Synthèse de cationisé Magnetoferritin pour magnétisation ultra-rapide des cellules

L'objectif général de cette méthode est de synthétiser une nanoparticule magnétique à l'intérieur d'une cage protéique, puis de fonctionnaliser la protéine de manière à permettre une fixation rapide de la nanoparticule magnétique aux cellules. Cette méthode peut être utilisée pour produire des nanoparticules magnétiques permettant un marquage magnétique rapide et efficace des cellules, ce qui est important pour des applications telles que l'IRM ou la séparation magnétique des cellules. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que la magnétisation des cellules peut être obtenue à l'aide de faibles concentrations de nanoparticules et de temps d'incubation courts, ce qui prévient d'éventuels effets indésirables liés à l'exposition aux nanoparticules.

Pour commencer, désoxygénez 500 millilitres d’eau déionisée en plaçant un tube relié à une bouteille de gaz azote dans l’eau et en scellant le récipient avec du film plastique. Ensuite, faites barboter du gaz azote pendant environ 60 minutes. Chauffez un bain-marie relié au récipient réactionnel double enceinte à 65 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez 75 millilitres de tampon HEPES 50 millimolaire, pH 8,6 dans le récipient de réaction. Fermez hermétiquement le récipient et procédez à la désoxygénation en faisant barboter du gaz azote dans la solution tampon pendant environ 20 minutes. Pendant ce temps, agitez la solution tampon à l’aide d’un agitateur magnétique.

Après avoir désoxygéné la solution tampon HEPES, retirez le tube d'azote du tampon en le maintenant suspendu au-dessus de la solution afin de préserver une atmosphère d'azote. Ajoutez de l'apoferritine pour obtenir une concentration finale de 3 milligrammes par millilitre. Poursuivez l'agitation magnétique, mais réduisez la vitesse d'agitation si des bulles apparaissent.

Pour la synthèse de la magnétoferritine, utilisez deux pompes à seringue pour injecter simultanément 10,1 millilitres du précurseur fer-cobalt et 10,1 millilitres du peroxyde d'hydrogène dans la solution d'apoferritine à un débit de 0,15 millilitre par minute. Poursuivez la synthèse selon les étapes décrites dans le protocole textuel. Ensuite, chargez l'échantillon sur une colonne contenant une matrice cationique à l'aide d'une pompe péristaltique à un débit de 10 millilitres par minute.

Lavez la colonne avec environ 100 millilitres de tampon de migration à l’aide d’une pompe en gradient à un débit de 10 millilitres par minute. Pour éluire la protéine, lavez la colonne avec 150 millilitres de concentrations croissantes de chlorure de sodium et de tampon tris à 10 millilitres par minute. Étant donné que la protéine s’élue à une concentration de chlorure de sodium de 500 millimolaire, récoltez-la en fractions de 50 millilitres à l’aide d’un collecteur fractionneur automatisé.

Concentrer les 150 millilitres de magnétoferritine à un volume d’environ deux millilitres à l’aide d’un filtre centrifuge de 15 millilitres, suivi d’un filtre de volume de quatre millilitres. Se référer aux instructions du fabricant des unités de filtration centrifuge pour un protocole détaillé de cette procédure. Ensuite, charger l’échantillon concentré sur une colonne de filtration sur gel à l’aide d’une boucle d’injection.

Lavez la colonne avec le tampon de migration à un débit de 1,3 millilitre par minute. Récupérez des fractions de six millilitres à l’aide d’un collecteur de fractions automatisé. Les monomères protéiques éluent en dernier.

À ce stade, la magnétoferritine purifiée peut être conservée à quatre degrés Celsius jusqu'à la cationisation. Pour 10 milligrammes de magnétoferritine, peser 374 milligrammes de DMPA et dissoudre dans 2,5 millilitres de tampon MES à 200 millimolaire. Ajuster le pH de la solution à environ sept à l'aide d'acide chlorhydrique concentré.

Des fumées toxiques sont dégagées lors de l'ajustement du pH de la solution de DMPA avec de l'acide chlorhydrique. Manipulez ces produits dans une hotte de ventilation. Ajoutez 2,5 millilitres de solution de magnétoferritine à 4 milligrammes par millilitre.

Ajouter un agitateur magnétique et agiter pendant deux heures pour équilibrer. Après avoir ajusté la solution à un pH de 5,0, ajouter 141 milligrammes de poudre d'EDC à la solution de magnétoferritine DMPA. Poursuivre l'agitation pendant trois heures et demie.

Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron pour éliminer tout précipité, puis dialyser la protéine comme décrit dans le protocole écrit. Cultiver les CSMh comme décrit dans le protocole écrit. Laver les cellules en plaques avec deux millilitres de PBS à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un millilitre de la solution stérilisée de magnétoferritine cationisée aux cellules en culture, puis incubez pendant la durée souhaitée. Lavez les cellules avec du PBS, puis récoltez-les en ajoutant 0,5 millilitre de trypsine-EDTA et en incubant à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir ajouté un millilitre de milieu de culture pour inactiver la trypsine-EDTA, transférez la solution dans un tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 524 fois G. Jetez le surnageant et remettez en suspension le culot cellulaire dans 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique.

Ensuite, fixez l'aimant sur le support multiprises et ajoutez une colonne de séparation magnétique sur l'aimant. Placez un filtre de pré-séparation sur la colonne. Ajoutez alors 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique sur le filtre de pré-séparation et laissez-le traverser le filtre et la colonne afin de les laver.

Ensuite, placez un tube de centrifugation de 15 millilitres sous la colonne et ajoutez 0,5 millilitre de la suspension cellulaire dans le réservoir du filtre de la colonne de séparation magnétique. Lorsque le réservoir est vide, ajoutez 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique. Lorsque le réservoir se vide à nouveau, ajoutez encore 0,5 millilitre de tampon de séparation magnétique.

Répétez le lavage une fois supplémentaire, pour un volume total de tampon de séparation magnétique de 1,5 millilitre. Cette étape de lavage élimine toutes les cellules non magnétisées de la colonne. Retirez la colonne de l'aimant et placez-la dans un nouveau tube de centrifugeuse de 15 millilitres.

Ensuite, retirez le filtre du réservoir de la colonne. Ajoutez 1 millilitre du tampon de séparation magnétique dans le réservoir, puis poussez immédiatement le liquide à travers la colonne à l’aide du piston fourni par le fabricant. Cette étape éluera les cellules magnétisées de la colonne dans le tube de centrifugation.

Procédez à la quantification du fer comme décrit dans le protocole textuel. Des images de microscopie électronique en transmission d'échantillons de magnétoferritine colorés négativement ont montré que des nanoparticules s'étaient formées à l'intérieur de la cage protéique. Les mesures de potentiel zêta confirment que la magnétoferritine a acquis une charge de surface positive après cationisation.

L'exposition de cellules souches mésenchymateuses humaines à de la magnétoferritine cationisée pendant une minute a entraîné la magnétisation de 92 % de la population cellulaire et l'incorporation de 3,6 picogrammes de fer par cellule. L'augmentation du temps d'incubation à 15 minutes a permis la magnétisation de l'ensemble de la population cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprendre comment synthétiser une nanoparticule magnétique à l'intérieur de la cavité de l'apoferritine en ajoutant séquentiellement des précurseurs salins métalliques à la solution protéique.

Ensuite, comment cationiser chimiquement la protéine en utilisant le couplage avec le TMPA. Une fois maîtrisées, la synthèse, la purification et la cationisation de la magnétoferritine peuvent être réalisées en trois jours si elles sont effectuées correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'éviter toute contamination par l'oxygène et de maintenir la température et le pH corrects tout au long de la synthèse de la magnétoferritine.

À la suite de cette procédure, d'autres charges, comme les points quantiques ou les agents thérapeutiques, peuvent être encapsulés dans la cage d'apoferritine cationisée afin d'assurer une délivrance plus efficace de ces matériaux aux cellules. Cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la manipulation magnétique des cellules pour explorer le marquage magnétique dans des cellules présentant une faible incorporation de nanoparticules ou étant très sensibles à une exposition prolongée aux nanoparticules ou à des concentrations élevées de nanoparticules.