Synthèse de cationisé Magnetoferritin pour magnétisation ultra-rapide des cellules

L’objectif global de cette méthode est de synthétiser une nanoparticule magnétique à l’intérieur d’une cage protéique, puis de fonctionnaliser la protéine de sorte qu’elle permette une fixation rapide de la nanoparticule magnétique aux cellules. Cette méthode peut être utilisée pour générer des nanoparticules magnétiques qui permettent un marquage magnétique rapide et efficace des cellules, ce qui est important pour des applications telles que l’IRM ou la séparation magnétique des cellules. Le principal avantage de cette technique est que l’aimantation cellulaire peut être obtenue en utilisant de faibles concentrations de nanoparticules et des temps d’incubation courts, ce qui évite les effets indésirables potentiels dus à l’exposition aux nanoparticules.

Pour commencer, désoxygénez 500 millilitres d’eau déminéralisée en plaçant un tube relié à une bouteille d’azote gazeux dans l’eau et en scellant le récipient avec un film alimentaire. Ensuite, faites pénétrer l’azote gazeux pendant environ 60 minutes. Chauffer un bain-marie relié à la cuve de réaction à double enveloppe à 65 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 75 millilitres de tampon HEPES de 50 millimolaires, pH 8,6 dans le récipient de réaction. Fermez le récipient et désoxygénez en faisant bouillonner de l’azote gazeux à travers la solution tampon pendant environ 20 minutes. Dans le même temps, agitez la solution tampon à l’aide d’un agitateur magnétique.

Après avoir désoxygéné la solution tampon HEPES, retirez le tube d’azote du tampon, en le maintenant en suspension au-dessus de la solution pour maintenir une atmosphère d’azote. Ajoutez de l’apoferritine pour obtenir une concentration finale de 3 milligrammes par millilitre. Continuez l’agitation magnétique, mais réduisez la vitesse d’agitation en cas de mousse.

Pour la synthèse de la magnétoferritine, utilisez deux pousse-seringues pour injecter simultanément 10,1 millilitres du précurseur fer-cobalt et 10,1 millilitres de peroxyde d’hydrogène dans la solution d’apoferritine à un débit de 0,15 millilitre par minute. Poursuivez les étapes de synthèse comme décrit dans le protocole de texte. Ensuite, chargez l’échantillon sur une colonne contenant une matrice cationique à l’aide d’une pompe péristaltique à un débit de 10 millilitres par minute.

Lavez la colonne avec environ 100 millilitres de tampon de coulée à l’aide d’une pompe à gradient à un débit de 10 millilitres par minute. Pour éluer la protéine, laver la colonne avec 150 millilitres de concentrations croissantes de chlorure de sodium et un tampon tris à 10 millilitres par minute. Au fur et à mesure que la protéine élue à une concentration de chlorure de sodium de 500 millimolaires, collectez-la en fractions de 50 millilitres à l’aide d’un collecteur de fractions automatisé.

Concentrez les 150 millilitres de magnétoferritine à un volume d’environ deux millilitres à l’aide d’une unité de filtration centrifuge de 15 millilitres suivie d’une unité de volume de quatre millilitres. Reportez-vous aux instructions du fabricant des unités de filtration centrifuge pour un protocole détaillé de cette procédure. Ensuite, chargez l’échantillon concentré sur une colonne de filtration sur gel à l’aide d’une boucle d’injection.

Lavez la colonne avec un tampon de coulage à un débit de 1,3 millilitre par minute. Collectez des fractions de six millilitres à l’aide d’un collecteur de fractions automatisé. Les monomères protéiques éluent en dernier.

À ce stade, la magnétoferritine purifiée peut être stockée à quatre degrés Celsius jusqu’à la cationisation. Pour 10 milligrammes de magnétoferritine, pesez 374 milligrammes de DMPA et dissolvez-le dans 2,5 millilitres de tampon MES de 200 millimolaires. Ajustez le pH de la solution à environ sept en utilisant de l’acide chlorhydrique concentré.

Des fumées toxiques sont libérées lorsque vous ajustez le pH de la solution de DMPA avec de l’acide chlorhydrique. Assurez-vous de manipuler ces matériaux dans une hotte. Ajoutez 2,5 millilitres de solution de magnétoferritine à raison de quatre milligrammes par millilitre.

Ajoutez un agitateur magnétique et remuez pendant deux heures pour équilibrer. Après avoir ajusté la solution à un pH de 5,0, ajoutez 141 milligrammes de poudre EDC à la solution de magnétoferritine DMPA. Continuez à remuer pendant trois heures et demie.

Filtrez la solution à travers un filtre à seringue de 0,22 micron pour éliminer tous les précipités et dialyser la protéine comme décrit dans le protocole textuel. Les hMSC de culture telles que décrites dans le protocole textuel. Lavez les cellules plaquées avec deux millilitres de PBS à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un millilitre de la solution de magnétoferritine cationisée stérilisée aux cellules en plaques avant d’incuber pendant la période de temps souhaitée. Lavez les cellules avec du PBS, puis récoltez-les en ajoutant 0,5 millilitre de trypsine-EDTA et en les incubant à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir ajouté un millilitre de milieu de culture pour inactiver la trypsine EDTA, transférez la solution dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 524 fois G. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique.

Ensuite, fixez l’aimant au multi-support et ajoutez une colonne de séparation magnétique à l’aimant. Placez un filtre de pré-séparation sur la colonne. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique au filtre de pré-séparation et laissez-le passer à travers le filtre et la colonne pour les laver.

Ensuite, placez un tube de centrifugation de 15 millilitres sous la colonne et ajoutez 0,5 millilitre de suspension de cellule dans le réservoir de filtre de la colonne de séparation magnétique. Lorsque le réservoir est vide, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique. Lorsque le réservoir se vide à nouveau, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique.

Répétez le lavage une fois de plus, pour un volume total de tampon de séparation magnétique de 1,5 millilitres. Cette étape de lavage élimine toutes les cellules non magnétisées de la colonne. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube à centrifuger neuf de 15 millilitres.

Ensuite, retirez le filtre du réservoir de la colonne. Ajoutez 1 millilitre de tampon de séparation magnétique dans le réservoir et poussez immédiatement à travers la colonne à l’aide du piston fourni par le fabricant. Celui-ci élue les cellules magnétisées de la colonne dans le tube de centrifugation.

Procédez à la quantification du fer comme décrit dans le protocole de texte. Des images de microscopie électronique à transmission d’échantillons de magnétoferritine colorés négativement ont montré que des nanoparticules se sont formées à l’intérieur de la cage protéique. Les mesures du potentiel zêta confirment que la magnétoferritine a obtenu une charge de surface positive après cationisation.

L’exposition de cellules souches mésenchymateuses humaines à la magnétoferritine cationisée pendant une minute a entraîné l’aimantation de 92 % de la population cellulaire et l’administration de 3,6 picogrammes de fer par cellule. L’augmentation du temps d’incubation à 15 minutes a entraîné l’aimantation de l’ensemble de la population cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment synthétiser une nanoparticule magnétique dans la cavité de l’apoferritine en ajoutant séquentiellement des précurseurs de sels métalliques à la solution protéique.

Et ensuite, comment cationiser chimiquement la protéine en utilisant le couplage TMPA. Une fois maîtrisée, la synthèse, la purification et la cationisation de la magnétoferritine peuvent se faire en trois jours si elles sont réalisées correctement. Lors de cette procédure, il est important d’éviter la contamination par l’oxygène et de maintenir la température et le pH corrects tout au long de la synthèse de la magnétoferritine.

À la suite de cette procédure, d’autres cargaisons comme des points quantiques ou des agents thérapeutiques peuvent être encapsulées dans la cage d’apoferritine cationisée pour obtenir une livraison plus efficace de ces matériaux aux cellules. Cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la manipulation des cellules magnétiques pour explorer le marquage magnétique dans les cellules qui présentent une faible absorption des nanoparticules ou qui sont très sensibles à une exposition prolongée aux nanoparticules ou à des concentrations élevées de nanoparticules.