Name: SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Découvrez la protéomique SILAC pour caractériser les exosomes des cellules infectées par le VIH-1. Cette méthode quantifie les changements protéiques et s'applique à diverses conditions de stress ou d'infection.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par un supplément ARRA à la Lifespan / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 et ​​K24HD080539 à BR. Ce travail a également été soutenue par le Fonds Lifespan Pilot Research (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20133969) et NIH COBRE URI / RIH pilote de subventions de recherche (P20GM104317) à ML. Nous remercions James Myall et Vy Dang pour l&#39;aide à la préparation des manuscrits et de la figure.

1. Culture cellulaire et VIH-1 Infection NOTE: Avant de commencer les expériences, il est recommandé de vérifier la viabilité des cellules par coloration au bleu Trypan 11 et leur prolifération par le biais d&#39; un test MTT 12. Il est également essentiel d&#39;utiliser milieu SILAC nouvellement préparé. Diverses lignées cellulaires peuvent être utilisés, tant qu&#39;ils sont à un stade de prolifération active et sont sensibles à l&#39;infection par le VIH-1, ou la condition de test de choix. Dans ce protocole, utiliser la lignée cellulaire H9 comme l&#39;exemple. <ol><li> Semences 2 x 10 6 cellules H9 dans chaque flacon de culture cellulaire. Cultiver un groupe dans 10 ml marquées du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum dialyse de fœtus bovin (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lysine et 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginine. Cultiver l&#39;autre groupe dans 10 ml de milieu non marqué RPMI 1640 avec 10% de FBS dialyse, 100 mg / L de L-lysine et 100 mg / L de L-arginine. </li><li>Cultiver les cellules pendant six doublements à quel point les protéines des cellules dans le milieu marqué sont pratiquement totalement étiquetés (&gt; 99%) avec des acides aminés lourds. Ajouter un milieu frais ou changer de support régulièrement (tous les 1-3 jours selon le type de cellule. Pour cellule H9, changement de milieu tous les 3 jours). A la fin du marquage, d&#39; augmenter le volume de la culture (par exemple , ~ 30 ml) pour tenir compte de la croissance de plusieurs cellules. REMARQUE: déterminer le temps de doublement cellulaire exacte au début de l&#39;expérience, par la coloration au bleu Trypan et le comptage des cellules. </li><li> Infect les cellules marquées avec le VIH-1 en utilisant la norme NL4-3 VIH-1 protocole d&#39;infection 13 pendant 48 heures. Incuber les cellules avec des quantités appropriées de virus à une multiplicité d&#39;infection (MOI) d&#39;environ 0,3. Vérifier infection VIH-1 p24 par quantification des surnageants de culture en utilisant un kit de l&#39;antigène p24 du VIH-1 ELISA. Effectuer un test d&#39;immunofluorescence 14 pour confirmer l&#39; infection réussie de cellules. Keep la croissance des cellules non marquées dans un milieu non marqué sans infection VIH-1. </li><li> Récolter les surnageants des deux groupes à la fin de l&#39;infection (étape 2.1). </li></ol> 2. Exosome Isolation NOTE: Grâce à une série d&#39;étapes d&#39;ultracentrifugation, fractions exosomales de surnageants de culture sont enrichis 15. Effectuez toutes les étapes suivantes à 4 ° C, avec un rotor d&#39;ultracentrifugation qui peuvent atteindre une vitesse d&#39;au moins 100 000 x g. <ol><li> Collecter les surnageants des cultures dans 50 tubes coniques ml, en évitant les cellules. Centrifuger pendant 10 min à 300 xg pour éliminer les cellules restantes. </li><li> Collecter les surnageants dans de nouveaux tubes de 50 ml coniques et centrifuger pendant 10 min à 2000 xg pour éliminer les cellules mortes. Transfert des surnageants dans les tubes de rotor compatible commerciaux qui sont capables de résister à une ultracentrifugation résultant. </li><li> Assurez-vous d&#39;équilibrer les tubes d&#39;ultracentrifugation. Centrifuger les tubes pendant 30 minutes à 10.000 xg pour éliminerles débris cellulaires. </li><li> Collecter les surnageants dans des tubes d&#39;ultracentrifugation et centrifuger pour 70 min à 100 000 x g. Jeter les surnageants. </li><li> Resuspendre les pellets exosomes riches dans 5 ml de PBS frais. Transférer les solutions dans des tubes d&#39;ultracentrifugation frais et centrifuger à nouveau pendant 70 minutes à 100.000 x g. </li><li> surnageants Jeter. Pour stocker les exosomes à long terme, remettre en suspension les pastilles dans 50 pl de PBS et conserver à -80 ° C. Sinon, passez directement à l&#39;extraction des protéines, comme indiqué ci-dessous. </li></ol> 3. Protein Extraction et préparation <ol><li> Dissoudre isolés pellets exosomales dans 100-200 ul RIPA lyse et l&#39;extraction avec un tampon ajouté cocktails d&#39;inhibiteurs de la protéase. Le tampon est composé de 25 mM de Tris-chlorhydrate, chlorure de sodium 150 mM, 1% de NP-40, 1% de désoxycholate de sodium et 0,1% de SDS (sodium dodécyl sulfate), à ​​pH 7,6. Les cocktails d&#39;inhibiteur de protéase doivent contenir une variété d&#39;inhibiteurs de protéase, tels que l&#39;aprotinine, bestatine, leupeptin, pepstatine A et EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), qui peut inhiber une gamme complète de protéases. </li><li> Centrifuger les solutions dissoutes pour 10 min à 13000 xg (4 ° C), et transférer les surnageants défrichées à de nouveaux tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. </li><li> Quantifier la concentration en protéine de chaque échantillon d&#39;exosomes en utilisant l&#39; acide bicinchoninique (BCA) ou Bradford dosage 16. </li><li> Mélanger une quantité égale de protéines (2 pg) à partir d&#39;échantillons étiquetés et non étiquetés et exécuter le mélange égal sur un gel SDS-PAGE 4-20% à 120 mA / 200 V pendant 30 min. </li><li> Gel Stain au bleu de Coomassie suivie par détachage 17. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, coupe la voie de l&#39;échantillon à partir du gel. Ensuite, couper la voie de gel en 10-15 morceaux égaux. Mettez chaque morceau en 1,5 ml tube frais de microcentrifugeuse pour un total de 10-15 tubes. </li><li> Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3 dans 50% d&#39; acétonitrile, vortex, et jeter surnageants. Répéter deux fois. Seccubes dans un concentrateur sous vide 18, 19. </li><li> Réhydrater cubes avec 10 mM de dithiothréitol (DTT), vortex et centrifuger brièvement. Incuber à 56 ° C pendant 1 h. surnageant Jeter. </li><li> Immergez cubes de gel dans 55 mM d&#39;iodoacétamide, vortex, et de spin. Incuber à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 45 minutes. surnageant Jeter. </li><li> Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3, vortex, rotation, et éliminer le surnageant. </li><li> Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3 dans 50% d&#39; acétonitrile, vortex, et de spin. Répétez 3.9 et 3.10. </li><li> Sécher les cubes dans un concentrateur sous vide. Ajouter 25 ul séquençage de grade trypsine modifié dans 25 mM NH 4 HCO 3, incuber à 4 ° C pendant 30 min, et jeter l&#39;excès de solution. Immergez cubes dans 25 mM NH 4 HCO 3 sans trypsine, et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> tourner brièvement cubes vers le bas et transférer le peptide supplémentaire résultantct un nouveau tube. Ajouter 30 ul d&#39;acide formique à 5% dans 50% d&#39;acétonitrile aux cubes, vortex pendant 30 min, essorage. Combinez le surnageant avec l&#39;extrait. Sécher les extraits peptidiques avec un concentrateur sous vide à moins de 5 ul. </li><li> Soumettre des échantillons à la masse installation centrale de spectrométrie pour l&#39;analyse LC-MS / MS. Les données d&#39;analyse MS, qui peut être généré à partir d&#39;un logiciel open source, comprend généralement un numéro d&#39;adhésion pour chaque protéine identifiée, étiquetés / rapports non marqués et le nombre de peptides uniques identifiés. </li></ol> 4. Vérification Western blot NOTE: Western blot est recommandé de vérifier les résultats de spectrométrie de masse. <ol><li> Suivre les protocoles de l&#39;Ouest standard de transfert et de veiller à ce que des quantités égales de protéines de chaque groupe sont chargés. Utilisez des anticorps contre les protéines d&#39;intérêt (par exemple A5 annexine, lactate déshydrogénase chaîne B) identifiés par MS. détection Western blot, avec densitométrie analysis, peut réaffirment que MS l&#39;identification des protéines et la quantification sont corrects. </li></ol> 5. Analyse protéomique données NOTE: L&#39;évaluation de la qualité des données, le prétraitement des données, le calcul et la détermination des candidats de protéines importantes sont effectuées séparément pour chaque MS répliquer. Une fois les analyses ci - dessus sont terminées, les données analysées à partir de répétitions sont comparés et combinés 6, 20, 21. <ol><li> Évaluer la qualité des données MS. <ol><li> Tout d&#39;abord, LOG2 transformer le SILAC-MS marqué / ratios non marqués de protéines quantifiées dans un programme de tableur. </li><li> Dans graphique scientifique et logiciel statistique, regrouper les ratios dans 40-100 bacs ratio et tracer le nombre de rapports par bac pour générer un histogramme. Une distribution normale de l&#39; histogramme indique une bonne qualité des données MS 6. Effectuez cette opération pour tous les MS se réplique. </li></ol></li><li>Pour accroître la confiance et la précision des rapports de peptides MS, envisager de supprimer des protéines qui ont moins de deux peptides quantifiés. </li><li> Pour déterminer les candidats de protéines significativement haut et bas réglementé, utilisez les étapes suivantes pour calculer l&#39; importance des seuils 22. <ol><li> Dans graphique scientifique et logiciel statistique, générer une régression non linéaire ou ajustement de courbe des données de distribution de fréquences. Cette étape donne des valeurs qui peuvent être utilisées pour calculer les valeurs de coupure. Calculer les valeurs de coupure que médiane ± 1,96 σ pour les limites de confiance à 95% ou 2,56 σ pour les limites de confiance de 99%. NOTE: Les détails spécifiques de calcul des seuils peuvent être trouvés à Emmott et al. 22. </li><li> Sélectionnez les candidats de protéines dont les ratios sont soit supérieur à 1,96 (ou 2,56) écarts types au-dessus de la médiane (nettement sur-exprimé) ou inférieure à 1,96 (ou 2,56) écarts types en dessous de la médiane (significativement sous-exprimé). </li></ol></li><li> Comparez les répétitions des candidats importants identifiés ci-dessus pour assurer la cohérence. Veiller à ce qu&#39;ils répondent aux critères suivants pour passer cette étape finale de sélection: les candidats doivent être systématiquement identifiés dans toutes les répétitions; et répétitions d&#39;un candidat doivent être cohérentes dans leur direction de la réglementation (de préférence, au moins 2 de 3 répétitions d&#39;un candidat devrait être soit régulée à la hausse ou à la baisse réglementée). </li><li> Finaliser données pour les candidats qui répondent aux critères mentionnés ci-dessus en fusionnant les données de leurs répétitions. </li></ol> 6. Bioinformatics Vérification et caractérisation REMARQUE: l&#39;information génomique et bioinformatique existant offre une mine d&#39;informations pour presque toutes les protéines. L&#39;exploration de données et l&#39;analyse bioinformatique de cette information peuvent aider à gagner beaucoup de perspicacité dans la propriété et les fonctions des candidats importants. Cette procéss est généralement nécessaire de concevoir des expériences de laboratoire humide en aval appropriés. <ol><li> En utilisant leurs numéros GenBank d&#39;adhésion ou les ID UniProt, rechercher les candidats contre les bases de données exosomes actuelles (Exocarta 23, Evpedia 24) pour vérifier que les protéines candidates ont déjà été trouvés dans exosomes. Cette étape ajoute une couche de confiance que les candidats sont en effet en exosomes. <ol><li> Accès http://www.exocarta.org/, cliquez sur &quot;Rechercher&quot; et l&#39;entrée soit le gène ou la protéine nom / numéro d&#39;adhésion. Une page de résumé apparaît et la preuve en exosomes sera montré, à condition, s&#39;il y a lieu. </li></ol></li><li> Rechercher les candidats contre le VIH-1 et la protéine humaine Interaction Database 25. Vous pouvez également rechercher les bases de données spécifiques qui peuvent fournir des informations sur l&#39;interaction des protéines candidates et la condition de test. <ol><li> Accédez à la base de données www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions. Lors de l&#39;entrée «protéine du nom de domaine &#39;, entrez les noms des candidats ou des numéros d&#39;accès, puis cliquez sur rechercher. Les résultats de recherche peuvent donner un aperçu des interactions entre le VIH-1 et les candidats de protéines, et de proposer des candidats qui pourraient être vraiment le VIH-1 associé. </li></ol></li><li> Importation GenBank numéros d&#39;adhésion ou UniProt ID des candidats dans le logiciel d&#39;analyse GO (comme FunRich, enrichissement fonctionnel outil d&#39;analyse 26) et exécuter le logiciel. <ol><li> Téléchargez le logiciel à http://www.funrich.org/. Après l&#39;installation, ouvrez le logiciel, en cours d&#39;analyse d&#39;enrichissement, cliquez sur &quot;Ajouter Data Set&quot;, et télécharger la liste des protéines / gènes. Ensuite, sélectionnez le type de graphique pour visualiser l&#39;analyse de GO. NOTE: GO résultats de l&#39;analyse seront visualisées sous forme de diagrammes circulaires. Cette étape nous aide à mieux comprendre globale associée avec les candidats dans les domaines du processus biologique (BP), le composant cellulaire (CC), et fonction moléculaire (MF). </li></ol></li><li> Accès DAVID au http://david.ncifcrf.gov/ 27, cliquez sur le &quot;outil d&#39; annotation fonctionnelle&quot; sur son site Internet. Entrez la liste des candidats, sélectionnez le &quot;Identifier&quot; du gène tel que le &quot;UniProt ID&quot;, sélectionnez &quot;Liste Gene&quot; et la recherche. Les termes enrichis GO, p-valeurs, et d&#39;autres paramètres peuvent être trouvés en cliquant sur la page &quot;Annotation Sommaire des résultats&quot; dans la catégorie &quot;Gene_Ontology&quot;. </li><li> Pour étudier les interactions potentielles des candidats avec d&#39; autres protéines, utiliser ouvertement accessible la base de données STRING 28 pour élucider les interactions protéine-protéine potentiels et possibles voies biochimiques. NOTE: GO Analyse et Annotation fonctionnelle (section 6,3-6,4) peut également être effectuée en utilisant le dernier logiciel de STRING. <ol><li> Accédez à la base de données http://string-db.org/. Entrez l&#39;ID de protéine ou séquence dans les s désignéscase echerche et sélectionner les espèces correctes pour l&#39;analyse. Cliquez sur &quot;Rechercher&quot;. Les résultats donneront des informations sur les deux associations directes (physiques) et indirects (fonctionnels). Les dix premiers matchs connus pour le candidat de exosomal seront affichés et doivent être pris en considération pour la sélection des candidats importants. NOTE: Une grande partie des informations associées aux candidats peut être analysé en utilisant les étapes ci-dessus. Les candidats les plus importants peuvent être choisis pour une analyse moléculaire et biochimique en aval. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+function%3A+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Booth, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+HIV+Gag+bud+from+endosome-like+domains+of+the+T+cell+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane.</a> J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).</li>
<li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343 (6171), 653-656 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+exosomes+from+HIV-1-infected+lymphocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells.</a> Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Anderson, L., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.</a> Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+MTT+lymphocyte+proliferation+assay+for+the+diagnosis+of+neurocysticercosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis.</a> J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).</li>
<li>Cepko, C., Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+infection+of+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).</li>
<li>Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+immunofluorescence+assay+for+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus.</a> J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).</li>
<li>Olson, B. J. S. C., Markwell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlson%2C+BJSC+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining+for+high+sensitivity+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteom%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics.</a> J Proteom. 90, 96-106 (2013).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+the+comparative+analysis+of+multiprotein+complexes+based+on+15N+metabolic+labeling+and+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein+is+a+multifaceted+cellular+regulator+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication.</a> J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).</li>
<li>Li, M., Ramratnam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Characterization+of+Exosomes+from+HIV-1-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells.</a> Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).</li>
<li>Emmott, E., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interaction+partners+in+mammalian+cells+using+SILAC-immunoprecipitation+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta%3A+A+Web-Based+Compendium+of+Exosomal+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EVpedia%3A+a+community+web+portal+for+extracellular+vesicles+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research.</a> Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1%2C+human+protein+interaction+database+at+NCBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI.</a> Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).</li>
<li>Pathan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunRich%3A+An+open+access+standalone+functional+enrichment+and+interaction+network+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool.</a> Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2011%3A+functional+interaction+networks+of+proteins%2C+globally+integrated+and+scored%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored.</a> Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+pure+are+your+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1%3A+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).</li>
<li>Chertova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+biochemical+analysis+of+purified+human+immunodeficiency+virus+type+1+produced+from+infected+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages.</a> J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).</li>
<li>Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview.</a> Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.

Dans les procédures décrites dans le présent document, nous avons démontré l&#39;application de la technique de SILAC pour étudier l&#39;effet du VIH-1 infection sur le protéome exosomal hôte. Initialement, les cellules infectées et non infectées du VIH-1 sont différentiellement marquée par un isotope. Les exosomes marquées de façon différentielle sont ensuite purifiés avant d&#39;effectuer l&#39;extraction des protéines. Ensuite, la chromatographie liquide-spectrométrie de masse tandem est utilisée pour analyser le pro...

De nombreuses maladies humaines, y compris les infections virales, sont souvent associés à des processus cellulaires distincts qui ont lieu dans et autour des cellules affectées. Les protéines, agissant souvent comme les effecteurs cellulaires ultimes, la médiation de ces processus. L&#39;analyse des protéines peuvent souvent fournir des informations précieuses à l&#39;environnement local des cellules affectées et nous aider à comprendre le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse de la maladie. Parmi les différentes techniques d&#39;analyse des protéines, la protéomique tient particulièrement grande promesse. Comme un outil puissant, à grande échelle, la protéomique peut fournir une compréhension systémique des processus cellulaires, en particulier dans le domaine de la fonction et l&#39;interaction des protéines. L&#39;analyse des protéines spécifiques est simplifiée grâce au développement des techniques de marquage, qui permettent aux chercheurs de surveiller l&#39;expression de composants cellulaires, en particulier des protéines, dans le site de l&#39;enquête. Bien que de nombreuses analyses protéomiques ont été réalisées au cellulaireéchelle de protéome, caractérisations protéomiques sur des compartiments subcellulaires se sont révélés être particulièrement instructifs 1. Ceci est bien illustré dans les études de HIV-1 infection. Exosomes, 30-100 vésicules membranaires nm sécrétées par une large gamme de types de cellules 2, 3, sont des composantes essentielles de la communication intercellulaire et de transport moléculaire. Ils ont déjà été découverts à jouer un rôle important dans le processus du VIH-1 en herbe 4, 5. En combinant l&#39; analyse protéomique dissection fonctionnelle, nous avons constaté que les exosomes libérés par le VIH-1 des cellules infectées sont constitués d&#39;une molécule de régulation unique et quantitativement différentes signatures de protéines et de ports qui ont un impact propriétés cellulaires sur des cellules réceptives, y compris l&#39; apoptose et la prolifération cellulaire 6 voisine. Les méthodes sont décrites dans ce protocole,à savoir SILAC (de marquage isotopique stable par les acides aminés dans une culture cellulaire) 7 caractérisation protéomiques à base d&#39;exosomes à partir du VIH-1 des cellules infectées. Des approches similaires peuvent être appliquées à mieux comprendre les autres compartiments intracellulaires pendant la pathogenèse en ajustant le stress expérimental au compartiment ou une fraction d&#39;intérêt spécifique et apporter les changements nécessaires aux procédures décrites. Compte tenu de l&#39;évolution récente des méthodes protéomiques quantitatives, il y a beaucoup de choix lors de la sélection de la méthode la plus efficace pour une expérience particulière. Parmi ceux - ci sont la iTRAQ base chimique (étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) 8 et le sans étiquette MRM (surveillance de réaction multiple) 9 techniques. Les deux méthodes sont des outils puissants et sont de bons choix pour les réglages spécifiques. Un laboratoire typique travaillant principalement avec des lignées cellulaires, cependant, ces deux méthodes ont relatively des coûts plus élevés et sont plus de temps par rapport à la méthode basée sur SILAC. SILAC est une technique de marquage métabolique à base qui intègre les formes isotopiques non radioactifs d&#39;acides aminés à partir du milieu de culture dans les protéines cellulaires. Typiquement, les expériences SILAC commencent avec deux populations de cellules, par exemple, infectées et non infectées. Chacun est marqué de manière différentielle dans son environnement isotopique spécifique jusqu&#39;à l&#39;étiquetage complet est atteint. Les exosomes marqués de ces cellules sont ensuite soumises à une extraction des protéines. Une fois extraites, les protéines exosomales marquées sont analysées par chromatographie en phase liquide tandem spectroscopie de masse 10. Enfin, les résultats de spectrométrie de masse et les protéines marquées de façon significative sont soumis à des statistiques et bioinformatique analyses ainsi que la vérification biochimique rigoureuse. Nos rapports d&#39;enquête précédents suggèrent que les procédures SILAC / exosomes sont plus appropriés pour les lignées cellulaires que les cellules primaires, comme les lignées cellulaires sont habituellement dans unétat de prolifération active efficace étiquetage isotopique,

<table><tbody><tr><td>Lignée cellulaire H9</td><td>ATCC</td><td>HTB-176</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>MTT kit de dosage</td><td>Thermo Fisher</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal dialysé (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>SILAC Protein Quantitation Kit &ndash ; RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher</td><td>89982</td><td>DMEM version (89983)</td></tr><tr><td>L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 pour SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88434</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine-2HCl, 13C6 pour SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88431</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>2480</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA</td><td>kit PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée super-rapide</td><td>Eppendorf</td><td>22628045</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse réfrigérée</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td>Devrait pouvoir atteindre 100 000 x g</td></tr><tr><td>50 mL Tubes de centrifugation coniques</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>tampon RIPA</td><td>Thermo Fisher</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Cocktails inhibiteurs de protéase</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp ; 78430</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixeur&nbsp ;</td>Kit de dosage des <td></td> protéines <td>Eppendorf</td> 5384000020 <td></td></tr><tr><td>BCA&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Biorad</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>SDS PAGE Appareil à gel</td><td>Thermo Fisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex 4-20 % Tris-Glycine Mini Gels</td><td>Novex</td><td>XV04200PK20</td><td></td></tr><tr><td>Gel réactif de coloration</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Séquençage Grade Trypsine</td><td>modifiée Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur SpeedVac</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps contre l’annexine humaine A5</td><td>Abcam</td><td>ab14196</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps contre la chaîne B de lactate déshydrogénase humaine</td><td>Abcam</td><td>ab53292</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel graphique et statistique Système</td><td>&nbsp ;</td><td>Complot Sigma&nbsp ;</td><td>ou GraphPad prism</td></tr><tr><td>Suite logicielle de protéomique quantitative</td><td>Institut Max Planck de biochimie</td><td>Maxquant&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Logiciels et bases de données</td><td>Divers fournisseurs</td><td></td><td>Reportez-vous au texte principal pour plus de détails</td></tr></tbody></table>

silac based protéomique caractérisation des exosomes du vih-1 des cellules infectées

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

La protéomique est l’analyse à grande échelle des protéines. Les techniques protéomiques, telles que la spectroscopie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS), peuvent caractériser des milliers de protéines à la fois. Ces techniques puissantes nous permettent d’avoir une compréhension systémique des changements cellulaires, en particulier lorsque les cellules sont soumises à divers stimuli, tels que des infections, des stress et des conditions de test spécifiques. Même avec les développements récents, l’analyse du protéome exosomal prend du temps et implique souvent des méthodologies complexes. De plus, le grand ensemble de données qui en résulte nécessite souvent une analyse robuste et rationalisée afin que les chercheurs puissent effectuer d’autres études en aval. Ici, nous décrivons un protocole basé sur SILAC pour caractériser le protéome exosomal lorsque les cellules sont infectées par le VIH-1. La méthode est basée sur le marquage isotopique simple, l’isolement des exosomes à partir de cellules marquées différentiellement et l’analyse par spectrométrie de masse. S’ensuit une exploration détaillée des données et une analyse bio-informatique des résultats protéomiques. Les ensembles de données et les candidats qui en résultent sont faciles à comprendre et offrent souvent une mine d’informations utiles pour l’analyse en aval. Ce protocole s’applique à d’autres compartiments subcellulaires et à un large éventail de conditions d’essai.

La figure 1A est un organigramme décrivant la procédure d'étiquetage SILAC 21. Afin de purifier les exosomes, les échantillons doivent être décélérée par centrifugeuse. Figure 1B montre les étapes de purification d'exosomes par ultracentrifugation série 21. Une fois purifiés, les exosomes sont soumis à des analyses protéomiques expérimental tel que décrit dans la procédure. <p class="jove_content" fo:ke...

Ici, nous décrivons une méthode de protéomique quantitative en utilisant la technique de marquage isotopique stable par les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) pour analyser les effets du VIH-1 infection sur protéomes exosomales hôte. Ce protocole peut être facilement adapté à des cellules sous différentes contraintes ou infection conditions.

SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

L’objectif global de cette procédure est de caractériser le protéome exosomal des cellules infectées par le VIH-1. Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de la biologie des exosomes, telle que l’effet des contraintes externes sur la composition du protéome des exosomes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être apprise même avec une expérience limitée en protéomique et en biologie des exosomes.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’infection par le VIH, elle peut également être appliquée à d’autres études sur des maladies telles que les infections bactériennes. La lignée cellulaire H9 est utilisée dans cette expérience, bien que diverses lignées cellulaires puissent être utilisées tant qu’elles sont en phase de prolifération active et qu’elles sont sensibles à la condition d’essai choisie. Ensemencez deux fois 10 à neuf cellules de sixième étape dans chacun des deux flacons de culture cellulaire.Cultivez une population dans 10 millilitres de milieu étiqueté contenant 10 % de FBS stylisé, 100 milligrammes par litre de L-lysine marquée en C13 et 100 milligrammes par litre de L-arginine marquée en C13 et N15. Cultivez l’autre population dans 10 millilitres de milieu non étiqueté avec 10 % de FBS stylisé, de L-lysine et de L-arginine. Cultivez les cellules pendant six doublements, après quoi les protéines des cellules du milieu marqué sont marquées à plus de 99 % avec des acides aminés lourds.Ajoutez un nouveau support ou changez-le à intervalles réguliers en fonction du type de cellule. À la fin du marquage, augmentez le volume de culture à 30 millilitres pour permettre la croissance de plus de cellules. Infectez les cellules marquées avec la souche NL4-3 du VIH-1 en utilisant un protocole d’infection standard du VIH-1.Ajoutez une quantité appropriée de virus aux cellules et incubez pendant 48 heures pendant que les cellules non marquées continuent de croître dans un milieu non marqué sans infection par le VIH-1. À la fin de l’infection par le VIH-1, les surnageants des deux populations cellulaires sont récoltés pour l’isolement des exosomes. Recueillir les surnageants des cultures dans des tubes coniques de 50 millilitres en évitant les cellules.Centrifugez pendant 10 minutes à 300 fois g et quatre degrés Celsius pour éliminer les cellules restantes. Collectez les surnageants dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez-les pendant 10 minutes à 2 000 fois g pour éliminer les cellules mortes. Transférez les surnageants résultants dans des tubes commerciaux compatibles avec les rotors capables de résister à l’ultracentrifugation.Assurez-vous d’équilibrer les tubes de l’ultracentrifugeuse. Centrifugez les tubes pendant 30 minutes à 10 000 fois g pour éliminer les débris cellulaires. Collectez les surnageants dans de nouveaux tubes d’ultracentrifugation.Centrifuger pendant 70 minutes à 100 000 fois g. Jeter le surnageant. Remettez en suspension chaque pastille riche en exosomes dans cinq millilitres de PBS frais et transférez la solution dans un tube d’ultracentrifugation frais.Centrifugez à nouveau pendant 70 minutes à 100 000 fois g. Après le dernier tour, défaussez le surnageant. Les granules cellulaires sont maintenant prêtes pour l’extraction des protéines.Pour commencer cette procédure, dissolvez chaque pastille exosomale isolée dans 100 à 200 microlitres de fer-pa-lai-ses et un tampon d’extraction avec des inhibiteurs de protéase ajoutés qui peuvent inhiber une gamme complète de protéases. Centrifugez les solutions dissoutes pendant 10 minutes à 13 000 fois g et quatre degrés Celsius. Transférez les surnageants éliminés dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre.Après avoir quantifié la concentration en protéines de chaque échantillon à l’aide d’essais standard, mélangez des quantités égales de protéines provenant d’échantillons marqués et non marqués. Appliquez le mélange égal sur un gel de quatre à 20 % de SDS-PAGE pendant 30 minutes. Teindre le gel avec du bleu Coomassie puis décolorer.À l’aide d’une lame de rasoir, coupez la bande d’échantillon du gel, puis coupez la bande de gel en 10 à 15 morceaux égaux. Mettez chaque morceau dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour un total de 10 à 15 tubes, et poursuivez la procédure d’extraction des protéines comme décrit dans le protocole de texte. Les procédures d’analyse des données protéomiques ne seront pas démontrées, mais sont résumées dans cet organigramme.Les protéines extraites sont d’abord analysées par chromatographie en phase liquide, spectroscopie de masse en tandem, et la qualité des données est évaluée. Ensuite, les données sont prétraitées en supprimant les protéines qui ont moins de deux peptides quantifiés. Les protéines significativement régulées à la hausse et à la baisse sont ensuite identifiées.Enfin, les répétitions des candidats significatifs sont comparées pour assurer la cohérence, et les données de toutes les répétitions sont fusionnées. Pour commencer la caractérisation des protéines identifiées, utilisez leurs numéros d’accession GenBank ou leurs identifiants UniProt pour effectuer des recherches dans les bases de données actuelles d’exosomes. ExoCarta sera utilisé dans cette démonstration.Cliquez sur requête et entrez le nom du gène ou de la protéine ou le numéro d’acquisition. Toute preuve dans les exosomes vérifie que les protéines candidates ont déjà été trouvées dans les exosomes et ajoute une couche de confiance que les candidats sont bien dans les exosomes. Ensuite, recherchez les candidats dans la base de données sur les interactions entre le VIH-1 et les protéines humaines.Sur l’entrée du nom de domaine de la protéine, entrez les noms ou les numéros d’accession du candidat, puis cliquez sur Rechercher. Les résultats de la recherche peuvent donner un aperçu des interactions entre le VIH-1 et les protéines candidates, et suggérer lesquels des candidats pourraient être véritablement associés au VIH-1. La troisième étape consiste à obtenir un aperçu global des candidats à l’aide d’une ontologie génétique ou d’un logiciel d’analyse GO tel que fun-brich.Sous Analyse d’enrichissement, cliquez sur Ajouter un ensemble de données et téléchargez les numéros d’accession GenBank ou les ID UniProt des candidats, puis sélectionnez le type de graphique pour visualiser l’analyse GO. Les résultats de l’analyse GO sont visualisés sous la forme de diagrammes circulaires qui fournissent des informations sur les protéines candidates dans les domaines du processus biologique, de la composante cellulaire et de la fonction moléculaire. L’étape suivante consiste à identifier les termes GO statistiquement surreprésentés à l’aide de l’analyse DAVID.Cliquez sur l’outil d’annotation fonctionnelle, entrez la liste des candidats et sélectionnez l’identificateur du gène, tel que UniProt ID.Sélectionnez la liste de gènes et effectuez une recherche. Une fois la recherche terminée, cliquez sur la page des résultats du résumé de l’annotation sous la catégorie ontologie génétique pour afficher les termes GO enrichis, les valeurs p et d’autres paramètres. Enfin, étudiez les interactions potentielles protéine-protéine et les voies biochimiques possibles à l’aide de la base de données STRING librement accessible.Entrez l’ID ou la séquence de la protéine dans la boîte de recherche désignée et sélectionnez l’espèce appropriée pour l’analyse. Cliquez sur rechercher. Les résultats fourniront des informations sur les associations directes et indirectes.Les 10 meilleures correspondances connues pour le candidat exosomal affiché dans les résultats doivent être prises en compte pour une sélection significative du candidat. Les résultats représentatifs d’une analyse DAVID d’un ensemble de 14 protéines sont présentés. L’enrichissement du processus biologique a indiqué que les processus liés à la mort cellulaire sont considérablement enrichis.L’enrichissement en composants cellulaires montre de nombreuses protéines d’origine intracellulaire, et l’enrichissement de la fonction moléculaire a identifié un rôle dans la liaison aux protéines pour la plupart des candidats. La chaîne B de la L-lactate déshydrogénase ou LDHB a été sélectionnée comme le candidat le plus significatif, et l’analyse STRING a identifié les 10 principaux partenaires d’interaction de la LDHB. La majorité des partenaires de la LDHB étaient également liés fonctionnellement et géographiquement aux exosomes dans le VIH-1.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer chaque étape à la bonne température et dans les bonnes conditions. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’isolement d’affinité peuvent être effectuées afin de confirmer les prédictions de l’analyse bioinformatique.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine exosomal pour explorer les modifications du protéome exosomal associées aux infections par le VIH-1 en biologie. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les exosomes de la culture cellulaire, d’analyser leurs protéomes et d’étudier leur association avec le VIH. N’oubliez pas que le travail avec le VIH ou un autre agent infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure.

silac-based-proteomic-characterization-exosomes-from-hiv-1-infected

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Ce document démontre des méthodes pour l'isolement, la purification et la détection des exosomes, ainsi que des techniques d'analyse de leur contenu moléculaire. Ces méthodes sont adaptables pour l'isolement des deux exosomes milieux de culture cellulaire et les fluides biologiques, et peut-delà de l'analyse de contenu moléculaire également être utile dans les études fonctionnelles.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

Cet article décrit une méthode pour visualiser la formation d'une synapse enveloppe du VIH-1 induite par le verre virologique soutenu bicouches planaires par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie. La méthode peut également être combiné avec immunofluorescence pour détecter l'activation et la redistribution des molécules de signalisation qui se produisent pendant le VIH-1 induite par l'enveloppe formation de la synapse virologique.

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

Techniques pour disséquer les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de HIV-1 Nef dans exosomes sont décrits. Peptides courts spécifiques provenant de Nef et la transfection de protéines ont été exploités pour déterminer la structure, la fonction et les partenaires de liaison de la sécrétion Modification de la région de Nef. Ces procédures présentent un intérêt général dans de nombreuses études mécanistes.

Identification de Motifs Fonctionnelles et leurs PARTENAIRES DE LIAISON Peptide-basée sur

Expériences d'immunoprécipitation SILAC représentent un puissant moyen de découvrir de nouvelles interactions protéine: protéine. En permettant la quantification relative exacte de l'abondance de la protéine à la fois le contrôle et les échantillons de test, les interactions véritables peut être facilement distinguée de contaminants expérimentales, et les interactions de faible affinité préservée grâce à l'utilisation de conditions de tampon moins rigoureuses.

Identification des protéines d&#39;interaction partenaires dans les cellules de mammifères à l&#39;aide SILAC-immunoprécipitation quantitatives en protéomique

Des techniques décrivant une procédure de gradient pour séparer les exosomes des particules du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) sont décrites. Cette procédure a été utilisée pour isoler les exosomes des particules de VIH dans le plasma humain de personnes infectées par le VIH. Les exosomes isolés ont été analysés pour déterminer leur teneur en cytokines et en chimiokines.

Isolement des exosomes dans le plasma du VIH-1 individus positifs

des gouttelettes lipidiques sont des organelles importantes pour la replication de plusieurs agents pathogènes, y compris le virus de l'hépatite C (VHC). Nous décrivons un procédé pour isoler des gouttelettes lipidiques pour la spectrométrie de masse quantitative des protéines associées; il peut être utilisé dans une variété de conditions, telles que l'infection par le virus, le stress environnemental ou un traitement médicamenteux.

Isolation Lipid Droplet pour l&#39;analyse quantitative de spectrométrie de masse

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV+ T cellules isolées de macaques rhésus.

Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Ce protocole isole les vésicules extracellulaires (VE) loin des virions à haut rendement et à haut rendement en incorporant les précipitations EV, l'ultracentrifugation du gradient de densité et la capture des particules pour permettre un flux de travail rationalisé et une réduction du démarrage volumes, ce qui entraîne des préparations reproductibles pour une utilisation dans toutes les recherches sur les véhicules électriques.

Purification des préparations extracellulaires de vésicule à haut rendement loin du virus

Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que...

Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

Ici, nous présentons un protocole dans lequel les cellules individuelles sont surveillées pour les événements aigus et l’infection productive par le VIH-1 sur un dispositif nanofluidique. Les données d’imagerie définissent les interactions virus-récepteur hôte et la dynamique de la voie de signalisation. Il s’agit de la première méthode de culture et d’imagerie unicellulaires longitudinales nanofluidiques à haut débit pour étudier la cinétique de signalisation et les interactions moléculaires.

Caractérisation unicellulaire de l’afflux de calcium et de l’infection par le VIH-1 à l’aide d’une plateforme optofluidique multiparamètres

Nous décrivons ici certaines méthodes établies pour déterminer le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’activation de la réponse protéique dépliée (UPR), en mettant l’accent sur l’infection par le VIH-1. Cet article décrit également un ensemble de protocoles pour étudier l’effet du stress du RE/UPR sur la réplication du VIH-1 et l’infectiosité du virion.

Mesure du stress du réticulum endoplasmique et de la réponse protéique dépliée dans les lymphocytes T infectés par le VIH-1 et analyse de son rôle dans la réplication du VIH-1

Découvrez la protéomique SILAC pour caractériser les exosomes des cellules infectées par le VIH-1. Cette méthode quantifie les changements protéiques et s'applique à diverses conditions de stress ou d'infection.

SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées

Explorer plus de vidéos