À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

L’objectif global de cette méthodologie de test PCR en temps réel est de détecter ensemble les agents pathogènes à base d’ADN et d’ARN à haut débit. Les acides nucléiques des échantillons cliniques seront pré-amplifiés à l’aide d’un pool d’amorces commun chargé sur une plaque OpenArray et analysés pour détecter la présence d’agents pathogènes. Cette méthode peut contribuer à promouvoir les efforts de surveillance de l’approche « Une seule santé » pour les maladies infectieuses.

Par rapport aux techniques traditionnelles, cette méthode permet de tester plus d’échantillons pour plus de cibles sans se faire concurrence, améliorant ainsi l’efficacité des tests. La méthode utilise une plaque PCR personnalisée à l’échelle nanométrique. Les amorces et les sondes sont imprimées sur les bords des trous traversants et les échantillons sont chargés à l’aide d’un manipulateur de liquide.

Nous ferons la démonstration de la méthode sur des échantillons cliniques testés pour un panel d’agents pathogènes respiratoires de chevaux et de chiens. Pour commencer cette procédure, concevez la plaque comme décrit dans le protocole texte. La plaque utilisée ici est configurée avec 18 cibles en trois exemplaires.

Ajoutez du milieu aux écouvillons et aux lavages trachéaux de manière à ce qu’il y ait au moins un à deux millilitres de liquide. Agitez vigoureusement l’écouvillon et le DMEM dans le tube. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez environ 1 millilitre de média dans un nouveau tube.

Ajoutez 235 microlitres de tampon de lyse et 175 microlitres d’échantillon dans chaque tube à billes. Procédez avec le protocole du fabricant pour extraire l’acide nucléique total. Préparez-vous à la transcription inverse et à la préamplification de l’acide nucléique ou du préampli comme décrit dans le protocole de texte en vérifiant d’abord la carte d’échantillon.

Ajoutez 8,5 microlitres de préampli master mix et 5,5 microlitres d’échantillon d’ADN/ARN dans chaque puits d’une plaque standard de 96 puits en utilisant uniquement le côté gauche de la plaque. Après avoir combiné les échantillons, les commandes positives et les commandes négatives avec le mixage du préampli, scellez soigneusement la plaque standard à 96 puits avec un joint adhésif transparent. Retirez tout excès de joint à l’aide d’une lame de rasoir pour éviter la formation d’espaces d’étanchéité pendant le cyclage.

Centrifugez la plaque scellée pendant 20 secondes à l’aide d’une centrifugeuse à plaque PCR. Assurez-vous que tous les réactifs sont combinés au fond des puits de la plaque. Après avoir allumé un thermocycleur conventionnel, sélectionnez le programme de cycle de préampli et démarrez le programme.

Placez la plaque à 96 puits dans le thermocycleur uniquement lorsque la partie inférieure du thermocycleur atteint la température requise pour la production d’ADNc en surveillant la lecture de la température sur l’écran. Une fois le fonctionnement du préampli terminé, vérifiez que la plaque est restée scellée. Après avoir enfilé les gants doubles et les couvre-manches, retirez le joint de la plaque du préampli.

Ensuite, retirez et jetez soigneusement les gants extérieurs. Diluez les produits de préampli un à cinq en ajoutant 56 microlitres de tampon TE à chaque puits des colonnes un à six de la plaque de préampli à 96 puits et mélangez en pipetant de haut en bas. Pour ce faire, allez uniquement à la première butée de la pipette, aspirez par le bas et distribuez plus haut mais ne créez pas de bulles.

Ajoutez du tampon TE aux six colonnes, quels que soient les puits inutilisés. Préparez le transfert à 384 puits vers la plaque d’amplification comme décrit dans le protocole texte. Une fois les étapes de préparation terminées, mettez de nouveaux gants doubles et des couvre-manches bien ajustés.

En raison des taux d’évaporation élevés lors du pipetage de petits volumes, il est essentiel de distribuer efficacement le master mix et l’échantillonnage et de sceller la plaque immédiatement. Ajoutez 2,5 microlitres de master mix d’amplification à une plaque de 384 puits. Les plaques blanches sont utilisées ici à des fins de démonstration, mais les plaques noires doivent être utilisées pour réduire la fatigue oculaire.

Transférez 2,5 microlitres du produit de préampli dilué sur la plaque à 384 puits selon la carte dans le protocole texte. Les dés colorés présentés ici illustrent la séquence de transfert d’une pipette à canal fixe. Couvrez immédiatement la plaque hermétiquement avec un joint en aluminium.

Jetez les gants extérieurs et les couvre-manches. Centrifugez la plaque à 384 puits pendant 20 secondes dans la centrifugeuse à plaques PCR. Ne retirez pas le joint en aluminium, mais placez la plaque à 384 puits dans le manipulateur de liquide.

Ouvrez l’emballage contenant une plaque d’amplification encastrée et placez-la soigneusement dans le manipulateur de liquide dans la première fente avec le numéro de série à droite, tenez le boîtier par les bords sans toucher la surface de la plaque. Retirez le joint en aluminium de la plaque à 384 puits à l’intérieur du manipulateur de liquide une fois que tout est en place. Cliquez sur Suivant, puis cochez toutes les cases à la fin de chaque étape.

Fermez la porte du manipulateur de liquide et lancez immédiatement le processus de remplissage. Restez à côté du manipulateur de liquide et passez immédiatement à l’étape suivante une fois la plaque remplie. Pendant que le manipulateur de liquide fonctionne, retirez le film protecteur du bas du couvercle d’un boîtier.

Laissez le film supérieur en place. Amorcez le ruban rouge en tirant légèrement pour le libérer de l’adhésif. Retirez la plaque d’amplification chargée du manipulateur de liquide et placez-la délicatement dans la presse à plaques avec le numéro de série à droite.

Placez le couvercle sur le dessus de la plaque avec l’extrémité crantée à droite et l’adhésif en bas. Tirez sur la plaque et fermez soigneusement le levier de la presse, la lumière clignotera pendant 20 secondes. Ne touchez pas la presse à plaques pendant ce temps.

Une fois que le voyant devient vert fixe, soulevez le levier et retirez délicatement la plaque scellée en la tenant sur les bords. Tout en tenant la plaque d’amplification scellée verticalement par les bords de l’étui, insérez immédiatement l’embout de la seringue dans l’orifice de chargement à l’extrémité de l’étui, puis distribuez lentement le liquide d’immersion en un mouvement doux et continu pour remplir l’espace entre la plaque et le couvercle. Laissez une petite bulle d’air dans le coin une fois l’assiette immergée.

Tout en continuant à maintenir la plaque verticalement par les bords, scellez l’orifice de chargement en insérant le bouchon dans l’orifice et en tournant le bouchon dans le sens des aiguilles d’une montre, appliquez une pression suffisante jusqu’à ce que la poignée se brise. Nettoyez le boîtier avec une lingette non pelucheuse qui a été soigneusement pulvérisée d’éthanol. Pour sécher le boîtier, essuyez-le vers le bas avec une lingette propre.

Amenez la plaque scellée à la machine d’amplification. Sous l’onglet Instrument, sélectionnez Console d’instruments. Sélectionnez la machine d’amplification, puis cliquez sur le bouton d’ouverture de la porte.

Placez la plaque d’amplification dans la première fente de l’adaptateur de plaque, en vérifiant que l’adaptateur est correctement aligné avec celui dans le coin supérieur gauche. Orientez la plaque avec le code-barres vers le haut et vers l’avant de l’instrument. Après avoir cliqué sur le bouton de fermeture de la porte, accédez à l’onglet Accueil en bas de l’écran.

Dans le menu Exécuter, sélectionnez OpenArray. Cliquez sur Obtenir les ID de plaque. Pour commencer l’exécution, cliquez sur Démarrer l’exécution.

Ouvrez une feuille de calcul contenant la macro de résultats. Dans le fichier de données exporté, faites un clic droit sur l’onglet en bas de l’écran et sélectionnez déplacer ou copier. Dans le champ Réservation, sélectionnez macro de résultats.

Cliquez ensuite sur déplacer pour terminer et cochez la case Créer une copie. Enfin, cliquez sur OK. Supprimez l’ancien onglet d’exportation, puis renommez l’onglet nouvellement ajouté en exportation.

Cliquez sur Afficher, puis sur Macros, puis sur Macro, puis sur Exécuter. Ensuite, répétez cette opération pour la macro2 en cliquant sur afficher puis sur macros, en sélectionnant Macro2 et en cliquant sur exécuter. Dans le logiciel de la machine d’amplification, vérifiez les courbes de chaque échantillon et contrôlez-le par rapport à la table de macros en sélectionnant le tracé d’analyse/amplification sur le côté gauche de l’écran.

Ensuite, sélectionnez l’onglet échantillon et cliquez sur chaque échantillon pour confirmer qu’il existe deux ou trois courbes d’amplification positives pour chacun des résultats positifs du tableau. Les lectures de fluorescence sont tracées en fonction des cycles d’amplification pour illustrer que la PCR en temps réel a été réalisée avec succès. La plupart des échantillons ont atteint des seuils relatifs entre les cycles deux et 25 de la réaction PCR en temps réel.

Des courbes standard exécutées sur trois jours différents sont tracées pour démontrer la linéarité et la plage d’amplification à l’aide de commandes positives. Les valeurs seuils de cycle sont tracées en fonction du logarithme de base 10 du nombre de copies de l’étalon d’acide nucléique. Les deux macros rempliront les noms des échantillons dans la première colonne et la moyenne des trois valeurs Ct pour chaque cible pour celles qui ont des résultats positifs.

Les cibles qui n’ont pas été amplifiées apparaissent en blanc dans ce tableau. Des résultats quantitatifs pour 10 échantillons cliniques et quatre contrôles de routine sont montrés, comme c’est le cas ici, le contrôle d’amplification négative doit être négatif pour toutes les cibles et le contrôle d’extraction négatif ne doit contenir que le contrôle interne. Un échantillon de cet ensemble montre un échec du contrôle interne, ce qui indique la présence d’inhibiteurs dans l’échantillon.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la réalisation d’une expérience de PCR à l’échelle nanométrique. Cette procédure facilitera l’exécution de panels basés sur le syndrome dans les diagnostics vétérinaires. Cette méthode peut être adaptée pour inclure des essais sur les agents causaux de nombreuses maladies infectieuses différentes.