Name: Fabricating UV-Vis et Raman Spectroscopy Platform Immunoassay (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Découvrez la fabrication d'une plateforme immunoessai basée sur des nanoparticules d'or utilisant la spectroscopie UV-Visible et Raman. Cette méthode double permet une validation robuste et une détection sensible des biomarqueurs.

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Ce travail a été soutenu par un Research Catalyst Award de l’Université d’État de l’Utah. Les auteurs tiennent à remercier Annelise Dykes, Cameron Zabriskie et Donald Wooley pour leurs contributions.

1. Préparation des buffers <ol><li> Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) <ol><li> Diluer 50 ml de 10x PBS avec 450 ml d&#39;eau de qualité HPLC pour obtenir une concentration 1x PBS. filtrer de manière stérile la solution avec un filtre de 0,22 um. </li><li> Conserver la solution à la température ambiante. </li></ol></li><li> Préparation de Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST) <ol><li> Diluer 50 ml de solution saline tamponnée 10x Tris (TBS) avec 450 ml d&#39;eau de qualité HPLC pour obtenir une concentration de 1x. Ajouter 250 pi de Tween-20 pour 0,05% (v / v) de Tween-20. filtrer de manière stérile la solution avec un filtre de 0,22 um. </li><li> Ranger à température ambiante. </li></ol></li><li> Préparation de la sérum - albumine humaine (HSA) une solution de blocage <ol><li> Peser 0,45 g de SAH dans 15 ml de PBS stérile filtré 1x pour faire un 3% p / v de solution de HSA. Vortex solution jusqu&#39;à HSA est complètement dissous. </li><li> Magasin solution HSA à 4 ° C. REMARQUE: sérum-albumine bovine(BSA) peut également être utilisée comme solution de blocage. </li></ol></li><li> Préparation d&#39;anticorps pégylé (PEG-Ab) solution NOTE: La solution d&#39;anticorps doit être exempt de porteurs ou de stabilisation des protéines telles que BSA, qui pourraient interférer avec les réactions de conjugaison par compétition pour le n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) sites de liaison. Si l&#39;anticorps est dans une solution tampon Tris ou la glycine, il doit subir un échange de tampon pour empêcher des amines ou des sels d&#39;ammonium d&#39;interférer avec la réaction de conjugaison du NHS. Si l&#39;anticorps est sous une forme lyophilisée, il peut être remis en suspension selon les recommandations du fabricant à une concentration de 1-10 mg / ml. <ol><li> Pour les anticorps dans un tampon Tris ou la glycine, effectuer un échange de tampon au bicarbonate de sodium 100 mM en utilisant une colonne de dessalage. Utiliser le tampon à 100 mM pour élever le pH à environ 8,5 pour accélérer la réaction de conjugaison. </li><li> Hydrater ortho-pyridyl-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) avec 100 mM sbicarbonate odium à un volume de 1 ml à une concentration de 1 mg / ml ou plus. NOTE: OPSS-PEG-NHS devrait être fraîche et utilisée dans environ 20 min. Le groupe NHS sur la OPSS-PEG-NHS a une demi-vie d&#39;environ 20 min dans une solution aqueuse à un pH de 8,5. </li><li> Ajouter OPSS-PEG-NHS à la solution d&#39;anticorps à un rapport 2: 1 (PEG: Antibody) Taux de conjugaison à utiliser pour les échantillons d&#39;essai. Dans un tube de microcentrifugeuse séparé, ajouter OPSS-PEG-NHS à la solution d&#39;antigène à un rapport 2: 1 de conjugaison à être utilisé pour le contrôle. NOTE: Le ratio de 2: 1 est en supposant un rendement de conjugaison de 50%. L&#39;objectif est d&#39;étiqueter chaque anticorps avec une chaîne de PEG. Dans cette étape, sur l&#39;étiquetage est mieux que sous-étiquetage. Utilisez l&#39;équation suivante pour déterminer les volumes appropriés de OPSS-PEG-NHS et solution d&#39;anticorps: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> où V est le volume, C est la concentration exprimée en molécules ou d&#39; untibodies par ml. Subscripts PEG et Ab sont OPSS-PEG-NHS et de l&#39; anticorps, respectivement. Le volume final doit être d&#39;environ 250 pi. </li><li> Incuber solution PEG-Ab à 4 ° C pendant 8 heures ou toute la nuit. Conserver la solution en aliquotes d&#39;environ 25 pi de travail à -20 ° C pour limiter les cycles de congélation-décongélation et assurez-vous d&#39;utiliser des tubes de liaison faible. </li></ol></li></ol> 2. Préparer UV-Vis / Raman Sondes <ol><li> Préparer la solution de AUNP nue <ol><li> Préparer une solution de 2 ml de AuNPs avec une concentration d&#39;environ 1 x 10 11 particules par ml. <ol><li> Si les AuNPs doivent être concentrées, remplir des tubes de centrifugeuse de liaison faible avec 2000 ul d&#39;actions AUNP et centrifuger à 5000 xg pendant 20 minutes ou jusqu&#39;à ce que le surnageant soit clair. Retirer le surnageant par pipetage, en faisant attention de ne pas perturber le culot AUNP. </li><li> Combinez les solutions AUNP restants dans un tube et estimer la concentrationtion en obtenant une mesure du rayonnement UV-Vis et on compare les valeurs à des concentrations connues comme cela est une relation linéaire. </li></ol></li></ol></li><li> Déterminer le rapport d&#39;étiquetage rapporteur Raman approprié <ol><li> Préparer une solution de travail du journaliste Raman dissous dans le méthanol. Cette concentration sera dépendante du rapporteur utilisé. Dans ce travail, préparer l&#39;iodure de 3,3&#39;-diéthylthiatricarbocyanine (DCTC) à une solution de travail de 200 uM. </li><li> En supposant un volume final de 100 pi pour chaque puits, ajouter suffisamment de la solution de reporter de travail à chaque puits de la première rangée d&#39;une plaque de 96 puits de telle sorte que le journaliste Raman se situera à des concentrations allant de 0,2 um à 10 um. Ajouter suffisamment d&#39;eau de qualité HPLC à chaque puits de telle sorte que le volume est de 80 ul. Ajouter 20 pi de AUNP à chaque puits faisant un volume final de 100 ul de chaque puits. Un exemple est fourni dans le tableau 1. </li><li> Mesurer les spectres UV-Vis de 400 à700 nm en utilisant une plaque de lecture spectrophotomètre UV-Vis. La concentration appropriée est la concentration la plus élevée avec des pics définis pour les spectres UV-Vis. Répétez l&#39;étape 2.2.2 à l&#39;augmentation des concentrations jusqu&#39;à ce que le ratio le plus élevé de concentration de journalistes Raman à AuNPs se trouve. NOTE: Le colorant et la forme de AUNP, la taille, et le fabricant influencent la concentration appropriée. Par conséquent, les étapes ci doivent être évalués et modifiés en fonction des composants utilisés. Ce protocole implique l&#39;utilisation d&#39;un colorant chargé positivement. En tant que tel, la liaison entre le AUNP et journaliste a été améliorée en utilisant AuNPs chargés négativement. Ceci a été réalisé en utilisant du citrate coiffé AuNPs. Voir la section Discussion pour plus de détails. </li></ol></li><li> Reliure Raman reporter et PEG-Ab à AUNP <ol><li> Préparer deux lots de 1,5 ml AUNP et Raman reporter à la concentration déterminée au préalable, ce qui permet le reporter Raman de se lier aux AuNPs pendant 30 min à température ambiante.</li><li> Ajouter l&#39;anticorps pégylé (PEG-Ac) pour un lot de la solution rapporteur AUNP et Raman pour créer un 200: 1 ratio d&#39;anticorps à des particules. Cette solution sera pour les échantillons d&#39;essai. Dans un tube de microcentrifugeuse séparé, ajouter l&#39;antigène pégylé à l&#39;autre lot de la solution AUNP et Raman reporter à 200: 1 ratio d&#39;anticorps à des particules à être utilisé comme témoin. Incuber les solutions pendant 30 min à température ambiante. NOTE: Le rapport des anticorps à des particules sera spécifique aux AuNPs et le colorant utilisé et doit être optimisé pour chaque cas individuel. L&#39;objectif ici est d&#39;avoir le plus haut taux d&#39;anticorps pour les sondes de AUNP de se lier à tout en empêchant l&#39;agrégation des particules. Utilisez l&#39;équation suivante pour déterminer les volumes appropriés d&#39;additionner: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> où V est le volume, C est la concentration exprimée sous forme de particules ou d&#39; anticorps par ml. La nageoirele volume al devrait être d&#39;environ 1,5 ml. </li></ol></li><li> Bloquer les sites restants sur la surface AUNP avec mPEG-SH. <ol><li> Préparer mPEG-SH par dissolution solide méthoxy polyéthylène glycol thiol à une concentration de 200 uM avec de l&#39;eau. Vortex jusqu&#39;à ce que la solution de mPEG-SH soit complètement dissous. </li><li> Ajouter mPEG-SH à 40,000: 1 rapport à la solution AUNP-PEG-Ab faite à l&#39;étape 2.3. Incuber la solution à la température ambiante pendant 10 minutes pour assurer que les sites restants sur la nanoparticule d&#39;or sont bloqués. Utilisez l&#39;équation suivante pour déterminer les volumes appropriés d&#39;additionner: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> où V est le volume, C est la concentration exprimée sous forme de particules ou d&#39; anticorps par ml. Le volume final devrait être d&#39;environ 1,5 ml. </li></ol></li><li> Récupérer des sondes Raman fonctionnalisés. <ol><li> particules centrifuger à 5000 xg pendant 20 min en basse bind ctubes entrifuge ou jusqu&#39;à ce que le surnageant soit clair. Retirer le surnageant par pipetage en faisant attention à ne pas perturber les AuNPs. </li><li> Resuspendre les particules avec 1 ml de solution PBS 1x qui a été faite précédemment. Estimer la concentration AUNP en prenant une mesure d&#39;un faible volume de solution (3 pi) UV-Vis et comparer les résultats à la mesure d&#39;une concentration AUNP connue. Ajuster le volume de telle sorte que la solution finale est d&#39; au moins 1 x 10 11 particules par ml. </li><li> solutions de magasins à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il est utilisé pour la fonctionnalisation de la plaque de dosage immunologique. Utilisez les solutions en une semaine. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Les volumes d&#39;ajouter de chaque composant (ml) </td></tr><tr><td> DCTC concentration finale (mM) </td><td> Solution de travail DCTC (200 mM) </td><td> AUNP </td><td> Eau </td></tr><tr><td> 0,2 </td&gt; <td> 0,1 </td><td> 20 </td><td> 79,9 </td></tr><tr><td> 0,6 </td><td> 0,3 </td><td> 20 </td><td> 79,7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 20 </td><td> 79,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77,5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3.5 </td><td> 20 </td><td> 76,5 </td></tr><tr><td> dix </td><td> 5.0 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. DCTC exemple de dilution. Diverses dilutions de DCTC et les volumes associés d&#39;actions DCTC, solution de nanoparticules d&#39; or, et de l&#39; eau. 3. Immunoassay Plate Préparation <ol><li> Lier l&#39; antigène désiré à la plaque de dosage immunologique. <ol><li> Préparer suffisamment antigène dilué (50 pg / ml) pour remplir les puits de polystyrène. Vortex la solution,et ajouter immédiatement la solution dans les puits de la plaque. Permettre à l&#39;antigène de se lier aux plaques pendant 1 heure à température ambiante. </li></ol></li><li> Laver les antigènes non liés. <ol><li> Retirer la solution d&#39;excès d&#39;antigène par le dumping solution dans un récipient d&#39;élimination et de frapper la plaque contre une table d&#39;essuie-tout recouvert. </li><li> Ajouter TBST aux puits pour laver la surface puis retirez le lavage de la même manière comme indiqué précédemment. Répétez cette étape deux fois plus. </li></ol></li><li> Bloquer les sites de liaison restant sur la plaque pour empêcher la liaison non spécifique. <ol><li> Ajouter 70 ul de solution de blocage HSA à chaque puits de la plaque et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Retirer et rincer la plaque en utilisant la même procédure que spécifié à l&#39;étape 3.2. Couvrir la plaque et de stockage à sec à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Fonctionnaliser plaque de dosage immunologique. <ol><li> Ajouter 70 ul de til sonde nanoparticules préparées à la section 2 de la première colonne d&#39;une plaque de 96 puits et diluer les colonnes suivantes en utilisant une dilution 1: série 2. Laisser la plaque incuber pendant au moins 1 h. Un exemple de la façon de préparer la plaque de dosage immunologique est donnée à la figure 3. </li><li> Laver la plaque avec du TBST cinq fois plus détaillées dans les étapes 3.2, en veillant à disposer des AuNPs appropriée. Après le lavage final, ajouter 70 ul de PBS 1x à chaque puits et couvrir avec un joint de plaque. REMARQUE: Les échantillons de contrôle doivent être claires. Si la liaison non spécifique a eu lieu, les échantillons de contrôle ont une couleur similaire à celle des échantillons d&#39;essai. </li></ol></li><li> Test de sensibilité du dosage par UV-Vis et spectroscopie Raman. <ol><li> Pour chaque puits, mesurer l&#39;UV-Vis spectres allant de 400 à 700 nm en utilisant une plaque de lecture spectrophotomètre UV-Vis. </li><li> En utilisant un microscope inversé Raman, focaliser l&#39;objectif sur la surface du puits qui a les sondes AUNP. Obnir un spectre Raman du puits. Collecter un spectre allant de 1800 cm -1 à 400 cm -1. Répétez cette étape pour tous les puits. </li><li> L&#39; utilisation d&#39; un logiciel approprié du spectre, effectuer une commande de correction de ligne de base 11 ème polynôme pour les spectres Raman et un 3 ème ordre polynomial pour la spectres UV-Vis. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un logiciel spectrale appropriée, normaliser la Raman et spectres UV-Vis. Réglez la valeur maximale à 1 et l&#39;échelle toutes les autres valeurs en conséquence. Pour normaliser les spectres Raman, sélectionnez un pic de polystyrène unique et le mettre égal à 1 et l&#39;échelle toutes les autres valeurs en conséquence. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un logiciel spectrale appropriée, effectuer une intégration de pointe pour chaque spectre. Pour les spectres Raman, le pic représentant le journaliste Raman doit être dans une région absente des pics de polystyrène. Pour effectuer une intégration maximale, spécifier les limites intégrales pour le pic souhaité et enregistrer la zone de pic désirée pour tous les échantillons y compris les témoins. </li><li> PLot la surface du pic d&#39;intérêt moyen en fonction du log de la concentration AUNP avec des barres d&#39;erreur pour chaque point indiquant son écart-type associé. Adapter à ces points d&#39;étalonnage à une courbe logistique à 4 paramètres. </li><li> Déterminer la valeur moyenne de l&#39;ébauche en calculant la moyenne de la zone du pic d&#39;intérêt pour un échantillon à blanc. Déterminer l&#39;écart-type de ces zones; ceci est l&#39;écart type de l&#39;ébauche. </li><li> Pour le même pic analysé à l&#39;étape précédente, pour l&#39;écart-type de ladite zone de pic pour la concentration la plus faible. </li><li> Calculer la limite de la limite vide et inférieure de détection tel que spécifié dans la section des résultats représentant. Utilisez ces valeurs avec les courbes d&#39;étalonnage 4PL pour déterminer la LLOD en termes de concentration AUNP. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans le protocole détaillé, il existe plusieurs points critiques pour faire face. Une question est le choix de Raman reporter et nanoparticules d&#39;or. Bien que le protocole a été écrit pour être adapté à un usage individuel, Raman journaliste DCTC a été utilisé comme un exemple. DCTC est un journaliste chargé positivement et se lie à des surfaces telles que le citrate plafonné AuNPs chargé négativement. Ce protocole peut être adapté pour les journalistes chargés négativement en utilisant des nanoparticules d&#39;or a...

dosages immunologiques en sandwich typique détecter indirectement la présence d&#39;un antigène en utilisant deux anticorps. L&#39;anticorps de capture est lié à une surface solide et forme un complexe anticorps-antigène lorsqu&#39;il est à proximité d&#39;un antigène approprié. Un anticorps de détection est ensuite introduit et se lie à l&#39;antigène. Après lavage, les anticorps / antigène / anticorps et reste complexe est détecté par l&#39;anticorps de détection marqué comme le montre la figure 1A. Détection typique est effectuée par un détecteur fluorescent ou colorimétrique, ce qui limite le multiplexage à 10 analytes en raison des larges pics spectraux 2,3. En revanche, les systèmes basés sur Raman ont des pics d&#39;émission beaucoup plus étroite aboutissant à de meilleures capacités de multiplexage avec des sources revendiquant la détection simultanée de jusqu&#39;à 100 analytes 2,3. De nombreuses sources sont disponibles dans la littérature , qui couvrent des aspects importants liés à des dosages immunologiques 4 - 6 tel que l&#39; étape par étape ,détails pour créer des kits ELISA personnalisés. Malheureusement, ces protocoles pour la détection fluorescente ou colorimétrique, ce qui limite la capacité de multiplexage des analyses immunologiques sur mesure. Pour répondre à ce besoin, nous présentons une procédure détaillée pour fabriquer les UV-Vis / Raman immunologique publié précédemment 7 pour une analyse immunologique directe comme illustré sur la figure 1B. Ce protocole comprend la fabrication des sondes à base de nanoparticules d&#39; or fonctionnalisée, représentée sur la figure 2. La procédure pour rendre les sondes / UV-Vis Raman commence par la presse Raman se lier à la surface des nanoparticules d&#39;or (AuNPs). Les AuNPs sont ensuite fonctionnalisés avec des anticorps qui sont associés à du polyéthylène glycol (PEG). les sites de liaison restants sur les AuNPs sont bloquées par une liaison thiol, un groupe méthoxy polyéthylène glycol (mPEG-SH) afin d&#39;empêcher AuNPs ultérieur liaison non spécifique au cours de l&#39;analyse. Les sondes AUNP préparées sont testées en se liant à des antigènesfixé sur les puits d&#39;une plaque de polystyrène comme illustré sur la figure 1B. Après lavage de la plaque, les sondes de AUNP sont détectés en utilisant la spectroscopie UV-visible, tandis que les reporters de Raman associés sont détectés par spectroscopie Raman. La combinaison des données Raman spectrale UV-Vis et fournit deux méthodes d&#39;analyses, le renforcement des capacités de ce test immunologique.

<table><tbody><tr><td>Nanoparticule d’or 60 nm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>Il s’agit de nanoparticules d’or recouvertes de citrate. Veuillez consulter la discussion pour la relation entre le rapporteur Raman et la charge de surface AuNP et son importance pour la sélection appropriée de l’AuNP et/ou du rapporteur Raman.</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Méthanol Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Saline tamponnée (10x) pH 7,5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration par le haut de la bouteille</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbate 20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>Utilisé comme agent émulsifiant pour les étapes de lavage.</td></tr><tr><td>Concentré salin tamponné au phosphate 10x, pH 7,4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>Tube LoBind protéiné 2,0&nbsp ; Les</td><td>tubes Eppendorf</td><td>22431102</td><td>les tubes LoBind empêchent la liaison des protéines et des AuNPs à la surface des tubes.</td></tr><tr><td>Tube Protéiné LoBind 0,5&nbsp ; ml</td><td>Les tubes Eppendorf</td><td>22431064</td><td>les tubes LoBind empêchent la liaison des protéines et des AuNPs aux surfaces des tubes.</td></tr><tr><td>Dispositifs pour microplaques UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>Utilisé pour l’étanchéité et le stockage de plaques fonctionnalisées.</td></tr><tr><td>Plaque de dosage, avec couvercle à faible évaporation, 96 puits à fond plat</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime ;-Diethylthiatricarbocyanine iodure (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>Raman reporter</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5 000 - 1 gramme</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5 000 - 1&nbsp ; gram</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA a une extrémité NHS.</td></tr><tr><td>IgG de souris, contrôle de la molécule entière</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>Antigène</td></tr><tr><td>de chèvre anti-IgG de souris (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>Anticorps</td></tr> Solution de <tr><td>blocage de l’albumine sérique humaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td><td>L’albumine sérique bovine peut être utilisée à la place.</td></tr><tr><td>Mini centrifugeuse</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Thermo Scientific Nanodrop</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>Fabriqué en interne 785&nbsp ; nm microscope Raman inversé N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td>Un microscope Raman inversé est le meilleur pour une mise au point correcte sur la surface de la plaque de puits. Sinon, un très faible grossissement sera utilisé en raison de la hauteur de la plaque à 96 puits. Un système construit à l’interne a été utilisé, car il était moins cher que d’acheter auprès d’un fournisseur. Cependant, tout système de microscope Raman inversé disponible dans le commerce peut être utilisé.</td></tr></tbody></table>

fabricating uv-vis et raman spectroscopy platform immunoassay

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Les dosages immunologiques sont utilisés pour détecter des protéines sur la base de la présence d&#39;anticorps associés. En raison de leur utilisation intensive dans la recherche et les paramètres cliniques, une grande infrastructure d&#39;instruments et de matériaux immunoessais peut être trouvé. Par exemple, 96- et 384 puits de plaques de polystyrène sont disponibles dans le commerce et ont un design standard pour accueillir l&#39;ultraviolet visible (UV-Vis) Machines de spectroscopie de différents fabricants. En outre, une grande variété d&#39;immunoglobulines, des étiquettes de détection, et des agents de blocage pour la conception des dosages immunologiques personnalisés tels que des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) sont disponibles. En dépit de l&#39;infrastructure existante, des kits ELISA standards ne répondent pas à tous les besoins de la recherche, ce qui nécessite le développement d&#39;immuno-essai individualisé, qui peut être coûteux et fastidieux. Par exemple, les kits ELISA ont une faible multiplexage (détection de plus d&#39;un analyte à la fois) des capacités car elles dépendent généralement de la fluorescence ou de la colméthodes orimetric pour la détection. Des analyses colorimétriques et fluorescents à base ont des capacités limitées de multiplexage en raison de larges pics spectraux. En revanche, la spectroscopie Raman méthodes basées sur-ont une capacité beaucoup plus grande pour le multiplexage en raison des pics d&#39;émission étroites. Un autre avantage de la spectroscopie Raman est que les journalistes Raman éprouvent beaucoup moins photoblanchiment que des marqueurs fluorescents 1. Malgré les avantages que les journalistes Raman ont plus de marqueurs fluorescents et colorimétriques, les protocoles pour fabriquer des immunoessais à base de Raman sont limitées. Le but de ce document est de fournir un protocole pour préparer des sondes fonctionnalisés à utiliser en conjonction avec des plaques de polystyrène pour la détection directe des analytes par analyse UV-Vis et spectroscopie Raman. Ce protocole permettra aux chercheurs d&#39;adopter une approche do-it-yourself pour la détection future multi-analyte tout en capitalisant sur l&#39;infrastructure pré-établie.

Dans cette étude, les 60 nm particules d&#39;or ont été utilisés pour la spectroscopie UV-Vis. UV-Vis spectres d&#39;absorption de 400 à 700 nm ont été recueillies et les surfaces des pics pour chaque concentration AUNP ont été déterminées en utilisant un logiciel open source d&#39;analyse spectrale 8. Avant pic d&#39;intégration, les spectres collectés a subi une correction de base en utilisant un ajustement polynomial trois points. Les surfaces des pics ont été utilisées pour générer une courbe d&#39;étalon...

Les sondes optiques à base de nanoparticules ont été conçues pour détecter les antigènes à l’aide de la spectroscopie Raman et UV-Vis. Nous décrivons ici un protocole permettant de préparer de telles sondes pour un immunodosage par spectroscopie UV-Vis/Raman de manière à intégrer les futures capacités de multiplexage.

Fabricating UV-Vis et Raman Spectroscopy Platform Immunoassay

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer le développement d'un immunodosage basé sur des nanoparticules d'or, personnalisable et pouvant être analysé par spectroscopie UV-visible et spectroscopie Raman. L'utilisation de deux méthodes optiques permet une validation interne du dosage et augmente sa souplesse d'utilisation. Cette méthode répond à des questions essentielles concernant l'élaboration d'un immunodosage fondé sur des nanoparticules d'or.Et explique comment la fonctionnalisation de la nanoparticule utilisée dans ce dosage influencera l'absorption optique et la diffusion de la lumière. Ce protocole est unique car il intègre des matériaux présents dans les laboratoires de recherche typiques afin de fabriquer une plateforme d'immunodosage pouvant être personnalisée selon les besoins de recherche individuels. L'immunodosage repose sur la spectroscopie UV-Vis et la spectroscopie Raman.L'utilisation de la spectroscopie Raman est préférable aux méthodes fluorescents ou colorimétriques car elle présente des bandes passantes plus étroites, permettant la détection simultanée de plusieurs biomarqueurs. Pour commencer, hydratez l'agent de réticulation bifonctionnel ou le PEG-NHS pyridyl disulfure dans 100 mL de bicarbonate de sodium. L'extrémité ortho-pyridyle se liera à la surface des nanoparticules d'or, tandis que l'extrémité NHS réagira avec l'amine primaire présente à la surface des protéines une fois activée.Veillez à préparer la solution de réticulation environ 20 minutes avant son utilisation. Ensuite, ajoutez le réticulateur bifonctionnel à la solution d'anticorps selon un rapport de conjugaison de 2 à 1. Assurez-vous que la solution d'anticorps est exempte de protéines porteuses susceptibles d'interagir avec la réaction.Dans un autre tube de microcentrifugeuse, ajouter le réactif de réticulation bifonctionnel à la solution d'antigène au même ratio que celui utilisé pour le témoin. Le ratio de 2 à 1 suppose un rendement de conjugaison de 50 %. L'objectif est de marquer chaque anticorps avec une seule chaîne de PEG.Dans cette étape, un étiquetage excessif est préférable à un étiquetage insuffisant. Incubez enfin la solution d'anticorps pegylée à quatre degrés Celsius pendant huit heures. Conservez des aliquotes de 25 microlitres de la solution dans des tubes à faible rétention à moins 20 degrés Celsius afin de limiter les cycles de congélation-décongélation.Utilisez chaque aliquote selon les besoins. Afin de préparer les sondes Raman, préparez d'abord deux lots de 1,5 mL de nanoparticules d'or sur le rapporteur Raman, avec les concentrations déterminées comme décrit dans le protocole accompagnant le texte. Cette étape est réalisée en combinant les solutions du rapporteur Raman et des nanoparticules d'or, puis en laissant les composants se lier pendant trente minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez la solution d'anticorps PEGylée à l'une des solutions de nanoparticules d'or liées au marqueur rapporteur afin d'obtenir un rapport de 200 à 1 entre les anticorps et les particules. Cette solution sera destinée aux échantillons de test. Dans un autre tube de microcentrifugation, ajoutez un antigène PEGylé à l'autre solution de nanoparticules d'or liées au marqueur rapporteur selon un rapport de 200 à 1 entre l'antigène et les particules, qui servira de témoin.Incubez les deux solutions pendant trente minutes à température ambiante. Ensuite, bloquez les sites restants à la surface des nanoparticules. Pour ce faire, dissolvez d'abord le thiocol de méthoxypolyéthylène glycol solide jusqu'à une concentration de 200 micromolaire en utilisant de l'eau HPLC.Vortexez la solution jusqu'à ce que le thiol soit complètement dissous. Ensuite, ajoutez la solution de thiol à un rapport de 40 000 pour 1 aux solutions d'anticorps PEG liés aux nanoparticules et incubez la solution à température ambiante pendant dix minutes afin de s'assurer que les sites restants sur la nanoparticule d'or soient bloqués. Puis, récupérez les sondes Raman fonctionnalisées en centrifugeant les particules dans des tubes de centrifugation à faible rétention, de manière à obtenir un surnageant clair.Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, mais prendre soin de ne pas perturber les nanoparticules. Ensuite, resuspendre les nanoparticules dans 1 mL de PBS. Estimer la concentration des nanoparticules d’or en effectuant une mesure UV-visible à partir d’environ 3 microlitres de la solution, puis comparer les résultats à ceux obtenus avec une concentration connue de nanoparticules d’or, cette relation étant linéaire.Si les nanoparticules ne sont pas suffisamment bloquées, elles s'agrégeront en raison des forces d'adhésion interparticulaires, ce qui indique que les réactifs ont été ajoutés à des concentrations incorrectes. Normalement, la solution présente une couleur rouge foncé, mais l'agrégation confère une teinte grise. Ajustez les volumes de sorte que les solutions finales contiennent au moins 1 × 10¹¹ particules par millilitre et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation pour la fonctionnalisation de la plaque de dosage des amines.Utilisez ces solutions dans la semaine. Préparez d'abord une quantité suffisante d'antigène dilué pour remplir les puits en polystyrène. Ensuite, vortexez la solution et ajoutez-la immédiatement dans les puits de la plaque.Laisser l’antigène se lier aux puits pendant une heure à température ambiante. Ensuite, éliminer la solution d’antigène en excès en vidant la solution et en tapotant la plaque sur une surface recouverte d’un torchon en papier. Ajouter du TBST dans les puits pour laver la surface, puis retirer la solution de lavage en la vidant à nouveau et en tapotant la plaque sur une surface recouverte d’un torchon en papier.Ensuite, bloquer les sites de liaison restants sur la plaque afin d'éviter toute liaison non spécifique en ajoutant 70 microlitres de solution de blocage d'HSA dans chaque puits de la plaque et en incubant la plaque à température ambiante pendant trente minutes. Puis, retirer la solution de blocage et rincer la plaque trois fois avec du TBST comme précédemment démontré. Après avoir éliminé le dernier rinçage, couvrir la plaque et la conserver à sec à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure.Ajouter 140 microlitres des nanoparticules de sonde préparées précédemment dans la première colonne d'une plaque de 96 puits. Placer les nanoparticules de test dans les cinq premières lignes, puis les nanoparticules de contrôle dans les trois dernières lignes. Ajouter 70 microlitres de PBS dans toutes les autres colonnes.Effectuez une dilution sérielle de 1 à 2 pour chaque colonne. Commencez par prélever 70 microlitres à partir de la première colonne et mélangez-les avec la deuxième. Ensuite, prélèvez 70 microlitres à partir de la deuxième colonne et ajoutez-les à la troisième, et ainsi de suite.Laisser la plaque incuber pendant au moins une heure. Ensuite, retirer les sondes de nanoparticules non liées et laver la plaque cinq fois avec du TBST, comme démontré précédemment. Après le dernier lavage, ajouter 70 microlitres de PBS dans chaque puits et couvrir la plaque avec un scellant pour plaque.Vérifiez que les échantillons témoins sont limpides. Si une liaison non spécifique s'est produite, les échantillons témoins auront une couleur similaire à celle des échantillons test. Pour chaque puits, utilisez un spectrophotomètre UV-visible à lecture sur plaque pour mesurer les spectres UV-visible allant de 400 à 700 nanomètres.À l’aide d’un microscope Raman inversé, focalisez l’objectif sur la surface du puits contenant les sondes de nanoparticules d’or. Obtenez un spectre Raman du puits. Enregistrez un spectre allant de 1800 cm⁻¹ à 400 cm⁻¹ et répétez cette opération pour chaque puits.Enfin, suivez les étapes de la dernière section du protocole écrit associé pour déterminer la sensibilité du dispositif. Des particules d'or de 60 nanomètres ont été préparées comme décrit dans cette vidéo. Elles ont ensuite été analysées par spectroscopie UV-visible et par spectroscopie Raman.Les surfaces des pics, où chaque concentration de nanoparticules d'or a été déterminée à l'aide d'un logiciel libre d'analyse spectrale, ont servi à établir une courbe de calibration logarithmique similaire à celle illustrée ici. À partir de ces données, la limite de détection a été établie à 3,5 picomolaire pour la détection UV-visible et à 1,7 picomolaire lorsqu'on utilise la spectroscopie Raman. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment personnaliser des immunodosages fondés sur des sondes nanoparticulaires à l'aide de la spectroscopie UV-Vis et de la spectroscopie Raman.

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