calcul d'image pour le multiplier par 10 000. Ensuite, utilisez la calculatrice d'image pour ajouter le masque binaire multiplié à l'IRM isotrope rééchantillonnée.En sélectionnant maintenant la vue triplan, une carte IRM en lame montrant l'emplacement où le cerveau sera sectionné peut être visualisée selon trois plans orthogonaux. Dans Netfabb Professional, sélectionnez Ajouter une pièce. Puis sélectionnez le modèle d'espacement des lames et les modèles de cerveau au format ply.Sélectionnez le modèle de cerveau et cliquez sur le mode de réparation. Utilisez le bouton de sélection de coque pour sélectionner le cerveau. Ensuite, basculez la sélection vers les autres coques et supprimez-les.Ensuite, appliquez la réparation et retirez l'ancienne partie. Avec le cerveau sélectionné, sélectionnez Déplacer. Cliquez sur l'origine et enregistrez les paramètres dans les cases X, Y et Z.Elles sont nécessaires pour maintenir le positionnement de l'écartement de la lame. Cliquez sur traduire. Et fermez la fenêtre.Sélectionnez le modèle Écartement de la lame et traduisez-le en utilisant les paramètres enregistrés lors de l'étape précédente. Sélectionnez le modèle Cerveau et cliquez sur le mode réparation. Utilisez le bouton de sélection de coque pour sélectionner le cerveau.Ensuite, sélectionnez Triangles lisses. Saisissez quatre comme nombre d'itérations. Et cochez Prévenir la réduction du volume.Sélectionnez Réduire les triangles et saisissez 200000 dans la zone Nombre cible de triangles. Ensuite, sélectionnez Réparation automatique et effectuez une réparation par défaut. Appliquez la réparation.Ensuite, exporter le modèle cérébral lissé au format STL. Importer le modèle cérébral lissé dans Meshmixer. Utiliser les outils de sculpture pour lisser les zones en dessinant avec les VOI en ligne.Et corrigez tout autre défaut mineur du modèle. Importez le modèle cérébral lissé et modifié dans Netfabb Professional. Ensuite, ajoutez la pièce, les composants du découpeur cérébral pour le marmouset.Sélectionnez les coques pour les séparer en pièces. Renommez ensuite chaque pièce comme décrit dans le protocole. À l’aide des paramètres de sélection décrits dans le protocole, cliquez et faites glisser les pièces afin de positionner le cerveau au centre de la boîte.Cliquez et faites glisser les pièces pour ajuster la profondeur du cerveau dans la boîte. Sélectionnez le modèle de cerveau lissé et modifié, puis dans le modèle découpé de la boîte, sélectionnez l'opération booléenne. Cliquez sur le modèle de cerveau pour le rendre rouge.Et sélectionnez la soustraction booléenne. Appliquez les calculs. Cochez la case pour les débords qui empêcheraient un positionnement adéquat du cerveau.Se référer à la section supplémentaire du protocole pour une méthode permettant de les éliminer. Sélectionner le modèle d'écartement de lame et cliquer sur déplacer. Enregistrer à la position Z.Ce sera la position de l'ouverture de lame la plus postérieure. Ensuite, fermez la fenêtre. Sélectionnez la pièce de lame parmi les composants du découpeur de cerveau et cliquez sur Déplacer.Saisissez la valeur Z de l'étape précédente. Saisissez ensuite les valeurs de position actuelles X et Y. Sélectionnez la translation absolue, puis effectuez la translation.Cliquez sur Dupliquer. Si l'épaisseur des sections est constante, comme indiqué ici, saisissez le nombre total de lames et le nombre total ainsi que le nombre Z, puis entrez l'épaisseur des sections dans la case Écart Z. Ensuite, sélectionnez dupliquer.Sélectionnez la pièce de la lame du microtome parmi les composants du découpeur de cerveau. Répétez les mêmes étapes de déplacement et de duplication que celles effectuées pour la pièce de la lame. Sélectionnez toutes les lames de microtome ainsi que le support principal de lame, puis cliquez sur l'opération booléenne.Sélectionnez toutes les lames de microtome pour les rendre rouges, puis cliquez sur la soustraction booléenne. Appliquez ensuite les calculs. Entrez en mode de réparation et sélectionnez la réparation automatique.Effectuez une réparation étendue et appliquez-la. Exportez le support de lame au format STL. Sélectionnez toutes les lames, les boîtes principale et secondaire, ainsi que le modèle cérébral lissé et modifié, puis cliquez sur l'opération booléenne.Utilisez la fenêtre de sélection des pièces pour rendre toutes les pièces rouges, à l'exception de la boîte principale. Ensuite, sélectionnez la soustraction booléenne. Appliquez les calculs.Entrez en mode de réparation et cochez la case pour les arêtes vives qui pourraient blesser le cerveau. Celles-ci peuvent être réparées en mode de réparation de Netfabb ou à l’aide des outils de sculpture dans Meshmixer.Ensuite, sélectionnez Réparation automatique. Effectuez une réparation étendue. Appliquez ensuite la réparation.Exporter la boîte cérébrale au format STL. Dans Cura, sélectionnez Charger et importez la boîte cérébrale. Cliquez sur le bouton Rotation.Ensuite, cliquez et faites glisser pour aplatir la boîte. Modifiez les paramètres d'impression comme indiqué dans le protocole. Puis enregistrez le chemin d'outil.Suivez le même processus pour le support de lame et dupliquez également l'objet. Ensuite, enregistrez le chemin d'outil. Après avoir appliqué une fine couche de colle sur le plateau d'impression, imprimez la boîte cérébrale et les supports de lame sur l'imprimante 3D en utilisant les paramètres décrits dans le protocole.Une fois les impressions terminées, le cerveau peut être préparé pour la découpe. Installez un poste de travail comme décrit dans le protocole. Placez soigneusement le cerveau dans la boîte et assurez-vous qu'il est bien fixé en place.Placer les lames de microtome dans les supports de lame, puis insérer ceux-ci dans les fentes correspondantes de la boîte. En portant des gants de protection, appuyer fermement sur les supports de lame. Exercer une pression lente et uniforme pour couper le cerveau.Retirez les tranches une par une en commençant par l'avant du cerveau. Bien que cette approche soit simple, la méthode nécessite de nombreuses étapes ainsi que l'utilisation de plusieurs types de logiciels, et les chercheurs doivent se familiariser avec les interfaces utilisateurs avant de commencer la procédure. Ce flux de travail résume le protocole de fabrication de la boîte de découpe du cerveau du marmouset.Le cerveau est fixé avec du formol et une IRM pondérée en T2 est acquise à 150 microns. Les images sont traitées et seuillées pour créer un masque binaire. La surface est ensuite rendue dans un logiciel de modélisation 3D.Une soustraction booléenne entre un modèle de découpe et le modèle numérique du cerveau permet de créer le modèle numérique du découpeur de cerveau. La boîte du découpeur de cerveau est ensuite imprimée sur une imprimante 3D. Le cerveau est alors placé fermement dans la boîte du découpeur pour être découpé.Une fois que le cerveau est tranché, une comparaison visuelle entre les images IRM in vivo et post-mortem ainsi que les photographies des surfaces superficielles des tranches révèle une bonne concordance d'orientation à travers plusieurs tranches. Une comparaison plus approfondie entre l'IRM post-mortem haute résolution et les sections histologiques colorées à l'HE-MB de plusieurs tranches cérébrales démontre une concordance précise et constante à travers toutes les structures du cerveau du marmouset. Chez ce modèle animal de sclérose en plaques, les animaux développent des lésions de la substance blanche réparties dans tout le cerveau.Grâce à cette technique, de petites lésions détectées par IRM in vivo peuvent être suivies aussi bien sur les sections d'IRM post-mortem que sur les coupes histologiques. L'histologie et l'IRM post-mortem peuvent également révéler des lésions passées inaperçues en IRM in vivo. Ici, l'IRM in vivo ne montrait pas de preuve convaincante de signal hyperintense normal, suggérant l'absence de lésions dans l'un ou l'autre des faisceaux optiques.Néanmoins, lors de l'IRM post-mortem, des hyperintensités du signal dans le tractus optique ont été observées. Et ces régions correspondaient directement aux lésions myélinisées visibles sur la coupe histologique LFB CV. En conclusion, la méthodologie présentée ici permet aux chercheurs d'évaluer précisément la pathologie sous-jacente aux découvertes en IRM.Nous pensons qu'il s'agit d'une approche prometteuse pour l'identification de nouveaux biomarqueurs de maladies impliquant le cerveau et de processus pathologiques spécifiques tels que l'inflammation et la remyélinisation.

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