SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées

L’objectif global de cette procédure est de caractériser le protéome exosomal des cellules infectées par le VIH-1. Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de la biologie des exosomes, telle que l’effet des contraintes externes sur la composition du protéome des exosomes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être apprise même avec une expérience limitée en protéomique et en biologie des exosomes.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’infection par le VIH, elle peut également être appliquée à d’autres études sur des maladies telles que les infections bactériennes. La lignée cellulaire H9 est utilisée dans cette expérience, bien que diverses lignées cellulaires puissent être utilisées tant qu’elles sont en phase de prolifération active et qu’elles sont sensibles à la condition d’essai choisie. Ensemencez deux fois 10 à neuf cellules de sixième étape dans chacun des deux flacons de culture cellulaire.

Cultivez une population dans 10 millilitres de milieu étiqueté contenant 10 % de FBS stylisé, 100 milligrammes par litre de L-lysine marquée en C13 et 100 milligrammes par litre de L-arginine marquée en C13 et N15. Cultivez l’autre population dans 10 millilitres de milieu non étiqueté avec 10 % de FBS stylisé, de L-lysine et de L-arginine. Cultivez les cellules pendant six doublements, après quoi les protéines des cellules du milieu marqué sont marquées à plus de 99 % avec des acides aminés lourds.

Ajoutez un nouveau support ou changez-le à intervalles réguliers en fonction du type de cellule. À la fin du marquage, augmentez le volume de culture à 30 millilitres pour permettre la croissance de plus de cellules. Infectez les cellules marquées avec la souche NL4-3 du VIH-1 en utilisant un protocole d’infection standard du VIH-1.

Ajoutez une quantité appropriée de virus aux cellules et incubez pendant 48 heures pendant que les cellules non marquées continuent de croître dans un milieu non marqué sans infection par le VIH-1. À la fin de l’infection par le VIH-1, les surnageants des deux populations cellulaires sont récoltés pour l’isolement des exosomes. Recueillir les surnageants des cultures dans des tubes coniques de 50 millilitres en évitant les cellules.

Centrifugez pendant 10 minutes à 300 fois g et quatre degrés Celsius pour éliminer les cellules restantes. Collectez les surnageants dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez-les pendant 10 minutes à 2 000 fois g pour éliminer les cellules mortes. Transférez les surnageants résultants dans des tubes commerciaux compatibles avec les rotors capables de résister à l’ultracentrifugation.

Assurez-vous d’équilibrer les tubes de l’ultracentrifugeuse. Centrifugez les tubes pendant 30 minutes à 10 000 fois g pour éliminer les débris cellulaires. Collectez les surnageants dans de nouveaux tubes d’ultracentrifugation.

Centrifuger pendant 70 minutes à 100 000 fois g. Jeter le surnageant. Remettez en suspension chaque pastille riche en exosomes dans cinq millilitres de PBS frais et transférez la solution dans un tube d’ultracentrifugation frais.

Centrifugez à nouveau pendant 70 minutes à 100 000 fois g. Après le dernier tour, défaussez le surnageant. Les granules cellulaires sont maintenant prêtes pour l’extraction des protéines.

Pour commencer cette procédure, dissolvez chaque pastille exosomale isolée dans 100 à 200 microlitres de fer-pa-lai-ses et un tampon d’extraction avec des inhibiteurs de protéase ajoutés qui peuvent inhiber une gamme complète de protéases. Centrifugez les solutions dissoutes pendant 10 minutes à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius. Transférez les surnageants éliminés dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Après avoir quantifié la concentration en protéines de chaque échantillon à l’aide d’essais standard, mélangez des quantités égales de protéines provenant d’échantillons marqués et non marqués. Appliquez le mélange égal sur un gel de quatre à 20 % de SDS-PAGE pendant 30 minutes. Teindre le gel avec du bleu Coomassie puis décolorer.

À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la bande d’échantillon du gel, puis coupez la bande de gel en 10 à 15 morceaux égaux. Mettez chaque morceau dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour un total de 10 à 15 tubes, et poursuivez la procédure d’extraction des protéines comme décrit dans le protocole de texte. Les procédures d’analyse des données protéomiques ne seront pas démontrées, mais sont résumées dans cet organigramme.

Les protéines extraites sont d’abord analysées par chromatographie en phase liquide, spectroscopie de masse en tandem, et la qualité des données est évaluée. Ensuite, les données sont prétraitées en supprimant les protéines qui ont moins de deux peptides quantifiés. Les protéines significativement régulées à la hausse et à la baisse sont ensuite identifiées.

Enfin, les répétitions des candidats significatifs sont comparées pour assurer la cohérence, et les données de toutes les répétitions sont fusionnées. Pour commencer la caractérisation des protéines identifiées, utilisez leurs numéros d’accession GenBank ou leurs identifiants UniProt pour effectuer des recherches dans les bases de données actuelles d’exosomes. ExoCarta sera utilisé dans cette démonstration.

Cliquez sur requête et entrez le nom du gène ou de la protéine ou le numéro d’acquisition. Toute preuve dans les exosomes vérifie que les protéines candidates ont déjà été trouvées dans les exosomes et ajoute une couche de confiance que les candidats sont bien dans les exosomes. Ensuite, recherchez les candidats dans la base de données sur les interactions entre le VIH-1 et les protéines humaines.

Sur l’entrée du nom de domaine de la protéine, entrez les noms ou les numéros d’accession du candidat, puis cliquez sur Rechercher. Les résultats de la recherche peuvent donner un aperçu des interactions entre le VIH-1 et les protéines candidates, et suggérer lesquels des candidats pourraient être véritablement associés au VIH-1. La troisième étape consiste à obtenir un aperçu global des candidats à l’aide d’une ontologie génétique ou d’un logiciel d’analyse GO tel que fun-brich.

Sous Analyse d’enrichissement, cliquez sur Ajouter un ensemble de données et téléchargez les numéros d’accession GenBank ou les ID UniProt des candidats, puis sélectionnez le type de graphique pour visualiser l’analyse GO. Les résultats de l’analyse GO sont visualisés sous la forme de diagrammes circulaires qui fournissent des informations sur les protéines candidates dans les domaines du processus biologique, de la composante cellulaire et de la fonction moléculaire. L’étape suivante consiste à identifier les termes GO statistiquement surreprésentés à l’aide de l’analyse DAVID.

Cliquez sur l’outil d’annotation fonctionnelle, entrez la liste des candidats et sélectionnez l’identificateur du gène, tel que UniProt ID.Sélectionnez la liste de gènes et effectuez une recherche. Une fois la recherche terminée, cliquez sur la page des résultats du résumé de l’annotation sous la catégorie ontologie génétique pour afficher les termes GO enrichis, les valeurs p et d’autres paramètres. Enfin, étudiez les interactions potentielles protéine-protéine et les voies biochimiques possibles à l’aide de la base de données STRING librement accessible.

Entrez l’ID ou la séquence de la protéine dans la boîte de recherche désignée et sélectionnez l’espèce appropriée pour l’analyse. Cliquez sur rechercher. Les résultats fourniront des informations sur les associations directes et indirectes.

Les 10 meilleures correspondances connues pour le candidat exosomal affiché dans les résultats doivent être prises en compte pour une sélection significative du candidat. Les résultats représentatifs d’une analyse DAVID d’un ensemble de 14 protéines sont présentés. L’enrichissement du processus biologique a indiqué que les processus liés à la mort cellulaire sont considérablement enrichis.

L’enrichissement en composants cellulaires montre de nombreuses protéines d’origine intracellulaire, et l’enrichissement de la fonction moléculaire a identifié un rôle dans la liaison aux protéines pour la plupart des candidats. La chaîne B de la L-lactate déshydrogénase ou LDHB a été sélectionnée comme le candidat le plus significatif, et l’analyse STRING a identifié les 10 principaux partenaires d’interaction de la LDHB. La majorité des partenaires de la LDHB étaient également liés fonctionnellement et géographiquement aux exosomes dans le VIH-1.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer chaque étape à la bonne température et dans les bonnes conditions. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’isolement d’affinité peuvent être effectuées afin de confirmer les prédictions de l’analyse bioinformatique.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine exosomal pour explorer les modifications du protéome exosomal associées aux infections par le VIH-1 en biologie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les exosomes de la culture cellulaire, d’analyser leurs protéomes et d’étudier leur association avec le VIH. N’oubliez pas que le travail avec le VIH ou un autre agent infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure.