Name: À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez une méthode PCR à haut débit pour détecter simultanément des pathogènes ADN et ARN dans des échantillons respiratoires de chiens et de chevaux. Cette technique améliore l'efficacité des diagnostics vétérinaires.

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Les travaux sur les tests de pathogènes respiratoires décrites ici a été soutenu par Cornell animaux Centre de diagnostic de la santé des fonds de développement interne. Développement de l&#39;échelle nanométrique de workflow PCR et des systèmes d&#39;assurance qualité associés a été partiellement financé (FOA PA-13-244) et réalisée en collaboration avec Veterinary Laboratory Investigation de la Food and Drug Administration et Response Network (FDA Vet-LIRN) sous Grant No. 1U18FD005144- 01. Les frais de publication ont été parrainés par VWR et Quanta Biosciences. Nous remercions Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, et Katrina Walker pour leur aide à l&#39;écriture et la révision du protocole. Nous remercions Mike Carroll pour filmer les entrevues avec des auteurs. Nous remercions enfin le rédacteur en chef et trois examinateurs anonymes pour leurs commentaires utiles.

<ol><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123(2006).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+%28RT-PCR%29%3A+trends+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li>
<li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138(2016).</li>
<li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li>
<li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+screening+for+blood-borne+viral%2C+bacterial%2C+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li>
<li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li>
<li>Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li>
<li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Equine+Pract%22%5BJournal%5D)">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li>
<li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+of+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li>
<li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li>
<li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory%2C+a+Model+for+the+One+Health+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li>
<li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+of+Ticks%3A+The+Rule+Rather+Than+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539(2016).</li>
</ol>

Marcia Slater et Elen Ortenberg sont des employés de Thermo Fisher Scientific Inc. qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Cette procédure a été utilisée pour les tests de routine des agents pathogènes respiratoires dans notre laboratoire au cours des six mois (2-3 fois par semaine). Nous avons également eu du succès en utilisant la même procédure pour entérique profilage des agents pathogènes dans des échantillons fécaux et isolats bactériens sur une plaque séparément sur mesure. Une fois que les plaques sont produites, le personnel expérimenté peut effectuer les étapes 2-7 en une journée normale de travail. Les étapes les plus critiques sont la bonne étanchéité de la plaque de préamplification, le transfert d&#39;échantillons préamplifiés entre les plaques (ce qui doit être fait rapidement afin d&#39;éviter l&#39;évaporation), et le revêtement final de la plaque d&#39;amplification. L&#39;utilisation de la feuille de macro comme un guide pour l&#39;analyse des résultats (vérification des courbes pour les échantillons et les témoins) était également essentielle, car elle réduit considérablement la quantité de temps et de documents nécessaires pour ce processus. La feuille de calcul fournie macro est un exemple; il serait nécessaire de modifier ou recréées pour des plaques avec des configurations différentes. Cela peut facilement être performed par une personne ayant des connaissances de base de la feuille de calcul. En raison de la très petite quantité d&#39;échantillon a été chargé sur la plaque d&#39;amplification (33 nl), pré-amplification est nécessaire. L&#39;optimisation de ce protocole (non représenté), nous avons comparé un certain nombre de paramètres de préamplification comprenant le mélange maître, l&#39;addition d&#39;amorces aléatoires, le nombre de cycles, le temps de recuit, et une dilution avant l&#39;amplification. Chaque cible a ses propres conditions optimales, et celles qui sont décrites ici représentent ceux qui a abouti à la meilleure limite de détection globale de notre panel. Ce panneau couvre un large éventail de cibles pathogènes et les types d&#39;échantillons que l&#39;on rencontre dans les tests de diagnostic vétérinaire de routine, mais des modifications aux procédures de préamplification peut être nécessaire pour les différents panneaux. Les conditions d&#39;amplification du fabricant optimisées sont basées sur un système en temps réel protocole de PCR standard à base de sonde avec une 10 min à 95 ° C activation enzymatique suivie d&#39;une dénaturation à 95 ° C et Annealing / allongement à 60 ° C. Les amorces et les sondes sont pré-imprimé sur les plaques en utilisant des conditions aussi du fabricant optimisé et ne nécessitent donc pas de titrage. En combinant les reverse-transcription et de pré-amplification étapes pour tous les échantillons (quel que soit le type de cible) était nécessaire afin de maintenir l&#39;efficacité du flux de travail. Tous les échantillons ayant subi une transcription inverse est également bénéfique pour maximiser la sensibilité. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un mélange maître pour le préampli qui est optimisé pour les inhibiteurs minimisant permet une polyvalence en combinant différents types d&#39;échantillons sur la même plaque. Le Center for Disease Control (CDC) de dosage de la matrice de la grippe décrite par Shu et al. 7 et adapté ici pour des réactions à l&#39;échelle de nanolitre est une grippe universelle Un test qui est approprié pour tester des échantillons provenant d&#39; êtres humains et les animaux de compagnie. Il a été conçu pour la détection universelle du gène de la matrice de tous les virus de la grippe A en utilisant rea échelle microlitresctions. Il a été utilisé dans le monde entier dans le cadre d&#39;un groupe spécial de virus CDC grippe humaine et un groupe spécial de la grippe porcine CDC. Le EHV-1 test 8 adapté ici détecte un important pathogène respiratoire des chevaux qui peuvent causer des avortements et des maladies neurologiques (revue par Pusterla et Hussey 10). L&#39;importance de l&#39;adaptation de ces tests pour une plate-forme à haut débit avec un contrôle interne des espèces indépendantes est qu&#39;elles peuvent être intégrées dans une approche de surveillance OneHealth. Ayant à la fois de ces essais sur une plate-forme de test à haut débit facilitera la préparation aux urgences pour les installations cliniques, des abris et des événements de performance. Les résultats décrits ci - dessus sont représentatifs de toutes les cibles sur la plaque à l&#39;exception de Mycoplasma cynos, qui a montré beaucoup plus de variation dans la performance analytique. Cela était probablement due à la température sous-optimale fusion (Tm) des amorces, ce qui devrait idéalement être 58-60 &amp;# 176; C (la sonde idéale Tm est 68-70 ° C). Une limitation de cette plate-forme est que cela prend plus de temps pour concevoir et fabriquer les plaques que pour commander des sondes individuelles, ce qui limite la capacité de modifier rapidement des séquences. Une autre limitation de la PCR en temps réel, en général, est l&#39;incapacité à détecter des agents pathogènes nouveaux ou inattendus. Ceci peut être surmonté dans une certaine mesure par la conception des dosages qui correspondent à des séquences dans plusieurs espèces, mais méthodologies basées sur le séquençage du génome entier authentiques sont plus appropriés pour la découverte de nouveaux agents 11,12 . PCR Nanoscale en temps réel permet à un nouveau paradigme pour les tests plutôt que sur la base des espèces, ce qui est utile pour réduire réactifs et le coût du travail dans le diagnostic moléculaire à haut débit basé sur les syndromes. Test du panneau à grande échelle par cette approche peut faciliter les efforts de surveillance OneHealth tels que ceux décrits par Dunne et Gurfield 13 et Moutailler et al. 14. Prélèvement d&#39;échantillons de frottis tôt,généralement dans les 3 jours suivant l&#39;apparition clinique, fournit la meilleure chance d&#39;identifier la présence d&#39;agents pathogènes respiratoires. l&#39;émergence de maladies infectieuses est souvent imprévisible, et des tests qui peuvent être effectuées sur des espèces différentes sans nécessiter de modification des réactifs sont idéales pour la préparation. Les futures applications de cette technologie sont susceptibles d&#39;être en pathotypage, antimicrobien profilage de la résistance, et d&#39;autres panneaux cliniques de diagnostic basés sur le syndrome. PCR Nanoscale en temps réel est très utile pour rapide, criblage à haut débit de types d&#39;échantillons et d&#39;agents pathogènes multiples, et serait complétée par des approches fondées séquençage impartiales ou partiellement biaisées pour identifier les agents pathogènes nouveaux et émergents.

Avec la demande pour la détection rapide et complète de plusieurs agents dans le diagnostic clinique pour les humains et les animaux, les méthodes de diagnostic moléculaire unique organisme pour la détection des pathogènes sont lourdes à moins utilisé pour un grand nombre d&#39;échantillons ont été soumis à une seule maladie. Dans le contexte vétérinaire, les méthodes de diagnostic à haut débit sont particulièrement importants en raison de la nécessité supplémentaire pour couvrir les agents pathogènes à partir d&#39;une grande variété d&#39;espèces. OneHealth approches pour la gestion des maladies d&#39;origine alimentaire et à la surveillance des agents pathogènes émergents sont des exemples de besoins de test qui incluent un certain nombre de bactéries, (à base d&#39;ADN ou ARN) des virus, des parasites et des champignons. Le défi de combiner des tests pour plusieurs analytes ensemble (multiplexage) afin d&#39;améliorer l&#39;efficacité des tests est une éventuelle perte de sensibilité et d&#39;une grande charge pour l&#39;optimisation et la validation des tests. En temps réel échelle nanolitres réaction en chaîne par polymérase (PCR) est un alternative à la pratique de multiplexage qui permet de nombreuses réactions séparées de fonctionner simultanément sur le même échantillon 1. La plate - forme OpenArray est une application de ce principe 2; il combine la technologie des microréseaux avec la PCR en temps réel. Basé sur le concept de multiplexage spatial, chaque échantillon est testé pour un grand nombre de cibles dans séparés par des trous. Cette plate - forme a été initialement utilisée avec la chimie de liaison d&#39; ADN double brin à base de cyanine-2 et est maintenant disponible pour la chimie à base de sonde en utilisant des sondes de trempe sombres 3. Cette plate - forme a été principalement utilisé pour le profilage génétique chez les humains et les animaux 4 5. Il a récemment été conçu pour détecter l&#39; ADN et l&#39; ARN des agents pathogènes transmis par le sang par Grigorenko et al. , 6 en utilisant une transcription inverse / préamplification (préamplificateur) , procédure en deux étapes. Nous décrivons ici une procédure basée préampli-en une seule étape pour détecter les deux types d&#39;agents pathogènes dans les sec respiratoiresretions et une variété d&#39;autres types d&#39;échantillons qui peuvent être exécutées entièrement dans une journée normale de travail. Après achèvement de la pré-ampli en une seule étape, les échantillons sont transférés à une plaque à 384 puits, ce qui est le format accepté par le système de manipulation de liquides automatisé qui vient avec cette plate-forme par PCR à l&#39;échelle nanométrique. Le système dessine le mélange maître et de l&#39;échantillon à travers la surface jusqu&#39;à 4 plaques (192 échantillons et contrôles) à la fois. Suite à ce processus de chargement, nous décrivons comment les échantillons sont amplifiés et analysés en utilisant une feuille de calcul macro qui résume la moyenne de 3 répétitions techniques pour chaque combinaison échantillon / cible dans une table qui tient sur une page imprimée. Un procédé uniforme pour l&#39;analyse de l&#39;ADN extrait et / ou de l&#39;ARN à partir d&#39;échantillons à l&#39;aide de cette plate-forme a été établie. Une grande variété d&#39;échantillons ont été extraits, une transcription inverse, et pré-amplifié dans un format de 96 puits, ce qui minimise les risques d&#39;erreurs. échantillons respiratoires testés comprenaient des écouvillons nasaux, écouvillons pharyngés profonds,lavage trans-trachéale, lavage broncho-alvéolaire et le tissu pulmonaire. Étant donné que certains des agents testés peuvent également être présents dans le sang périphérique ou des matières fécales, nous avons incorporé les types d&#39;échantillons dans la procédure. Ce flux de travail simplifié permet d&#39;économiser du temps et des ressources par rapport à l&#39;exécution d&#39;expériences dans de multiples plaques en permettant le test efficace par l&#39;agent pathogène et la toxine détection de gènes à base de panneau en place des tests individuels. Le panneau respiratoire démontré ici avait 18 essais chacun imprimés en triple trous traversants, pouvant accueillir jusqu&#39;à 48 échantillons par plaque. Les agents pathogènes équins détectés inclus adénovirus équin 1 et 2, le virus de l&#39; artérite équine, le virus de la rhinite équine A et B, virus de l&#39; herpès équin (EHV) de types 1 et 4, et Streptococcus equi. Les agents pathogènes canins inclus coronavirus canin respiratoire (betacoronavirus), le virus de la maladie de Carré, l&#39; adénovirus canin, le virus parainfluenza canin, pneumovirus canine, Bordetella bronchiseptica et cynos Mycoplasma. UNEla grippe universelle Un dosage et un contrôle interne (MS2 ARN du phage) ont également été inclus.

<table><tbody><tr><td>Réactif lytique Zap-OGlobin II</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Réactif facultatif pour la préparation d’échantillons de sang.</td></tr><tr><td>Kit d’extraction (kit d’isolement des acides nucléiques totaux MagMAX)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>D’autres kits d’extraction adaptés aux types d’échantillons souhaités peuvent être remplacés. Ce kit est livré avec du PBS, un tampon de lyse et un tampon de lavage.</td></tr><tr><td>2x Mélange RT-qPCR en une étape (qScript XLT RT-qPCR en une étape, ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Pool d’amorces spécifiques aux gènes</td><td>IDT</td><td>commande personnalisée</td><td>Peut être généré par l’utilisateur ou acheté avec les plaques d’amplification.</td></tr><tr><td>Mélange d’amorces aléatoires</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Plaque standard à 96 puits</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>Il peut s’agir de n’importe quelle plaque qui s’adapte à la machine PCR conventionnelle utilisée.</td></tr><tr><td>Master mix d’amplification (OpenArray master mix)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Joint adhésif transparent</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Foil seal</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 384 puits</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’amplification (QuantStudio 12K Flex OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Peut être personnalisé avec n’importe quel test conforme aux conditions standard de TaqMan.</td></tr><tr><td>Kit d’accessoires</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Contient les couvercles du boîtier, les bouchons et le liquide d’immersion.</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Machine d’amplification (système de PCR en temps réel QuantStudio 12K Flex)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid handler (système OpenArray AccuFill)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>Il est acheté avec la machine d’amplification.</td></tr><tr><td>Logiciel de conception d’amorces (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>Voir les instructions du fabricant pour les spécifications détaillées de l’amorce et de la sonde.</td></tr><tr><td>Programme d’analyse d’images (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Disponible à l’http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Tableur (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Disponible à l’https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Disrupteur tissulaire (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur conventionnel (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Tout thermocycleur conventionnel avec un couvercle chauffant peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Cône de plaque PCR</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>Cet appareil n’a qu’une seule vitesse (2 500 tr/min) ; le rotor démarre lorsque le couvercle est fermé et s’arrête lorsque le bouton est enfoncé.</td></tr><tr><td>Tampon TE</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane, 1 mM Acide éthylènediaminetétraacétique, pH 8,0</td></tr></tbody></table>

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires spécimens animaux par nanoscale pcr

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

PCR échelle nanolitres en temps réel utilise le multiplexage spatial pour permettre à plusieurs essais pour être exécutés en parallèle sur une seule plaque sans les inconvénients typiques de la combinaison de réactions ensemble. Nous avons conçu et évalué un groupe basé sur ce principe pour identifier rapidement la présence d&#39;agents pathogènes courants chez les chiens et les chevaux souffrant d&#39;une maladie respiratoire aiguë. Ce manuscrit décrit un flux de PCR de diagnostic à l&#39;échelle nanométrique pour la préparation des échantillons, l&#39;amplification et l&#39;analyse de séquences cibles d&#39;agents pathogènes, en se concentrant sur les procédures qui sont différentes des réactions à l&#39;échelle du microlitre. Dans le panneau respiratoire présenté, 18 essais ont été chacun mis en place en trois exemplaires, pouvant accueillir jusqu&#39;à 48 échantillons par plaque. Une extraction et de pré-amplification flux de travail universel a été optimisé pour haut débit préparation d&#39;échantillons pour accueillir plusieurs matrices et des agents pathogènes à base d&#39;ADN et d&#39;ARN. Des données représentatives sont présentées pour un ARN cible (grippe A de la matrice) et une cible d&#39;ADN (herpesvirus équin1). La possibilité de tester rapidement et avec précision pour un groupe complet, basé sur les syndromes d&#39;agents pathogènes est un outil précieux pour améliorer l&#39;efficacité et l&#39;ergonomie des tests de diagnostic et pour le diagnostic de la maladie respiratoire aiguë et la gestion.

Les résultats sont présentés sur les figures 1 et 2 pour un dosage représentatif de l&#39; ARN (matrice de la grippe) et le dosage de l&#39; ADN (EHV-1) avec une combinaison de témoins positifs et les échantillons cliniques soumis à des tests de diagnostic de routine. Les signaux de fluorescence émis à travers cette réaction typique sont représentés sur la figure 1, qui trace les valeurs de fluorescence brute par cycle. Tous seuil relatif de cycle (Ct) les valeurs ont été générées automatiquement par le logiciel de l&#39;appareil d&#39;amplification. la fluorescence d&#39;arrière-plan a été utilisé comme une mesure distincte pour l&#39;évaluation de la qualité du chargement au lieu de l&#39;incorporer dans les lectures de fluorescence avant de calculer les valeurs de Ct. La limite de détection analytique (LOD) pour chaque cible a été calculé sur la base de la moyenne globale des valeurs Ct au niveau de détection de 95% plus 2 écarts-types dans une mare de contrôles pourtoutes les cibles. La dilution la plus élevée, où au moins 95% des répliques étaient positifs pour les essais représentatifs était de 50 copies; la détection de 5 copies a réussi à 50% des réplicats. Ni essai a été détecté au-dessous d&#39;une copie. Les LOD pour le dosage de l&#39;ARN et l&#39;ADN ont été calculées à des valeurs Ct de 21,92 et 20,05. Ces valeurs ont été considérées comme étant les seuils pour les valeurs positives vs suspect (potentiellement non reproductible) de déclaration. D&#39; autres aspects de la performance analytique des cibles a été évaluée en utilisant des dilutions en série de contrôles positifs communs fonctionnent sur trois jours différents (figure 2). Les rendements moyens des ARN et d&#39;ADN des essais représentatifs étaient 101,1% et 106,6%; l&#39;efficacité moyenne globale pour toutes les cibles était de 101,3%. Les essais ont également eu une bonne linéarité (R 2&gt; 0,98). Répliquée variation à l&#39;intérieur des trous traversants est typiquement dans les écarts types de 0,2 pour les échantillons cliniques d&#39;commandes d. Pas de réactivité croisée entre l&#39;une des cibles a été observé. Les résultats finaux feuille de calcul dans le fichier supplémentaire montre des résultats quantitatifs représentatifs des 10 échantillons de diagnostic clinique et 4 contrôles. Les échantillons cliniques sont un sous-ensemble des types d&#39;échantillons testés périodiquement, y compris nasale / oropharyngés, le tissu pulmonaire, et des échantillons de selles. Un (équin) échantillon de selles dans cet ensemble montre un contrôle interne MS2 échoué, ce qui indique la présence d&#39;inhibiteurs dans l&#39;échantillon. Cela est généralement géré par dilution de l&#39;échantillon élue et / ou ré-extraction. Comme cela est le cas ici, le contrôle d&#39;amplification négatif doit être négatif pour toutes les cibles, et le contrôle de l&#39;extraction négative ne doit contenir que le contrôle interne. Dans l&#39;ensemble clinique, des échantillons produits valeurs Ct pour betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, canine distemper virus A, le virus parainfluenza canin, pneumovirus canine, et la grippeUNE. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Figure 1. Les graphes d&#39;amplification. Des lectures de fluorescence sont tracées en fonction des cycles d&#39;amplification pour le dosage de l&#39; ARN (A) et le dosage de l&#39; ADN (B). Triangles sont présentés indiquant les valeurs Ct. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Figure 2. Les courbes standard. Les courbes standard de l&#39;analyse de l&#39; ARN et l&#39; ADN testé sur trois jours différents sont tracés afin de démontrer la linéarité et la gamme d&#39;amplification à l&#39; aide de contrôles positifs. Seuil de cycle (Ct) les valeurs sont reportées en fonction log (10) du nombre de copies d&#39;ARN (A) ou de l&#39; ADN ( <strong&gt; B) standard. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Tableau 1. Schéma de la plaque et cible des emplacements d&#39;amplification. Les plaques utilisées pour les tests PCR à l&#39; échelle nanométrique en temps réel sur cette plate - forme sont lame de microscope taille et sont disposés en 48 sous - réseaux de 64 à trous, avec un total de 3072 à travers des trous pour des réactions individuelles. Un sous-réseau est montré ici, avec 18 cibles en triple exemplaire. Chaque échantillon est ajouté à une sous-matrice par le manipulateur de liquide. Les plaques sont recouvertes avec des composés hydrophiles et hydrophobes pour maintenir les réactifs dans les trous traversants par l&#39;intermédiaire de la tension superficielle. La puce en acier inoxydable est &quot;photolithographie modelée et humide gravé pour former un réseau rectiligne de 3072 micro-usiné, 320 um diamete. r trous de 33 nl de chaque &quot;2 Les abréviations pour les cibles sont les suivantes: BCOR, le coronavirus respiratoire canin (betacoronavirus) Bord, Bordetella bronchiseptica CAV, l&#39; adénovirus canin, le CPIV, le virus parainfluenza canin; CPNV, le pneumovirus canin; DISTA / B, canin distemper virus A et B; EADV1 / 2, l&#39;adénovirus équin 1/2; EAV, le virus de l&#39;artérite équine; EHV1 / 4, herpèsvirus équin de type 1/4; ERVA / B, équin virus de la rhinite A / B; IVM, la grippe A matrice; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, le contrôle interne (MS2 ARN phage); SEQU, Streptococcus equi. <img alt="Tableau 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Tableau 2. Transfert de plaque carte. Une plaque de carte de transfert de couleur pour l&#39; aide d&#39; une pipette à 8 canaux fixes pour transférer de la 96 puits préampli plaque à la plaque de 384 puits est représenté. En variante, une pipette réglable peut être utilisé. La même procédure est effectuée à chaque fois indépendamment de h<html> ow de nombreux échantillons sont dans la plaque. <img alt="fichier supplémentaire" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Fichier supplémentaire. Un fichier tableur macros contenant deux macros pour les résultats de la mise en forme dans un tableau récapitulatif (tel que décrit dans le protocole) est fourni. Une table typique de résultat généré par les macros est inclus dans le fichier (sous Final Results). Les deux macros rempliront les noms d&#39;échantillons dans la première colonne (jusqu&#39;à 48 échantillons) et la moyenne des trois valeurs Ct pour chaque cible pour ceux qui ont des résultats positifs; noter que les cibles qui n&#39;amplifient apparaissent vides dans ce tableau. Ceci peut être facilement imprimé sur une feuille de papier et utilisé comme référence pour la vérification des données brutes de manière efficace. Dans l&#39;onglet résultats finaux, des résultats représentatifs pour 10 échantillons cliniques et 4 contrôles sont présentés. Les abréviations pour les noms de dosage sont répertoriés dans la légende du tableau 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

test à haut débit d&#39;agents pathogènes à base d&#39;ADN et d&#39;ARN par PCR à l&#39;échelle nanométrique est décrit en utilisant un chien syndromique et le panneau PCR respiratoire équine.

À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

L'objectif général de cette méthodologie de test de PCR en temps réel est de détecter simultanément des agents pathogènes à ADN et à ARN de manière haut débit. L'acide nucléique provenant d'échantillons cliniques sera pré-amplifié à l'aide d'un pool d'amorces commun chargé sur une plaque OpenArray et analysé pour la présence d'agents pathogènes. Cette méthode peut contribuer à renforcer les efforts de surveillance OneHealth en matière de maladies infectieuses.Par rapport aux techniques traditionnelles, cette méthode permet de tester davantage d'échantillons pour un plus grand nombre de cibles sans qu'elles ne soient en compétition entre elles, améliorant ainsi l'efficacité du test. La méthode utilise une plaque PCR personnalisée à l'échelle nanométrique. Les amorces et les sondes sont imprimées sur les bords des trous traversants et les échantillons sont chargés à l'aide d'un distributeur automatique de liquides.Nous allons démontrer la méthode sur des échantillons cliniques testés pour un panel de pathogènes respiratoires chez les chevaux et les chiens. Pour commencer cette procédure, concevez la plaque comme décrit dans le protocole écrit. La plaque utilisée ici est configurée avec 18 cibles en triplets.Ajouter du milieu aux écouvillons et aux lavages trachéaux afin d'obtenir au moins un à deux millilitres de liquide. Vortexer vigoureusement l'écouvillon et le DMEM dans le tube. Ensuite, utiliser une pipette pour transférer environ 1 millilitre de milieu dans un nouveau tube.Ajoutez 235 micro litres de tampon de lyse et 175 micro litres d'échantillon dans chaque tube à billes. Poursuivez selon le protocole du fabricant pour extraire les acides nucléiques totaux. Préparez la transcription inverse et la pré-amplification de l'acide nucléique ou de la préamp comme décrit dans le protocole textuel en vérifiant d'abord la carte des échantillons.Ajouter 8,5 µL de mélange maître de préamplification et 5,5 µL d'échantillon d'ADN/ARN dans chaque puits d'une plaque standard de 96 puits en utilisant uniquement le côté gauche de la plaque. Après avoir combiné les échantillons, les contrôles positifs et les contrôles négatifs avec le mélange de préamplification, sceller soigneusement la plaque standard de 96 puits avec un film adhésif transparent. Retirer tout excès de film à l’aide d’un scalpel afin d’éviter la formation de bords détachés pendant les cycles d’amplification.Centrifuger la plaque scellée pendant 20 secondes à l’aide d’un centrifugeuse pour plaque PCR. Vérifier que tous les réactifs sont bien rassemblés au fond des puits de la plaque. Après avoir allumé un thermocycleur classique, sélectionner le programme de préamplification et démarrer le programme.Placer la plaque 96 puits dans le thermocycleur uniquement lorsque la partie inférieure du thermocycleur atteint la température requise pour la production d'ADNc, en surveillant la lecture de température sur l'écran. Une fois le cycle de préamplification terminé, vérifier que la plaque est restée scellée. Après avoir mis des doubles gants et des protections de manches, retirer le scellé de la plaque de préamplification.Ensuite, retirez soigneusement et jetez les gants extérieurs. Diluez les produits de préamplification d’un facteur de un à cinq en ajoutant 56 microlitres de tampon TE dans chaque puits des colonnes une à six de la plaque de préamplification à 96 puits, puis mélangez en pipettant plusieurs fois de haut en bas. Pour ce faire, n’appuyez que jusqu’au premier cran du pipetteur, aspirez depuis le fond et délivrez plus haut, sans créer de bulles.Ajouter du tampon TE dans les six colonnes, indépendamment des puits inutilisés. Préparer le transfert en plaque 384 puits vers la plaque d'amplification, comme décrit dans le protocole écrit. Une fois les étapes de préparation terminées, porter une nouvelle paire de gants doubles bien ajustés ainsi que des protèges-manches.En raison de taux d'évaporation élevés lors de la pipette de faibles volumes, il est essentiel de distribuer efficacement le mélange maître et l'échantillon, puis de sceller immédiatement la plaque. Ajoutez 2,5 µL de mélange maître d'amplification dans une plaque de 384 puits. Les plaques blanches sont utilisées ici à des fins de démonstration, mais les plaques noires doivent être utilisées pour réduire la fatigue oculaire.Transférez 2,5 µL du produit de préamplification dilué dans la plaque 384 puits selon le schéma décrit dans le protocole écrit. Les dés colorés illustrés ici montrent la séquence de transfert pour une pipette à canal fixe. Recouvrez immédiatement la plaque hermétiquement avec un film en aluminium.Jetez les gants extérieurs et les protections de manchette. Faites centrifuger la plaque 384 puits pendant 20 secondes dans le centrifugeur pour plaque PCR. Ne retirez pas le scellé en aluminium, mais placez la plaque 384 puits dans le distributeur automatique de liquides.Ouvrez l'emballage contenant la plaque d'amplification enfermée et placez-la soigneusement dans le manipulateur liquide, dans le premier emplacement, le numéro de série se trouvant à droite. Tenez le boîtier par les bords sans toucher la surface de la plaque. Retirez le scellé en aluminium de la plaque 384 puits située à l'intérieur du manipulateur liquide une fois que tout est en place. Cliquez sur « suivant », puis cochez toutes les cases au fur et à mesure que chaque étape est terminée.Fermer la porte du distributeur automatique et commencer immédiatement le processus de remplissage. Rester à proximité du distributeur automatique et passer immédiatement à l'étape suivante dès que la plaque est remplie. Pendant que le distributeur automatique fonctionne, retirer le film protecteur du fond d'un couvercle de boîte.Laisser le film supérieur en place. Amorcer le ruban rouge en tirant légèrement pour le détacher de l'adhésif. Retirer la plaque d'amplification chargée du distributeur automatique et la placer délicatement dans la presse à plaque, le numéro de série se trouvant à droite.Placer le couvercle sur le dessus de la plaque avec l'extrémité encochée à droite et l'adhésif vers le bas. Abaisser soigneusement le levier de la presse à plaque en la fermant, la lumière clignotera pendant 20 secondes. Ne pas toucher la presse à plaque pendant cette période.Une fois que le témoin lumineux devient vert fixe, soulevez le levier et retirez soigneusement la plaque scellée en la tenant par les bords. En tenant verticalement la plaque d'amplification scellée par les bords du boîtier, insérez immédiatement l'embout de la seringue dans le port de chargement situé à l'extrémité du boîtier, puis délivrez lentement le liquide d'immersion en un mouvement continu et doux afin de remplir l'espace entre la plaque et le couvercle. Laissez une petite bulle d'air dans un coin une fois la plaque immergée.Tout en continuant de tenir la plaque verticalement par les bords, scellez le port de chargement en insérant le bouchon dans le port et en tournant le bouchon dans le sens horaire ; appliquez une pression suffisante jusqu'à ce que la poignée se casse. Nettoyez le boîtier avec un chiffon sans peluches préalablement bien pulvérisé avec de l'éthanol. Pour sécher le boîtier, essuyez-le vers le bas avec un chiffon propre.Apportez la plaque scellée à la machine d'amplification. Sous l'onglet de l'instrument, sélectionnez la console de l'instrument. Sélectionnez la machine d'amplification, puis cliquez sur le bouton d'ouverture de la porte.Placer la plaque d'amplification dans le premier emplacement de l'adaptateur de plaque, en vérifiant que l'adaptateur est correctement aligné avec un numéro un dans le coin supérieur gauche. Orienter la plaque de manière à ce que le code-barres soit face vers le haut et tourné vers l'avant de l'appareil. Après avoir cliqué sur le bouton fermer la porte, accéder à l'onglet d'accueil situé en bas de l'écran.Sous le menu d'exécution, sélectionnez OpenArray. Cliquez sur obtenir les identifiants de plaque. Pour commencer l'exécution, cliquez sur démarrer l'exécution.Ouvrez une feuille de calcul contenant le macro-résultat. Dans le fichier de données exporté, cliquez avec le bouton droit sur l'onglet en bas de l'écran et sélectionnez « Déplacer ou copier ». Dans le champ « Vers le classeur », sélectionnez le macro-résultat.Ensuite, cliquez sur « déplacer à la fin » et cochez la case intitulée « créer une copie ». Enfin, cliquez sur « OK ». Supprimez l'ancglet d'exportation, puis renommez le nouvel onglet ajouté « exportation ».Cliquez sur Affichage, puis sur Macros, sélectionnez la macro, puis cliquez sur Exécuter. Ensuite, répétez cette procédure pour Macro2 en cliquant sur Affichage, puis sur Macros, en sélectionnant Macro2 et en cliquant sur Exécuter. Dans le logiciel de l'appareil d'amplification, vérifiez les courbes de chaque échantillon et témoin par rapport au tableau des macros en sélectionnant Analyse/courbe d'amplification sur le côté gauche de l'écran.Ensuite, sélectionnez l'onglet échantillon et cliquez sur chaque échantillon pour confirmer qu'il existe deux ou trois courbes d'amplification positives pour chacun des résultats positifs indiqués dans le tableau. Les mesures de fluorescence sont tracées en fonction des cycles d'amplification afin d'illustrer que la PCR en temps réel a été correctement réalisée. La plupart des échantillons ont atteint des niveaux seuils relatifs entre les cycles deux et 25 de la réaction de PCR en temps réel.Des courbes standards réalisées sur trois jours différents sont tracées afin de démontrer la linéarité et la plage d'amplification à l'aide de contrôles positifs. Les valeurs de seuil de cycle sont tracées en fonction du logarithme en base 10 du nombre de copies de l'étalon d'acide nucléique. Les deux macros complèteront les noms des échantillons dans la première colonne ainsi que la moyenne des trois valeurs de Ct pour chaque cible présentant des résultats positifs.Les cibles qui n'ont pas amplifié apparaissent vides dans ce tableau. Les résultats quantitatifs pour 10 échantillons cliniques et quatre contrôles de routine sont indiqués ; comme c'est le cas ici, le témoin négatif d'amplification doit être négatif pour toutes les cibles, et le témoin négatif d'extraction ne doit contenir que le contrôle interne. Un échantillon de cet ensemble présente un échec du contrôle interne, ce qui indique la présence d'inhibiteurs dans l'échantillon.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une expérience de PCR à l'échelle nanométrique. Cette procédure facilitera l'analyse de panels basés sur des syndromes en diagnostic vétérinaire. Cette méthode peut être adaptée afin d'inclure des tests pour les agents responsables de nombreuses maladies infectieuses différentes.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d'essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

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