Un procédé d'extraction Pigments de Squid Doryteuthis pealeii

L’objectif général de cette procédure est de décrire comment extraire les pigments situés dans les granules nanostructurés de calmars fraîchement disséqués, Doryteuthis pealeii chromatophores. Les céphalopodes sont des animaux marins complexes qui subissent des changements rapides et adaptatifs de la couleur de leur derme. et des changements adaptatifs à la couleur de leur derme.

Cependant, il y a encore beaucoup d’inconnues sur le fonctionnement de ces systèmes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle cible spécifiquement les granules nanostructurés de l’organe chromatophore. Cela permettra aux chercheurs d’élucider le mécanisme du changement de couleur à l’échelle nanométrique.

En plus de donner un aperçu de la biologie des céphalopodes, il peut éclairer la conception de systèmes synthétiques conçus pour imiter la gamme dynamique de couleurs adaptatives affichées chez les céphalopodes à l’aide de nanoparticules pigmentées préemballées. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode ont du mal car il est difficile de collecter du tissu chromatophore pur en raison de sa proximité avec le tissu environnant. Notre méthode est optimisée pour réduire ces contaminants.

Pour commencer la dissection, versez d’abord environ 250 millilitres d’eau de mer filtrée dans une casserole de dissection. Placez un spécimen dans la casserole et, à l’aide de ciseaux droits à pointe fine en acier inoxydable, coupez à partir de la base du manteau ventral le long de la face postérieure de l’animal, en terminant par la région de la nageoire. Retirez tous les organes internes en les soulevant doucement à l’aide d’une pince à dissection et en sectionnant le tissu conjonctif à l’aide des ciseaux.

Jetez les organes dans un sac à échantillons. À l’aide de goupilles en T de dissection, épinglez l’aileron du manteau vers le haut dans le tampon de dissection. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement la couche cutanée opaque de l’épiderme, en gardant intacte la couche cutanée contenant le chromatophore.

Jetez la couche épidermique dans un sac à échantillons. Ensuite, retirez la couche de chromatophore. Coupez le tissu chromatophore en petites sections d’un centimètre sur un centimètre.

Placez les sections dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre, en remplissant chaque tube à moitié avec du tissu disséqué. Enfin, ajoutez 500 microlitres d’eau de mer filtrée dans les tubes. Pour isoler les granules de pigment, centrifugez d’abord les coupes de tissu chromatophore pendant cinq minutes à 14 000 x g.

Jetez la couche supérieure d’eau de mer. Ajoutez 500 microlitres de solution de collagénase de papaïne aux échantillons et faites un tourbillon pendant une à deux minutes sur le réglage le plus élevé. Ensuite, sonicez les échantillons pendant cinq minutes à 40 kHz pour dissocier les cellules du tissu environnant.

Centrifugez pendant cinq minutes supplémentaires à 14 000 x g, puis jetez le surnageant. Répétez la centrifugation deux fois de plus, en jetant le surnageant à chaque fois. Ensuite, ajoutez la remise en suspension dans la collagénase.

Utilisez une pince pour retirer manuellement toutes les grandes sections de tissu restantes qui n’ont pas été digérées avant de continuer. La pureté de la solution granulaire de départ influence l’extraction du pigment. Il est donc important de s’assurer que les matériaux chromatophores de départ sont complètement digérés.

Nous constatons que des coupes de tissu d’environ un centimètre sont optimales pour recueillir la population la plus pure de granules. Préparez le tampon d’homogénéisation en prenant un tube à bouchon à vis de 150 millilitres et en ajoutant la quantité appropriée de HEPES, de chlorure de magnésium, d’aspartate de potassium et de dithiothréitol. Ajoutez un mini-comprimé commercial d’inhibiteur de protéase.

À l’aide d’un cylindre gradué, mesurez 100 ml d’eau déminéralisée et ajoutez-le dans le tube contenant les sels d’homogénéisation. Agitez le tube pour mélanger jusqu’à ce que la solution devienne claire. Centrifugez les échantillons de tissus, puis jetez le surnageant.

Ajoutez 500 microlitres de tampon d’homogénéisation dans chaque tube et vortex pendant 2 minutes pour bien mélanger. Sonicez les échantillons pendant 30 minutes à 40kHz. Et puis les centrifuger à nouveau.

Après avoir éliminé le surnageant, répétez l’addition d’homogénéisation, la sonication et la centrifugation deux à trois fois pour assurer une digestion complète du tissu extracellulaire. Enfin, le tube doit contenir un surnageant jaune clair et une pastille de couleur rouge constituée des granules de pigment isolés. Jetez le surnageant.

Tout d’abord, préparez le méthanol acide pour l’extraction dans une cuve d’échantillon en verre à bouchon à vis en ajoutant 5 ml de méthanol et 25 mcL d’acide chlorhydrique concentré. Agitez doucement la solution pour mélanger. Réservez un tube d’échantillon, ce sera le traitement final des granulés réagis.

Retirer le tampon d’homogénéisation d’un deuxième tube contenant des granulés. Ajoutez 500 mcL de la solution acide de méthanol dans les tubes restants et agitez pendant trois à quatre minutes. Sonicer les échantillons pendant 10 minutes à 40 kHz, puis centrifuger pendant cinq minutes à 14000 x g.

À l’aide d’une micropipette, recueillir le surnageant dans un flacon en verre à vis d’un dram. C’est le pigment, et il doit apparaître de couleur rouge foncé. Répétez les étapes d’ajout de méthanol acide, de sonication et de centrifugation quatre à cinq fois en recueillant le surnageant jusqu’à ce qu’aucune autre couleur ne soit extraite.

Le boulet incolore restant est constitué de granulés extraits par pigment. Pour préparer des échantillons de granules pour l’imagerie, centrifugez d’abord l’aliquote de granules n’ayant pas réagi et les granules extraits de pigment pendant cinq minutes à 14000 x g et jetez le surnageant, puis remettez chaque pastille en suspension dans 1 ml d’éthanol à 95 %. À l’aide d’une pipette de transfert, placez 2 à 3 gouttes de chaque suspension de granules sur un bout de MEB en aluminium séparé.

Placez les échantillons dans le dessiccateur pour qu’ils sèchent toute la nuit sous vide. Enduire les talons d’un revêtement d’or et de platine pendant 3 minutes pour obtenir un revêtement de 15 nanomètres. Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope électronique à balayage.

Ensuite, utilisez un spectrophotomètre pour collecter les profils d’absorbance des granules n’ayant pas réagi, des granules extraits et du pigment extrait. Prenez une mesure à blanc pour les échantillons de granules en ajoutant 1 ml d’eau déminéralisée dans une cuvette propre. Jetez le blanc dans un conteneur à déchets.

Ensuite, ajoutez la suspension contenant les granules de pigment n’ayant pas réagi dans la cuvette. Collecter les spectres d’absorption UV-vis pour l’échantillon de granules. Prenez une deuxième mesure à blanc pour le pigment extrait en utilisant 1 ml de méthanol acide et une cuvette propre.

Enfin, prenez le spectre absorbant UV du pigment, puis déterminez la longueur d’onde maximale de chaque échantillon. La microscopie électronique à balayage a révélé que le processus d’extraction des pigments réduit le diamètre moyen des granules. Avant l’extraction, les granulés ont un diamètre moyen de 527,3 nm.

Après la procédure de méthanol acide, cette taille diminue considérablement à environ 202,6 nm. Une réduction que l’on pense être due à l’extraction du pigment. Lors de l’ajout de méthanol acide, la couleur associée aux granules n’ayant pas réagi diminue également visiblement.

La confirmation de cette hypothèse a été obtenue par spectrophotométrie. Ce graphique montre un profil d’absorbance large pour les granules pré-extraits et un profil d’intensité tout aussi large mais plus faible pour les granules post-extraits. En revanche, le pigment soluble extrait présente un lambda max à environ 500 nm et un épaulement distinct à environ 380 nm.

Collectivement, ces données suggèrent l’extraction réussie de la couleur visible des granules. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre heures du début à la fin. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’enlever complètement le tissu qui contient des plaquettes de protéines réfléchissantes qui peuvent interférer avec l’extraction et l’analyse.

Le tissu épidermique peut également interférer avec les étapes d’homogénéisation et l’extraction des pigments. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la chromatographie sur couche mince et la spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour purifier davantage les pigments et caractériser leur composition. Ces étapes peuvent aider à élucider les contributions moléculaires à la coloration chez les céphalopodes.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les biologistes marins, les chimistes et les ingénieurs, notamment :Quelle est la composition des pigments utilisés lors du changement de couleur ? Et comment contribuent-ils à la fonction et à la structure des granules nanostructurés dans les organes chromatophores dermiques ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire le pigment d’un calmar fraîchement disséqué, doryteuthis pealeii chromatophores.