Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans C. elegans
14 novembre 2016
Génétiquement codés histone-miniSOG induit des mutations héréditaires du génome entier d'une manière dépendant de la lumière bleue. Cette méthode de mutagenèse est simple, rapide, exempt de produits chimiques toxiques, et bien adapté pour le dépistage génétique avant et l'intégration du transgène.
L’objectif global de ce protocole de mutagénèse est d’utiliser une configuration LED simple pour mutagéniser l’ADN génomique de C. elegans qui exprime des protéines génératrices d’oxygène réactives dépendantes de la lumière bleue. Les deux principaux avantages de cette technique sont un, le protocole de mutagénèse est très simple et ne nécessite pas de produits chimiques toxiques. Et deuxièmement, le générateur de mutagénèse prouve après une longue mutation.
J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode, et je me rends compte que les protéines génératrices de ROS n’ont jamais été utilisées pour induire des mutations héréditaires. Pour cette expérience, connectez le contrôleur de l’appareil d’éclairage LED à un générateur de fonctions numériques à l’aide d’un câble BNC. À l’aide d’un support personnalisé, fixez les lumières LED à 10 centimètres au-dessus de la scène.
Maintenant, couvrez partiellement l’installation pour limiter l’exposition de la lumière bleue à l’environnement, mais pas au point que la chaleur s’accumule sur la scène. Une couverture en plastique dur sur mesure avec un haut et un bas ouverts est utilisée ici. Pendant le fonctionnement de la LED, portez toujours des lunettes de protection laser ou des lunettes de soleil, car la lumière est très brillante.
Maintenant, basculez le levier du contrôleur LED sur interne et réglez-le à 65 % de sa puissance maximale. À l’aide d’un photomètre, ajustez la puissance de la lumière si nécessaire, de sorte que sur la scène, elle soit de 2,0 milliwatts par millimètre carré pendant un éclairage continu. Pour ce protocole, maintenez la souche sensible à la lumière dans l’obscurité dans des conditions standard.
L’exposition inutile à la lumière doit être évitée, mais l’utilisation régulière d’une lampe halogène pour le passage n’entraîne pas de mutations. Parce que la mutation accidentelle est une préoccupation, congelez les aliquotes de la souche lorsqu’elles sont obtenues pour la première fois. Pour la mutagénèse, préparez un papier filtre pour s’adapter à une plaque de 60 millimètres avec un trou carré d’environ 25 millimètres au centre, et placez-le sur une plaque non ensemencée.
Ensuite, répartissez uniformément 100 microlitres de chlorure de cuivre de 100 millimolaires sur le papier filtre pour empêcher les vers de quitter le trou carré. Maintenant, à partir d’une assiette de vers, qui sont environ 12 heures après leur stade L4, choisissez les jeunes hermaphrodites adultes gravides et placez-les dans le carré central de l’assiette. Ensuite, allumez la LED et le générateur de fonctions.
Ensuite, basculez le contrôleur LED sur externe pour le contrôler avec le générateur de fonctions et réglez la puissance de manière appropriée. À partir du générateur de fonctions, produisez une onde sinusoïdale à 4 hertz. Maintenant, transférez la plaque sur la scène et illuminez les vers avec une lumière bleue pendant 30 minutes.
Immédiatement après le traitement, transférez tous les vers d’apparence saine dans une assiette ensemencée. Ces vers apparaîtront non coordonnés après le traitement à la lumière, mais ils se rétabliront. Gardez les vers traités à la lumière dans l’obscurité.
Plus tard, vérifiez la présence de morphologies ou de comportements anormaux chez la descendance F2 adulte. Un criblage génétique avancé a été réalisé à l’aide de la technique décrite pour 60 plaques F1, correspondant à 120 génomes haploïdes mutagénisés. Huit des 60 plaques F1 avec des vers F2 présentaient des phénotypes visibles, tels que la forme du corps trapue, le mouvement non coordonné ou la létalité des adultes.
La descendance de ces vers F2 a conservé ces phénotypes observables. Le nombre de mutants visibles sur ce crible suggère que la souche et la configuration fonctionnent correctement pour la mutagenèse optogénétique. La procédure de mutagénèse peut être effectuée en une heure.
S’il vous plaît profitez de la méthode de mutagénèse rapide et sûre.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole de mutagenèse utilisant une histone-miniSOG codée génétiquement afin d'induire des mutations héréditaires au niveau du génome entier de manière dépendante de la lumière bleue. La méthode est simple, rapide et sans produits chimiques toxiques, ce qui la rend idéale pour le criblage génétique direct et l'intégration de transgènes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Génétique
- Neurosciences
- Mutagénèse
Contexte
- Des protéines codées génétiquement peuvent produire des espèces réactives de l'oxygène (ROS).
- Les méthodes antérieures d'induction de mutations impliquaient souvent des produits chimiques toxiques.
- Cette étude explore une nouvelle approche de la mutagénèse héréditaire.
- C. elegans sert d'organisme modèle pour ce protocole.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole simple de mutagenèse utilisant la lumière bleue.
- Démontrer l'efficacité des protéines génératrices d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour induire des mutations.
- Faciliter le criblage génétique direct et l'intégration de transgènes.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un dispositif LED simple pour la mutagénèse.
- Branchement de l'éclairage LED à un générateur de fonctions numérique.
- Fixation des lampes LED au-dessus de la platine à l'aide d'un support personnalisé.
- Observation des effets de la mutagénèse chez C. elegans.
Résultats principaux
- Induction réussie de mutations héréditaires au niveau du génome entier.
- Démonstration d'une méthode de mutagenèse non toxique.
- Validation de la technique pour le criblage génétique direct.
- Potentiel d'intégration de transgènes à l'aide de cette méthode.
Conclusions
- Le protocole offre une approche simple et efficace de la mutagénèse.
- La mutagénèse dépendante de la lumière bleue est une technique prometteuse pour les études génétiques.
- Cette méthode peut faire progresser la recherche en génétique et en biologie moléculaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La mutagenèse aléatoire optogénétique utilisant l'histone-miniSOG chez C. elegans permet une modification rapide et héréditaire du génome sans produits chimiques dangereux, simplifiant ainsi les flux de travail de découverte précoce. Cette approche facilite le criblage génétique à haut débit et l'intégration de transgènes, réduit les obstacles opérationnels et améliore la flexibilité du portefeuille. Sa sécurité et sa simplicité en font un outil évolutif pour la génomique fonctionnelle et la validation de cibles en recherche préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'interrogation systématique de la fonction des gènes par criblage génétique direct.
- Facilite l'identification de voies nouvelles et de modificateurs génétiques pertinents pour les modèles de maladies.
- Prend en charge la réduction des risques biologiques en générant des variants alléliques diversifiés pour des études mécanistiques.
- Améliore la confiance prédictive dans le choix des cibles en permettant une mutagenèse sans biais.
Développement de tests et criblage
- Offre un système validé et reproductible pour la génération de bibliothèques de mutants chez C. elegans.
- Élimine les risques chimiques, simplifiant ainsi la normalisation des tests et la conformité en laboratoire.
- Permet une préparation rapide de populations génétiquement diverses destinées à des criblages phénotypiques en aval.
- Prend en charge des protocoles évolutifs, prêts à être intégrés dans une plateforme, pour l'évaluation de composés et l'étude des interactions génétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur le développement de modèles pertinents pour les maladies en permettant la mutagenèse ciblée et l'intégration de transgènes.
- Facilite la continuité entre la découverte génétique et la validation préclinique chez les organismes modèles.
- Permet une progression adaptée aux risques en fournissant des outils génétiques robustes pour l'atténuation mécanistique des risques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode de mutagenèse optogénétique s'intègre aux stades précoces de découverte et de validation de cibles, soutenant l'identification de composés d'intérêt et le développement de modèles précliniques.
- Découverte en biologie : Accélère le test d'hypothèses et l'élucidation des voies biologiques grâce à une mutagenèse sans biais.
- Criblage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour la sélection de mutants et l'analyse phénotypique.
- Analytique : Permet la comparaison statistique des phénotypes des mutants et de l'efficacité d'intégration des transgènes.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la découverte génétique et l'optimisation de modèles précliniques chez C. elegans.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable et non toxique pour le criblage génétique continu et le développement d'outils.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive et la validation des cibles en permettant une mutagenèse étendue sans interférents chimiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la sécurité en laboratoire, la standardisation et le débit en éliminant les réactifs dangereux.
- Valeur stratégique : Facilite des décisions efficaces de poursuite ou d'abandon et réduit les risques biologiques en phase avancée grâce à des outils génétiques robustes.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque et une avancée flexible des programmes de découverte génétique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique de C. elegans et en configuration de systèmes optogénétiques.
- Requiert une infrastructure d'éclairage par LED et des protocoles de sécurité de laboratoire de base pour l'exposition à la lumière.
- Exige une standardisation interéquipes pour assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Adaptable à d'autres systèmes modèles dotés de constructions optogénétiques compatibles.
- Dépend d'une manipulation soigneuse afin d'éviter des mutations induites par la lumière non intentionnelles.
