Préparation de cultures mixtes gliales primaires de souris adultes Spinal Cord Tissue

Le développement de la douleur neuropathique implique des changements pathologiques des cellules gliales cordon de la colonne vertébrale. Un système de culture gliale fiable provenant d' un tissu de la moelle épinière adulte et conçu pour l' étude de ces cellules in vitro est absente. Par conséquent, nous montrons ici comment établir cultures primaires gliales mixtes de souris adultes tissu de la moelle épinière.

L’objectif global de ce protocole est d’établir des cultures gliales mixtes primaires à partir de moelles épinières de souris adultes pour des études in vitro. Cette méthode nous fournit un système in vitro pour étudier les rôles des cellules gliales dans les maladies neurologiques qui impliquent des changements pathologiques dans la moelle épinière, tels que la douleur neuropathique et la sclérose en plaques. Le principal avantage de cette technique est que les cultures gliales sont préparées à partir de la moelle épinière d’une souris adulte, ce qui permet d’obtenir un système qui reflète plus précisément les conditions in vivo.

La démonstration de la procédure sera assurée par Jennifer Malon, une technicienne de mon laboratoire. En travaillant dans une cagoule de culture tissulaire, transférez quatre moelles épinières de souris dans une boîte de Pétri de HBSS. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces pour couper chacune des moelles épinières en petits morceaux.

Ensuite, transférez les morceaux dans un tube conique de 50 millimètres contenant un mélange d’enzymes Papaïne DNAse. Évitez de transférer le HBSS dans le mélange d’enzymes, car cela pourrait entraîner une diminution des performances de l’enzyme. Il est crucial que les morceaux de tissu soient bien digérés pour obtenir une suspension unicellulaire.

Cependant, une digestion excessive entraînera une diminution du nombre de cellules viables. Chaque laboratoire doit effectuer des tests pilotes pour déterminer le temps exact de digestion en fonction de ce qui fonctionne le mieux pour ses cellules. Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure avec une secousse orbitale à 150 rotations par minute.

Après l’incubation, faites un vortex dans le tube, puis triturez vigoureusement le tissu à l’aide d’une pipette de cinq millilitres pour favoriser une dissociation supplémentaire. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pour 300 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant la centrifugation, à 300 microlitres de solution inhibitrice d’albumine ovomucoïde reconstituée à 2,7 millilitres d’ABSS dans un tube stérile et bien mélanger.

Ajoutez ensuite 150 microlitres de solution de DNAse. Après la centifugation, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans l’inhibiteur d’albumine ovomucoïde fraîchement préparé et la solution d’ADN nase. Bien vortex pour casser la pastille de cellule.

Ensuite, ajoutez trois millilitres de solution d’inhibiteur d’albumine ovomucoïde reconstituée, sans DNAse, à la suspension cellulaire. Centrifugez les cellules à 70 x g pendant six minutes à température ambiante. Après l’essorage, retirez le surnageant, qui contient des fragments de membrane, et conservez la pastille.

Pour éliminer la myéline des cellules dissociées de la moelle épinière, ajoutez d’abord huit millilitres de milieu à température ambiante de densité de 20 % dans le tube contenant la pastille cellulaire et agitez doucement le vortex. Ensuite, centrifugez les cellules à 800 x g pendant 30 minutes à température ambiante sans les casser. Après la centrifugation, aspirez soigneusement la couche supérieure de débris, qui contient principalement de la myéline et du surnageant, en laissant la pastille.

Pour éliminer tout gradient de densité restant, lavez les cellules en remettant la pastille en suspension avec huit millilitres de cDMEM dilué avec HBSS. Centrifugez les cellules à 400 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et lavez les cellules avec du cDMEM dilué comme auparavant.

Après avoir retiré le surnageant, la pastille peut être stockée sur de la glace jusqu’à l’ensemencement des cellules. Une fois prêtes pour le placage, remettre les cellules en suspension dans 14 millilitres de cDMEM, complété par du 2-Mercaptoéthanol. Et ajoutez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits dans une plaque à 12 puits.

Plaquez des puits supplémentaires qui peuvent être utilisés pour déterminer le nombre moyen de cellules par puits et le contenu microglial de la culture. Une fois les cellules plaquées, incubez les cellules à 35,9 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu le jour 1, c’est-à-dire le lendemain du placage.

Certaines cellules sont attachées à la plaque de culture, mais elles sont encore principalement rondes. Il y a aussi de nombreuses cellules flottantes et d’importants débris. Répétez le changement de milieu trois à quatre jours plus tard jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour le traitement entre les jours 12 et 14.

Des cellules gliales mixtes de six souris noires C57 adultes ont été cultivées à 37 degrés Celsius ou 35,9 degrés Celsius et analysées par cytométrie en flux. Comme vous pouvez le voir, il n’y a pas de différence évidente dans les populations cellulaires totales à ces températures. Ces graphiques représentatifs montrent les populations de microglies CD45 positives pour CD11b isolées des populations cellulaires totales précédemment présentées.

Cette figure démontre qu’une teneur microgliale plus élevée peut être obtenue lorsque des cellules gliales mixtes sont cultivées à 35,9 degrés Celsius, au lieu de 37 degrés Celsius. Des cultures gliales mixtes de la moelle épinière adulte ont été préparées à partir de souris C67 black six. Des images représentatives des cellules cultivées aux jours un, quatre, huit et 12 sont montrées.

Des images montrant le progrès typique de la culture, ainsi que démontrant l’importance des médias, changent dès le premier jour de l’établissement post-culturel. Une fois maîtrisée, la mise en place initiale de la culture cellulaire gliale mixte peut être terminée en quatre heures environ, si elle est effectuée correctement. Après l’établissement d’une culture gliale mixte, des cultures appauvries en microglie et des cultures enrichies en microglie peuvent être obtenues à partir de cette population mixte initiale.

Cependant, le rendement des cellules enrichies en microglie sera limité à moins qu’un grand nombre de moelles épinières ne soient utilisées pour établir des cultures. Cette technique a été initialement conçue pour étudier les rôles des cellules gliales dans le développement de la douleur neuropathique. Cependant, il peut être utilisé pour étudier d’autres maladies neurologiques qui impliquent des changements pathologiques dans la moelle épinière adulte.