Information sur la structure à partir d'une seule molécule FRET expériences utilisant la Nano-positionnement Système rapide

L’objectif global du système de nano-positionnement rapide est de fournir des informations structurelles en temps réel sur les biomolécules en combinant des expériences FRET à molécule unique avec une analyse statistique rigoureuse. Cette méthode répond à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale telles que la localisation de domaines flexibles dans les macromolécules où les outils standard de biologie structurelle ne peuvent pas être appliqués. L’amélioration majeure du NPS rapide par rapport à d’autres outils structurels basés sur FRET est que différents modèles de colorants peuvent être comparés en utilisant non seulement les positions les plus probables, mais aussi une distribution de probabilité tridimensionnelle.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine les données structurales de la base de données de protéines avec des mesures quantitatives de fluorescence d’une molécule unique. Pour commencer la procédure, assemblez une chambre d’écoulement et un porte-échantillon. Pour préparer les vis d’entrée et de sortie, enfilez le tube en silicone dans des vis à languette creuse et coupez le tube droit à chaque extrémité avec une lame de rasoir.

Vissez les vis de la languette sur le porte-échantillon. Alignez les trous de glissière en quartz de la chambre d’écoulement avec les filetages du porte-échantillon. Serrez doucement les vis du porte-verre pour fixer la chambre d’écoulement en place.

Vissez des morceaux de tube en silicone de 20 centimètres de long dans les vis d’entrée et de sortie. Lavez la chambre d’écoulement avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, rincez la chambre d’écoulement avec 100 microlitres de solution de neutravidine dans du PBS, en veillant à ce qu’une gouttelette se forme à l’extrémité du tube d’entrée pour empêcher l’air de pénétrer dans la chambre d’échantillonnage.

Serrez les tubes d’entrée et de sortie après chaque manipulation pour exclure l’air de la chambre d’écoulement. Incuber la chambre pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez la solution de neutravidine avec 500 microlitres de PBS.

Ajoutez une goutte d’huile d’immersion sur le prisme et vissez le prisme sur la chambre d’échantillonnage. Les données FRET à molécule unique sont acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence à réflexion interne totale. Démarrez le logiciel de la caméra et le logiciel du moteur piézoélectrique de la platine.

Montez la chambre sur la platine micrométrique du microscope TIRF horizontalement, aussi droite que possible, et de manière à ce qu’elle croise les trois lasers. Ajoutez du liquide d’immersion et faites la mise au point de l’objectif du microscope en vérifiant les réflexions IR. Définissez les paramètres de l’appareil photo, le chemin d’accès au fichier et les paramètres d’auto-incrémentation.

Démarrez le flux de la caméra en direct et blanchissez la fluorescence de fond en utilisant les trois lasers à pleine intensité. Ensuite, baissez l’intensité du laser. Ensuite, chargez 100 microlitres d’une solution de billes fluorescentes dans la chambre.

Attendez 10 minutes que les perles se lient à la surface de la chambre. Enregistrez une vidéo avec un champ de vision de 50 à 100 perles et effectuez une analyse par lots avec un seuil de recherche de pic élevé. Chargez le fichier vidéo et choisissez deux perles avec des centres distincts aux coins opposés du champ de vision.

Sélectionnez les pixels d’intensité maximale dans ces billes. Retirez et nettoyez le prisme. Préparez une deuxième chambre d’échantillonnage et vissez le support de prisme sur la chambre.

Montez la chambre sur la platine micrométrique. Ensuite, chargez 100 microlitres d’une solution picomolaire de 50 à 100 échantillons biotinylés marqués par fluorescence dans la chambre. Attendez que les molécules se lient à la surface de la chambre.

Cliquez simultanément sur Prendre le signal pour démarrer l’enregistrement et allumer le laser d’excitation du donneur. Ajustez la puissance du laser pour vous assurer qu’au moins 80 % des molécules dans le champ de vision sont blanchies, Ensuite, déplacez la chambre pour montrer une zone non blanchie et enregistrez le film suivant. Blanchissez le reste de la chambre d’échantillonnage de cette manière.

Après les mesures au microscope TIRF, les données FRET monomoléculaires acquises doivent être analysées pour obtenir l’efficacité FRET moyenne. Effectuez une analyse par lots des films donneur et accepteur de l’échantillon. Ensuite, chargez les fichiers vidéo par lots dans le logiciel d’analyse de données.

Cliquez sur le bouton NON sélectionné pour indiquer les phases individuelles du FRET. Cliquez sur le début de la période FRET, puis sur le moment où l’intensité de l’accepteur diminue en raison du blanchiment, et enfin sur le moment où l’intensité du donneur diminue en raison du blanchiment. Dans la fenêtre suivante, sélectionnez Oui pour conserver la trace d’efficacité FRET sélectionnée.

Une fois que chaque molécule a été analysée, enregistrez les traces et analysez le film suivant. Une fois l’analyse terminée, exécutez un script pour combiner les résultats FRET. Importez le fichier FRET combiné par image dans le logiciel d’analyse de données à l’aide de l’option de saisie par défaut.

Tracez les données sous forme d’histogramme et utilisez l’outil d’ajustement de courbe non linéaire pour les ajuster à une gaussienne. La valeur de dépassement est l’efficacité principale du FRET. Utilisez la spectroscopie UV VIS et la spectroscopie fluorescente pour déterminer le rayon isotrope de Forster et les valeurs d’anisotropie à l’état d’équilibre pour chaque colorant.

Le système de nano-positionnement s’est inspiré du célèbre GPS, car on localise une position inconnue, l’antenne, avec plusieurs positions connues, les satellites. Pour commencer l’analyse NPS, lancez le logiciel FastNPS et créez un nouveau fichier de tâche. Pour définir les a priori de position des antennes et des satellites étiquetés, dans la fenêtre ModelDyePrior, entrez la résolution spatiale de la position en cours de définition.

Excluez l’intérieur de la macromolécule en chargeant le fichier PDB centré correspondant. Entrez le diamètre du colorant et la distance de squelettage. Remplissez les coordonnées de position minimale et maximale de l’emplacement possible du colorant.

Si la position définie est un satellite, sélectionnez l’attachement de colorant via l’éditeur de liens flexible et entrez les coordonnées de l’atome à partir du fichier PDB centré. Indiquez la longueur et le diamètre de l’éditeur de liens. Cliquez sur calculer le volume accessible, enregistrez la position précédente et exportez-la pour la visualisation.

Répétez ce processus pour tous les satellites et antennes. Une fois les positions définies, ouvrez la fenêtre Définir la mesure et créez une nouvelle molécule de colorant. Chargez la position préalable associée à ce colorant.

Remplissez l’anisotropie de fluorescence, sélectionnez un modèle de colorant approprié et activez le colorant. Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les colorants aient été définis. Ensuite, créez une nouvelle mesure.

Sélectionnez une paire de FRET parmi les colorants définis. Entrez l’efficacité FRET d’une seule molécule avec erreur et le rayon de Forster isotrope de cette paire de colorants, puis activez la mesure. Répétez cette opération pour toutes les paires de colorants.

Ensuite, ouvrez la fenêtre de calcul. Si des colorants ont été attribués à différents modèles, sélectionnez Défini par l’utilisateur. Sinon, sélectionnez le modèle à utiliser pour tous les colorants.

Effectuez le calcul et ouvrez la fenêtre des résultats. Lors de l’utilisation de FastNPS, il est important de penser à adapter les modèles pour tous les colorants afin de minimiser les volumes crédibles, tout en restant bien sûr cohérent. Si la cohérence est inférieure à 90 %, cliquez sur Cohérence détaillée et identifiez les colorants communs aux entrées dont la cohérence est inférieure à 90 %.

Ouvrez la fenêtre Définir la mesure et modifiez le modèle du colorant en question. Réexécutez le calcul dans le mode Défini par l’utilisateur. Exporter les volumes crédibles des colorants à l’unité ou en lot.

Ouvrez les fichiers de densité dans le logiciel de visualisation et ajustez la crédibilité au niveau souhaité. L’efficacité du FRET d’une seule molécule a été mesurée entre des molécules d’antenne inconnues et plusieurs molécules satellites connues au sein d’un complexe ouvert de promoteurs d’ARN polymérase archéen. L’analyse NPS de ces données a déterminé les volumes crédibles de ces molécules de colorant par rapport au complexe promoteur, ouvert de l’ARN polymérase de l’archée.

Cinq modèles différents où les molécules de colorant ont été utilisées, et les résultats ont été comparés. Les volumes crédibles étaient cohérents avec les données mesurées lorsqu’ils étaient calculés avec des modèles qui supposaient que le colorant ne peut tourner librement qu’à l’intérieur d’un cône d’orientation inconnue. Le modèle classique en particulier est le plus conservateur, car il suppose en outre que le colorant se trouve à un endroit fixe.

Cela crée un volume crédible relativement important, mais le volume entoure généralement la position correcte. Les modèles de plus haute précision utilisent l’hypothèse que le colorant est complètement libre de tourner pendant sa durée de vie de fluorescence. Le modèle iso, comme le modèle classique, suppose que le colorant est à une position fixe dans le volume accessible.

Le modèle meanpos-iso suppose une moyenne dynamique sur toutes les positions possibles. Bien que les volumes crédibles des modèles iso soient beaucoup plus petits que ceux calculés par les modèles non iso, ils ne correspondent pas aux données mesurées. Nous voulions développer une technique qui nous permette de capturer des informations structurelles dynamiques de complexes transitoires, un problème qui ne pouvait pas être résolu par les outils structurels existants.

Une fois que les données FRET monomoléculaires ont été enregistrées, l’analyse FastNPS est effectuée en quelques heures, ce qui permet une comparaison rapide de différents modèles de colorants. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les simulations MD peuvent être effectuées par la suite afin d’obtenir des modèles structurés cohérents avec les données expérimentales FRET monomoléculaires.