Name: Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Découvrez l'analyse par éléments finis pour modéliser la biomécanique de la mâchoire du zebrafish. Cette méthode simule l'environnement mécanique et aide à comprendre le développement squelettique.

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LHB a été financée par le programme Cell PhD Wellcome Trust dynamique; KAR a été financé par la MRC subvention de projet MR / L002566 / 1 (attribué à EJR et CLH) et CLH a été financée par Aruk subvention 19479. Nous tenons également à remercier l&#39;établissement Wolfson Bioimaging pour obtenir des conseils d&#39;imagerie.

Toutes les étapes du protocole suivent l&#39;Université du soin des animaux de Bristol et les lignes directrices de bien-être et ceux de la Home Office du Royaume-Uni. 1. Visualisation de l&#39;appareil locomoteur Anatomie NOTE: Pour visualiser la forme des éléments du squelette, de quantifier le muscle et d&#39;identifier l&#39;emplacement exact des attaches musculaires, immunocoloration (section 1.1) du poisson à l&#39;âge approprié pour la myosine squelettique (qui révèle le muscle) et collagène de type II (pour visualiser cartilage). Vous pouvez également visualiser l&#39;anatomie musculo - squelettique en utilisant des lignes de rapporteurs fluorescents transgéniques tels que le collagène a1 reporter COL2A1: mCherry 13,14 pour visualiser le cartilage et la lente chaîne lourde de myosine reporter smyhc: GFP 15 pour visualiser la position des attaches musculaires (section 1.2). lignes alternatives qui marquent le cartilage et les muscles peuvent fonctionner aussi bien. <ol><li> fluorescent Immunostaining <ol><li> Fixer les larves au-delà de 4% de paraformaldehyde (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) pendant 1 heure. Laver dans du PBS avec 0,1% de Tween 20 (PBT) et déshydrater dans 50% de methanol (MeOH) dans du PBT et 100% de methanol pendant 5 min, respectivement. Attention: PFA est toxique et doit être traité conformément à la fiche de sécurité matérielle. REMARQUE: Larve peut être stocké dans 100% de methanol jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Réhydrater larve dans 50% de MeOH dans du PBT pendant 5 min. Laver à PBT pendant 5 min. </li><li> Perméabiliser larve dans 0,25% de trypsine dans PBT sur la glace pendant 5-6 min. Laver à 4x PBT pendant 5 minutes chacun. </li><li> Bloquer pendant 2-3 heures dans le sérum de 5% en PBT. </li><li> Incuber les larves dans la dilution recommandée d&#39;anticorps anti-lapin de type 2 du collagène et des anticorps anti-myosine souris dans 5% de sérum dans du PBT pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. NOTE: La gamme de dilution recommandée est normalement sur la feuille de données d&#39;anticorps. Choisissez des anticorps qui sont élevés contre les espèces différentes les unes aux autres et qui sont également diffélouer au tissu. </li><li> Laver 6x larva pendant 15 minutes en PBT. </li><li> Bloquer pendant 1-2 heures dans le sérum de 5% en PBT. </li><li> Incuber dans les anticorps secondaires dans l&#39;obscurité. Utiliser anti-souris marqué par fluorescence (550) et anti-lapin (488) des anticorps secondaires à une dilution appropriée dans 5% de sérum et PBT pour l&#39;anticorps spécifique. </li><li> Laver 6X pendant 10 minutes chacun en PBT et de l&#39;image sur un microscope confocal 10X le plus tôt possible. </li></ol></li><li> Imagerie musculosquelettique Géométrie <ol><li> Monter les larves ventral sur une lamelle en tiède 0,3-0,5% à faible point de fusion (LMP) agarose dans une solution de Danieau 16. NOTE: Les poissons transgéniques devront être sous sédation dans 0,02% MS222 (Tricaine méthanesulfonate, pH 7) avant le montage et lors de l&#39;imagerie. </li><li> Prenez une pile d&#39;image confocale de la région d&#39;intérêt en utilisant le 10X objectif et le zoom numérique 2.5X environ. Préparer des images du canal vert et rouge en utilisant 488 nm et 561 nm lasers respectivement. L&#39;image à une résolution de pixels de 512 x 512 avec un intervalle entre z plans de 1,3 pm et 3 moyennes de lignes. La pile résultante comprendra environ 100 z tranches. </li><li> Exporter les données comme une série de tiff. Des projections maximales des éléments musculaires et du cartilage à partir d&#39; une larve de poisson zèbre 5dpf sont représentés sur la figure 1. </li></ol></li></ol> 2. Création d&#39;une surface 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Choisissez un ensemble de données représentant pour chaque point de temps à 3, 4 et 5 dpf (choisir après la visualisation de plusieurs échantillons). </li><li> Ouvrez pile tiff 3 dimensions et sélectionnez tous les canaux dans le logiciel d&#39;analyse. Faites un clic droit sur le canal du cartilage et sélectionnez le filtre d&#39;image et de lissage: gaussien (figure 2B). </li><li> En vue du projet clic droit sur l&#39;image filtrée et sélectionnez «segmentation d&#39;image», puis «modifier nouvelle étiquette. Créer une nouvelle étiquette pour chaque matériau, à savoir, le cartilage et joint. Sélectionnez la région du cartilage de l&#39;image (figure 2C, le signal blanc, contour violet) en utilisant l&#39;outil de baguette magique. Utilisez l&#39;outil de brosse pour éliminer le bruit des contours. NOTE: Si vous utilisez l&#39;outil de baguette magique, cliquez sur &quot;Tous les tranches». </li><li> Sélectionnez la région conjointe avec l&#39;outil pinceau et affecter à un élément d&#39; articulation (figure 2C, contour bleu) </li><li> plusieurs tranches lisses à la fois en sélectionnant la segmentation dans le menu supérieur et les étiquettes lisses. Faites un clic droit sur l&#39;image et sélectionnez générer surface pour produire de rendre une surface 3D du composant (figure 2D). </li><li> Cliquez sur la surface et enregistrer des données sous forme de fichier hmascii pour l&#39;importation dans le logiciel de maillage. </li></ol> 3. Calcul des Forces musculaires à être utilisé dans le modèle FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Comptez le nombre de fibres musculaires à partir d&#39; images confocale de smyhc: zebrafish transgénique GFP (Figure 1A, Arrowhead, 1C) et mesurer le diamètreeter des fibres pour calculer leur zone de section transversale (2 πr). </li><li> Identifier force appropriée par muscle unité de surface de la littérature. La force musculaire maximale générée par unité de surface pour les muscles squelettiques (40 larves de poisson zèbre nN / um 2) ont été utilisés 17. </li><li> Calculer les forces pour chaque groupe musculaire anatomique en multipliant le nombre de fibres et de leur région par la force par unité de surface. Voir le tableau 1. </li></ol> 4. Génération d&#39;un maillage <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importez le modèle 3D généré dans la section 2 (ci-dessus) dans un logiciel capable de générer un maillage d&#39;éléments finis. </li><li> Générer A2D mailles du cartilage et des surfaces articulaires en utilisant l&#39;outil de pellicule rétractable dans le menu 2D. Choisissez une taille de l&#39;élément approprié. Remarque: Utilisez une taille de l&#39;élément entre 1,5-2,5. Si nécessaire, générer une gamme de surface 2D de taille différente maillages pour réaliser l&#39;optimisation du maillage 3D (section 4.4). </li><li> Effectuer des contrôles de qualité de maillage trouvés sous les «2D&gt; Outils&gt; Vérifier éléments de panneau pour vérifier les éléments dupliqués, des insertions et des pénétrations dans le maillage. Fixer les angles dièdres en utilisant l&#39;onglet utilitaire dans l&#39;arbre du modèle. </li><li> Générer un maillage 3D des maillages surfaciques 2D de différentes taille de l&#39;élément à l&#39;aide du sous-panneau 3D&gt; Tetramesh. REMARQUE: Comparer les résultats des différentes tailles de mailles et sélectionnez le modèle FE avec la plus faible taille de maille qui converge après de nouvelles simulations et ne compromet pas la définition de la fonction. L&#39;exemple de la figure 3 contient 1,5 million d&#39; éléments tétraédriques de cartilages de la mâchoire inférieure et a une taille d&#39;élément 2D de 2,0. </li><li> Transformer le maillage donc le modèle de la mâchoire est à l&#39;échelle comme par pile confocale en utilisant la géométrie&gt; Distance panneau secondaire. REMARQUE: Vérifiez que le cartilage et les composants communs sont connectés dans le modèle par l&#39;exportation d&#39;un modèle fusionné ou en utilisant des liens. </li></ol> 5. Finite Element Model Construction <ol><li> En utilisant des éléments finis (FE) des logiciels commerciaux, créer un modèle FE. Utilisation du muscle 3D et cartilage marqué piles confocaux générées dans la section 1 comme un guide, d&#39;attribuer des noeuds qui correspondent à des points d&#39;attache des muscles. Créer un vecteur entre deux noeuds représentant l&#39;origine et l&#39; insertion de chaque muscle (figure 3). </li><li> Créer un collecteur de type &#39;histoire de charge pour appliquer une «charge de C&#39; pour chaque muscle. Précisez l&#39;ampleur en Newtons (calculé à l&#39; étape 3.3) et affecter le vecteur associé. La figure 3 montre les points de fixation pour la mandibule adductor (AM), protractor hyoïdien (PH) et intermandibularis (IM). NOTE: Pour les muscles de la mâchoire, la force contractile maximale est répartie entre l&#39;origine et l&#39;insertion de sorte que seulement 50% de chaque charge est appliquée à chaque site. </li><li> Affecter les propriétés du matériau isotrope élastiques appropriées tel que déterminé par la littérature. Le module de Young pour le cartilageet l&#39;interzone dans ce modèle était de 1,1 MPa et 0,25 MPa , respectivement , et le coefficient de Poisson était de 0,25 pour les deux 18,19. </li><li> Créer un collecteur de charge de type &#39;limite&#39; pour appliquer des contraintes initiales sur le modèle. Allez à l&#39;onglet Analyse&gt; Contraintes et dans le sous-panneau créer, choisir les noeuds sur le modèle que vous voulez restreindre. Sélectionnez les degrés de liberté (DOF) que de limiter le mouvement du modèle à la meilleure approximation de son aire de répartition naturelle du mouvement. NOTE: Le modèle de la figure 3 a été limitée dans tous les axes de mouvement (DOF: 1, 2, 3 représentent x, y et z, respectivement) au ceratohyal pour l&#39; ancrer dans l&#39; espace à un point médian dans le modèle et dans le l&#39; axe y et z au point où la palatoquadrate relie au reste du crâne du poisson zèbre (Figure 3, Tableau 1). Le modèle doit être limité dans les trois DOF ​​dans un seul nœud moins. </li><li> Créer une «étape de charge», pour chaque type de mouvement que vous souhaitez simulmangé (ie, ouverture, fermeture), sous le menu d&#39;analyse et sélectionnez toutes les charges pertinentes (faites à la section 5.2) et les contraintes (faite à la section 5.4) pour simuler ce mouvement. Sélectionnez &#39;Static&#39; dans le menu déroulant quand il apparaît. </li><li> modèle d&#39;exportation, y compris les mailles, les charges, les contraintes et les propriétés des matériaux dans un format de fichier approprié, dans ce cas, le format &quot;.inp&quot;. </li><li> Modèle de charge dans le logiciel d&#39;analyse par éléments finis. Créer et exécuter un travail pour le modèle en utilisant le module d&#39;emploi. </li><li> Analyser la sortie pour le stress, la tension, le déplacement, etc. trouvés dans les résultats onglet et le menu de visualisation (Figure 4 et 5). </li></ol> 6. Validation des Jaw Déformation / Déplacement Distances <ol><li> Sélectionnez 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mcherry) zebrafish transgénique. </li><li> Légèrement anesthésier les larves avec 0,02% MS222 jusqu&#39;à ce qu&#39;ils cessent de répondre au toucher, mais leurs cœurs sont toujours en fouettant. </li><li> Monterles larves latéralement (tout anesthésié) sur des lamelles dans tiède 1% d&#39;agarose LMP (composé dans une solution de Danieau). </li><li> Retirer l&#39;agarose à partir autour de la tête et de la mâchoire avec une pince. </li><li> Rincer la solution fraîche Danieau (sans MS222) sur la tête de la larve d&#39;enlever l&#39;anesthésie à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur jusqu&#39;à ce que les mouvements de la bouche normales reprennent. </li><li> Utilisez un logiciel de capture vidéo pour prendre champ clair des vidéos à haute vitesse de mouvements de la bouche. Prenez des films d&#39;environ une durée de minutes à la vitesse de trame la plus élevée, soit suffisante pour enregistrer plusieurs cycles d&#39;ouverture de la mâchoire. </li><li> Choisissez les cadres qui montrent la mâchoire ouverte à son déplacement maximal. Mesurer la distance entre l&#39;extrémité antérieure du cartilage de Meckel et la mâchoire supérieure (pointe de la plaque ethmoïde) en um. </li><li> Calculer le déplacement moyen de larves de poissons multiples. </li><li> Extraire des données de déplacement du modèle. Utilisez le déplacement moyen calculé 6.8 pour vérifier le comportement de déplacement modèle ( <strong&gt; Figure 4). Si le modèle dévie de prévu, l&#39;analyse de sensibilité de fonctionner en modifiant successivement les propriétés des matériaux et des charges musculaires. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler. Quelques données sur les figures 3-5 a été tiré à part de J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., La modélisation par éléments finis prédit des changements de forme conjointe et le comportement des cellules due à la perte de la souche musculaire dans le développement de la mâchoire, 3112-22. 2015, avec la permission de Elsevier 15.

Modèles d&#39;éléments finis ont été utilisés pour relier les zones d&#39;éléments squelettiques qui sont mis à rude épreuve avec ceux subissant la formation d&#39;os 10, ainsi que pour cartographier les zones sous contrainte pendant l&#39; ossification endochondrale et morphogenèse commune 8,12,21. D&#39; autres études ont également été en mesure d&#39;appliquer des modèles théoriques de croissance pour répliquer les modifications au cours du développement conjoint 11,12. Ici , nous montrons le protocole pour la construction de modèles FE pour un système relativement simple, la mâchoire zebrafish 20. Contrairement à d&#39; autres méthodes de collecte des images brutes pour les modèles FE, comme la tomodensitométrie 22, imagerie confocale des lignées transgéniques ou zebrafish immunocolorées permet de multiples tissus à étudier. Il peut, par conséquent, fournir des informations directes sur les points d&#39;attache des muscles par rapport au cartilage. Parmi les modèles vertébrés zebrafish sont particulièrement favorables à la manipulation génétique et pharmacologique. La génération de modèles FE pour le poisson zèbrecartilage crânio ouvre maintenant la possibilité de poursuivre l&#39;étude de l&#39;interaction entre la biomécanique et de la génétique dans la morphogenèse commune. Il y a un certain nombre d&#39;étapes critiques du processus de création d&#39;un modèle FE; la première est la génération d&#39;une représentation tridimensionnelle précise du système. Cela nécessite l&#39;imagerie à résolution suffisamment élevée pour définir clairement les limites. Notez que même avec des images haute résolution pour faire une bonne surface ne peut avoir pour lisser certaines régions. Une autre étape cruciale consiste à définir le placement correct de la charge et des contraintes correctes. Un modèle insuffisamment contraint échouera à résoudre et placement incorrect des charges provoque des mouvements anormaux. Une partie de traitement des données brutes (figure 2) est nécessaire en tant que surface générée à partir des données brutes serait difficile à engrener (figure 2B). Nous filtré les données en utilisant un filtre gaussien (figure 2C </strong&gt;) et nous avons effectué un certain lissage manuel des courbes pour produire un ensemble de lignes propres qui peuvent être convertis en une surface 3D. Trop lissage peut produire une surface &quot;fondu&quot; qui a perdu beaucoup de ses caractéristiques. Le choix de la taille de l&#39;élément correct est un processus itératif que le choix de trop petite taille de l&#39;élément crée un trop grand maillage qui est de calcul intensif. Toutefois, en choisissant une trop grande taille de l&#39;élément va produire un maillage qui ne parvient pas à récapituler la forme correcte de la structure. L&#39;exactitude maillage avait la plus petite taille de l&#39;élément qui a capturé la forme correcte de la mâchoire et convergés sur une solution correcte, vérifiée en utilisant le déplacement de la mâchoire. Il peut également être nécessaire de modifier les propriétés des matériaux ou des calculs de charge pour mieux émuler le bon déplacement de différents âges et les espèces ont des propriétés sensiblement différentes. Il est important de se rappeler qu&#39;il ya toujours des limites à un modèle hypothétique et unssumptions fait pour exécuter des modèles FE. Lorsque seule la modélisation ou un petit nombre d&#39;échantillons, il est essentiel de veiller à ce qu&#39;un échantillon représentatif est choisi comme il est probable que de petites variations entre les individus. Comme seule une partie des éléments de mâchoire et les muscles ont été inclus, le modèle est une version simplifiée du système musculo-squelettique crânio poisson zèbre. Par conséquent, les contraintes devaient être positionnées pour expliquer où les éléments de mâchoire modélisés devraient se connecter avec le reste du crâne et le modèle a été contraint artificiellement dans le centre de le fixer dans un «espace». Cette contrainte artificielle n&#39;a pas d&#39;incidence sur l&#39;interprétation tirée des modèles comme ceratohyal se n&#39;a pas été analysé. L&#39;inclusion de plus de la structure craniofaciale, en particulier les autres muscles de la mâchoire d&#39; ouverture tels que les sternohyals et son cartilage joint 23, aurait pu ajouter au modèle, mais les limites comprennent la capacité des plus grands modèles de fonctionner dans le logiciel Finite Element. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Une autre limitation est que nous n&#39;avons pas modélisé l&#39; insertion du ligament, bien que cela pourrait être réalisé par l&#39;insertion de ressorts 8. Une autre hypothèse faite dans cette affaire était que le modèle se comporterait de façon linéaire. Les amplitudes des tensions sur les modèles étaient comparables à ceux des modèles publiés et appliqués à des cellules in vitro 10,24, avec les souches étant au- dessous et au- dessus 3,500 -5,000 μɛ en dehors des points de contrainte et de fixation du muscle. Par conséquent, les souches dans les régions concernées du modèle ont été considérées dans une gamme acceptable pour un modèle linéaire. Cartilages ne se comporte pas tout à fait comme un matériau linéaire et a déjà été modélisé en tant que matériau poroélastique, ce qui a permis d&#39; analyser le comportement du fluide dans le modèle 25. Répandre les points d&#39;attache des muscles parmi un groupe de noeuds locaux distribuerait les forces de pointe et représentent plus précisément l&#39;insertion du muscle pour certains muscles. ent &quot;&gt; L&#39;utilisation de FE permet une évaluation des déformations et des contraintes agissant sur une structure. En tant que technique, il est fréquemment utilisé dans de nombreuses disciplines de sciences biologiques, y compris l&#39;orthopédie, la paléontologie et plus récemment la biologie du développement. Nous décrivons ici comment construire FEs pour le poisson zèbre mâchoire inférieure. dans l&#39;avenir, ces modèles pourrait être étendue à regarder l&#39;ensemble mâchoire, y compris le palais. Des techniques similaires peuvent être utilisées pour modéliser la biomécanique de la colonne vertébrale chez les poissons, ce qui à ce jour ont surtout été étudiés par des moyens cinématiques.

Finite Element (FE) la modélisation est une technique d&#39;ingénierie qui peut informatiquement calculer et cartographier l&#39;ampleur et la localisation des souches agissant sur une structure 1. Le modèle est constitué de la structure en 3D, représentée par un maillage de &quot;éléments finis&quot;, et le résultat de l&#39;analyse finale est régi par un certain nombre de facteurs, dont la structure et le nombre des éléments du maillage, l&#39;ampleur et la localisation de la mécanique les charges et les propriétés des matériaux. Les propriétés des matériaux décrivent certains aspects du comportement d&#39;un matériau dans un type donné de charge; Le module de Young (E) décrit l&#39;élasticité du matériau tandis que le coefficient de Poisson décrit la diminution proportionnelle de la largeur d&#39;un matériau à sa longueur lorsqu&#39;un échantillon est étiré. la modélisation FE peut être utilisé pour calculer une variété de variables, y compris le déplacement, le stress, la pression et la contrainte agissant sur le modèle en prenant en compte les données d&#39;entrée uniques sur la structure &#39;; Forme s, l&#39;emplacement et l&#39;ampleur des charges et les propriétés des matériaux spécifiques. La modélisation FE est largement utilisé dans l&#39; ingénierie 2 et de plus en plus pour des applications orthopédiques 3 et paléontologiques 4. Dans le développement des forces biomécaniques sont connus pour agir comme un stimulus dans de nombreuses cellules pour activer les réponses des cellules 5-8 et il est utile de prévoir deux positions relatives et des amplitudes des stimuli mécaniques à l&#39; intérieur le développement de systèmes d&#39;organes, cependant, actuellement de modélisation FE a été peu utilisé pour le développement du poisson zèbre. Deux cartilages et des os se sont avérés être des matières mécanosensibles. Par exemple, une compression in vitro a été trouvé pour activer les voies chondrogéniques, tandis que la tension a été démontré que nécessaire pour la formation d&#39;os neuf. FE analyse (FEA) a été exploitée pour modéliser les souches agissant sur des échantillons biologiques, y compris ceux qui agissent sur les éléments du squelette lors de l&#39;os formation 10. D&#39; autres applications de développement comprennent son utilisation pour prédire la forme d&#39;un joint après qu&#39;il a été exposé à des forces biomécaniques théoriques 11,12 et de montrer le modèle des souches présentes au cours de poussin genou morphogenèse joint 8. Ce protocole vise à partager l&#39;expérience de générer des surfaces en 3 dimensions, mailles et modèles d&#39;éléments finis à partir d&#39;images confocale en vue de comprendre la mécanique des tissus en développement. Nous montrons aussi des moyens de valider les modèles FE si la capture réelle information de déplacement conjoint in vivo. Alors que nous utilisons la mâchoire zebrafish en tant qu&#39;exemple les mêmes techniques peuvent être utilisées sur un petit système biologique pour lequel des informations sur la structure 3D du système musculo-squelettique peut être obtenu par imagerie confocale ou multiphotonique.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Anticorps anti-collagène de type II - colore tout le cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Études développementales banque d’hybridomes</td><td>A4.1025</td><td>Anticorps mysoin squelettique - marque tous les muscles squelettiques&nbsp ;</td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A9414-5G</td><td>Pour le montage du poisson-zèbre</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Pour faire un anesthésique</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>perméabilisation de l’échantillon</td></tr><tr><td>Dylight 488 IgG de souris</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Dylight 550 IgG de lapin</td><td>Thermofisher&nbsp ;</td><td>84541</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>SP8/SP5 ou SPE confocal</td><td>Leica&nbsp ;</td><td></td><td>Pour l’imagerie&nbsp ;</td></tr><tr><td>LAS Logiciel de capture Leica</td><td>Logiciel d’imagerie</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>Logiciel d’analyse d’images 3D</td> <td>FEI Visualization Science Group</td><td></td> (Section 2)</tr><tr><td>Hypermesh faisant partie du package Hyperworks (version 10)</td><td>Logiciel de génération de modèles Altair Engineering</td><td></td><td></td> FE (Section 4-5)</tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td>Logiciel d’analyse <td>SIMULIA</td><td></td><td>FE (Section 5.7 et 5.8)</td></tr></tbody></table>

construire des modèles éléments finis pour enquêter sur zebrafish jaw biomécanique

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

La morphogenèse squelettique se produit par des comportements cellulaires étroitement régulés au cours du développement ; de nombreux types de cellules modifient leur comportement en réponse à une contrainte mécanique. Les articulations squelettiques sont soumises à des charges mécaniques dynamiques. L’analyse par éléments finis (FEA) est une méthode de calcul, fréquemment utilisée en ingénierie, qui permet de prédire comment un matériau ou une structure réagira à une entrée mécanique. En divisant un système entier (dans ce cas, le squelette de la mâchoire du poisson zèbre) en un maillage d’éléments finis plus petits, l’analyse par éléments finis peut être utilisée pour calculer la réponse mécanique de la structure aux charges externes. Les résultats peuvent être visualisés de plusieurs façons, y compris sous la forme d’une « carte thermique » montrant la position des déformations principales maximales et minimales (une déformation principale positive indique une tension tandis qu’une déformation négative indique une compression). Le maximum et le minimum se réfèrent à la plus grande et à la plus petite souche). Ceux-ci peuvent être utilisés pour identifier les régions de la mâchoire et donc les cellules susceptibles d’être soumises à des charges de tension ou de compression particulièrement élevées lors du mouvement de la mâchoire et peuvent donc être utilisés pour identifier les relations entre la contrainte mécanique et le comportement des cellules. Ce protocole décrit les étapes de génération de modèles d’éléments finis à partir de données d’images confocales sur le système musculo-squelettique, en utilisant la mâchoire inférieure du poisson-zèbre comme exemple pratique. Le protocole guide le lecteur à travers une série d’étapes : 1) coloration des composants musculo-squelettiques, 2) imagerie des composants musculo-squelettiques, 3) construction d’une surface tridimensionnelle (3D), 4) génération d’un maillage d’éléments finis, 5) résolution de l’analyse par éléments finis et enfin 6) validation des résultats par comparaison avec les déplacements réels observés dans les mouvements de la mâchoire du poisson.

Immunocoloration pour le muscle (figure 1A) et le cartilage (figure 1B) ou l&#39; imagerie de reporters transgéniques (figure 1C) permet à la structure 3D de la mâchoire à visualiser, ainsi que la masse musculaire associée. En imagerie à haute résolution , il était possible de construire un modèle qui reflète à la fois la forme en trois dimensions de la mâchoire (Figure 2) et l&#39;emplacement et l&#39; emplacement des charges (Figure 3). Utilisant des déplacements in vivo vus à travers la capture vidéo haute vitesse (Figure 4) nous avons vérifié que l&#39;amplitude du mouvement dans le modèle était dans une fourchette réaliste. Les modèles FE une fois l&#39; exécution peuvent être utilisés pour afficher une série de données, tels que le stress (figure 5A), minimum et déformation principale maximale (figure 5B - K). Ces résultats sont trois dim<html> ensional de sorte que le modèle peut être agrandie pour voir des motifs fins de détail (Figure 5E, 5I) tourné pour obtenir des points de vue pertinents (Figure 5F, 5G, 5J, 5K) et numériquement sectionnés (Figure 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) pour montrer comment les modèles de contrainte, déformation ou changement de pression dans l&#39;ensemble du modèle. Il est également possible d&#39;extraire des données quantitatives à partir du modèle (non représenté). En vérifiant le modèle et en utilisant les propriétés des matériaux les plus précis, les charges les mailles et la forme du modèle FE peut être utilisé pour explorer la meilleure estimation de l&#39;environnement mécanique vécue par les cellules pendant cette fenêtre de développement. Les résultats du modèle peuvent être directement comparés aux changements dans le comportement cellulaire et l&#39; expression des gènes 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1:. Des images représentatives des éléments musculo - squelettiques de la mâchoire inférieure zebrafish à 5 dpf piles confocaux représentatifs de la mâchoire inférieure des larves 5dpf tous montré avec antérieure vers le haut (A) immunocoloration pour A4.1025 qui colore tout myosine squelettique (B) immunocoloration pour collagène de type II qui marque tout le cartilage (C) Stack à partir d&#39; une larve vivant exprimant les journalistes transgéniques COL2A1: GFP muscle lent (vert): cartilage (rouge) et smyhc marquage mCherry. IA: intermandibularis antérieure, PH: protractor hyoïdien, AM: adductor mandibulae, HI: hyoïdien inférieure, HI: hyoïdien supérieure, CH: sternohyoideus, MC: cartilage de Meckel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figure 2: Production d&#39;une surface 3D à partir de données d&#39; images confocale montrant le passage des données confocales dans une surface 3D de la mâchoire inférieure du poisson zèbre avec un plus fort grossissement de la région d&#39; articulation.. (A) de données confocale Raw; (B) du jeu de données après application d&#39;un filtre gaussien; (C) de contour Filtré; Surface (D) 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figure 3: maillages représentatifs montrant les contraintes et les vecteurs de force maillages représentatifs pour une larve de 5 dpf pour (A) la fermeture de la bouche et.(B) ouverture de la bouche. Les points blancs représentent les endroits où le modèle est contraint et dans lequel les dimensions (par exemple, x et y ou x, y et z). des lignes blanches indiquent les positions des muscles, avec le vecteur de la force musculaire représenté par des flèches blanches. Rouge montre cartilage et jaune l&#39;interzone. Ce chiffre a été modifié depuis le matériel supplémentaire précédemment publié dans Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figure 4:. Tests de sensibilité FE-modèle simulant la mâchoire déplacement dans zebrafish 5dpf pour le cartilage différent et des modules de Young interzones. Mâchoires déplacement (ouvert à fermé en um) est marqué sur la mâchoire; enregistré à l&#39;aide de la touche de couleur. Chaque modèle (A - L) a une combinaison différente de cartilage (c = 1,1, 3,1 ou 6,1 MPa) ou interzone (i = de 0,25, 0,5, 0,75, ou 1 MPa) propriétés. Horizontal flèche noire met en évidence la valeur de la mâchoire de déplacement à l&#39;extrémité du cartilage de Meckel (représenté par la flèche noire verticale). M et N images fixes à partir de vidéos 5 dpf larves montrant au minimum, à savoir, la mâchoire fermée (M) et maximum, à savoir, mâchoire complètement ouvert (N) avec les deux superposée (O) - ligne blanche sur O représente le déplacement (de 43 um). Dans ce cas , par rapport propriétés du cartilage de 1,1 avec une interzone de 0,25 (A) meilleur match les déplacements observés dans les poissons vivants (O). Panneaux AL de cette figure ont été publiées antérieurement dans Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand vers</a>ion de ce chiffre. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figure 5: Les données représentatives des modèles EF simulation FE-modèle de tous les muscles appliqués dans un 5 dpf larve (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) de déformation minimum principal (E min. P, μɛ) (C) déformation principale maximale (E max. P., μɛ). simulation FE-modèle de souches principales maximales et minimales lors de l&#39;ouverture de la mâchoire. (D - K): déformation principale maximale (. E Max P., μɛ) en (D) vue de la mâchoire ventral et (E) ventral vue commune (E) montre l&#39; emplacement des sections proximale-distale à travers le cartilage de Meckel articulaire et l&#39;interzone (E &#39;) et (E&#39;), respectivement. (F): latéralmâchoire vue. (G): vue latérale commune. (H - K): la souche principale minimale (. E Min P, μɛ) dans (H) vue de la mâchoire et ventrale (I) ventrale de vision commune. (I) montre l&#39; emplacement des sections proximale-distale à travers l&#39;articulation du cartilage de Meckel et interzones en (I &#39;) et (I&#39; &#39;) respectivement (J): vue latérale de la mâchoire. (K): vue latérale commune. Ce chiffre a été publié précédemment dans Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Nombre de fibres musculaires </td><td> Zone de fibres musculaires (pm 2) </td><td> zone de groupe musculaire (pm2) </td><td> Force de (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis antérieure </td><td> 5 </td><td> 23,8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf protractor hyoïdien </td><td> 6 </td><td> 23,8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf adductor mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23,8 </td><td> 214,2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Muscle quantification. Calculées forces musculaires moyennes pour la Intermandibularis Anterior, Adductor mandibule et Protractor hyoïdien à 5 dpf utilisant 40 nN / um 2 (valeur par unité de surface prise de la référence 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

L’analyse par éléments finis est un outil fréquemment utilisé pour étudier les performances mécaniques des structures sous charge. Ici, nous appliquons son utilisation à la modélisation de la biomécanique de la mâchoire du poisson-zèbre.

Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

L'objectif général de cette technique de modélisation est de simuler l'environnement mécanique subi par les mâchoires de poisson-zèbre en développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du système musculosquelettique, telles que : comment les schémas de charge mécanique évoluent-ils au fil du temps ? Et comment ces charges stimulent-elles le comportement cellulaire ?Le principal avantage de cette technique est qu'elle nous permet d'analyser les profils d'expression génique et les modifications du comportement cellulaire dans le contexte de l'environnement mécanique. Cette méthode peut fournir des informations sur le développement squelettique. Elle peut également être appliquée à toute autre structure biologique soumise à des charges mécaniques, comme les éléments squelettiques des vertébrés supérieurs ou le système cardiovasculaire.En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car la terminologie et les logiciels supposent des connaissances en ingénierie. Pour visualiser la forme des éléments squelettiques, quantifier le muscle et identifier l'emplacement exact des insertions musculaires, réalisez une immunomarquage du poisson à l'âge approprié pour la myosine squelettique et le collagène de type II. Tout d'abord, fixez une larve de poisson dans du paraformaldéhyde 4 % et du PBS pendant une heure.Ensuite, éliminer le fixateur par deux lavages au PBT. Puis, déshydrater la larve dans un mélange de 50 % de méthanol et de PBT pendant cinq minutes, suivis de 100 % de méthanol pendant cinq minutes. Les larves peuvent ensuite être conservées dans du méthanol à 100 % jusqu'à utilisation.Si nécessaire, réhydratez la larve dans du méthanol à 50 % et du PBT pendant cinq minutes. Ensuite, rincez-la dans du PBT pendant cinq minutes. Perméabilisez maintenant la larve avec 0,25 % de trypsine dans du PBT sur de la glace pendant cinq à six minutes.Ensuite, lavez-le dans du PBT pendant cinq minutes et répétez le lavage avec du PBT trois fois supplémentaires. Avant d'appliquer les anticorps, bloquez la larve pendant deux à trois heures dans un mélange contenant 5 % de sérum et du PBT. Incubez ensuite la larve dans la dilution recommandée des anticorps anti-collagène de type II de lapin et anti-myosine de souris, en présence de 5 % de sérum et de PBT.Réalisez cette incubation pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l'application des anticorps primaires, lavez la larve dans du PBT un total de six fois, pendant 15 minutes par lavage. Après les lavages au PBT, appliquez un blocage au sérum à 5 % dans du PBT pendant une à deux heures.Appliquez maintenant les anticorps secondaires, en conservant par la suite la préparation à l'abri de la lumière autant que possible. Utilisez des anticorps secondaires marqués au fluorochrome anti-souris et anti-lapin dans du sérum à 5 % et du PBT. Après l'application des anticorps secondaires, lavez la larve dans le PBT six fois pendant 10 minutes par lavage.Toute larve qui a été colorée comme décrit ou qui exprime des marqueurs fluorescents peut désormais être observée à l’aide d’un microscope confocal selon la procédure suivante. Acquérir une série d’images confocales de la région d’intérêt à l’aide de l’objectif 10x avec un zoom numérique d’environ 2,5x. Exciter les canaux vert et rouge à l’aide d’un laser de 488 nanomètres et d’un laser de 561 nanomètres.Ensuite, acquérez des images de 512 pixels de côté en utilisant un intervalle de plan z de 1,3 micromètre avec une moyenne sur trois lignes. Environ 100 sections en z rempliront la pile. Exportez les données sous forme d'une pile d'images TIFF.Ouvrez la pile d'images TIFF et visualisez tous les canaux dans le logiciel approprié. Cliquez avec le bouton droit sur le canal du cartilage, sélectionnez Orthoslice, puis créez. Ensuite, cliquez avec le bouton droit sur le canal du cartilage et sélectionnez Traitement d'image, Lissage et réduction du bruit, choisissez le filtre d'image, puis activez le lissage gaussien.Dans la vue du projet, cliquez avec le bouton droit sur l'image filtrée et sélectionnez la segmentation d'image, puis modifiez un nouveau libellé. Créez un nouveau libellé pour chaque matériau, comme le cartilage et l'articulation. Ensuite, sélectionnez la région du cartilage sur l'image à l'aide de l'outil baguette magique avec l'option « toutes les tranches » activée, puis utilisez l'outil pinceau pour éliminer le bruit sur les contours.Ensuite, sélectionnez la région articulaire à l’aide de l’outil pinceau, attribuez-la au composant articulaire et répétez l’action sur toute l’articulation. Pour lisser plusieurs coupes simultanément, sélectionnez Segmentation dans le menu supérieur, puis choisissez Lisser les étiquettes. Ensuite, pour produire une restitution en surface 3D du composant, cliquez avec le bouton droit sur l’image et sélectionnez Générer une surface.Maintenant, cliquez sur la surface rendue et enregistrez les données sous forme de fichier HMASCII pour le logiciel de maillage. La génération d'un maillage 3D est une étape cruciale dans la création d'un bon modèle. Vous devez trouver un compromis entre un maillage qui représente fidèlement la forme réelle de la structure que vous cherchez à modéliser, et l'inclusion de trop de détails qui pourraient introduire des éléments problématiques, tels que des éléments ayant un angle trop petit ou trop grand.Pour générer le maillage, importez le modèle 3D dans un logiciel approprié. Pour créer un maillage bidimensionnel des surfaces du cartilage et de l'articulation, utilisez l'outil enveloppe sous le menu 2D. Choisissez une taille d'élément comprise entre 1,5 et 2,5.Différentes mailles de surface de tailles variées peuvent être créées afin d'effectuer une optimisation de maillage 3D. Afin de garantir la continuité du maillage entre les surfaces de l'articulation et du cartilage, tous les éléments situés à la frontière doivent partager des nœuds communs. Pour y parvenir, supprimez la surface intérieure de l'articulation, laissant ainsi un tube creux.Utilisez la touche de fonction F2 pour accéder au raccourci du menu Supprimer les éléments. Sélectionnez les éléments à supprimer. Ajustez les nœuds limites afin qu'ils correspondent à la surface du cartilage.Utilisez une combinaison des touches de fonction F2, F3 et F6 pour supprimer, déplacer les nœuds et créer de nouveaux éléments, respectivement. Enfin, dupliquez la surface du cartilage au niveau de l'articulation à l'aide du menu organisateur de composants collecteur. Utilisez la touche de fonction F2 pour supprimer tous les éléments non articulaires.Ensuite, effectuez des vérifications de qualité en accédant au panneau Vérifier les éléments. Recherchez les éléments dupliqués, les insertions et les pénétrations dans le maillage. S'ils sont présents, modifiez-les à l'aide de l'onglet Outils.Vérifiez les angles diédriques à l’aide de l’onglet utilitaire disponible dans l’option de l’arborescence du modèle. Pour générer un maillage 3D à partir de maillages surfaciques 2D de tailles d’éléments différentes, utilisez l’outil Tetramesh. Comparez différentes tailles de maillage et sélectionnez le modèle EF ayant la plus petite taille de maillage qui converge après des simulations supplémentaires, sans compromettre la définition des caractéristiques.Ensuite, à l'aide de l'outil Distance, transformez le maillage de manière à ce que le modèle de mâchoire soit à l'échelle. Assurez-vous que les composants cartilagineux et articulaires sont connectés dans le modèle en exportant un modèle fusionné ou en utilisant des liaisons. Ensuite, appliquez des charges, des contraintes et des propriétés matérielles au modèle EF afin de simuler la fonction de la mâchoire.En utilisant les coupes confocales marquées comme guide, délimitez les muscles. Commencez par attribuer des nœuds correspondant aux points d'insertion musculaire. Ensuite, créez des vecteurs entre les nœuds représentant l'origine et l'insertion de chaque muscle.Une fois tous les muscles définis, créez un collecteur de charge d'historique et appliquez une charge C à chaque muscle. Spécifiez l'amplitude en newtons et attribuez le vecteur associé. Ensuite, attribuez des propriétés de matériau isotropes élastiques appropriées, telles que déterminées par la littérature.Ensuite, créez un collecteur de charges limites et appliquez des contraintes initiales au modèle. Sélectionnez les nœuds à contraindre et choisissez un facteur de degrés de liberté similaire à l'amplitude naturelle de mouvement du muscle défini par ces nœuds. Créez maintenant une étape de chargement pour chaque type de mouvement à simuler.Sous le menu d'analyse, sélectionnez toutes les charges et contraintes pertinentes afin de simuler le mouvement spécifié. Ensuite, sélectionnez « statique » dans le menu déroulant. Lorsque vous êtes prêt, exportez le modèle dans un format de fichier approprié, incluant le maillage, les charges, les contraintes et les propriétés des matériaux.Dans ce cas, le format INP est choisi. Ensuite, chargez le modèle dans le logiciel d'analyse par éléments finis. Créez et exécutez alors une tâche pour le modèle, puis analysez les résultats en termes de contrainte, de déformation, de déplacement, etc.Sélectionnez trois à six larves de poisson-zèbre transgéniques, et anesthésiez légèrement les larves avec du MS-222 à 0,02 % jusqu'à ce qu'elles cessent de réagir au toucher, mais que leur cœur continue de battre. Ensuite, montez les larves en position latérale sur des lamelles dans de l'agarose à point de fusion bas à 1 % tiède, dans une solution de Danieau. Puis, retirez soigneusement l'agarose autour de la tête et de la mâchoire à l'aide de pinces.Ensuite, à l’aide d’une pipette de Pasteur, rincer la tête de la larve avec une solution fraîche de Danieau pour éliminer l’anesthésique. Procéder jusqu’à ce que les mouvements normaux de la bouche reprennent. Maintenant, utiliser un logiciel d’acquisition vidéo pour enregistrer des vidéos en haute vitesse en fluorescence des mouvements de la bouche.Filmez au plus haut débit de trames pendant la durée nécessaire pour enregistrer plusieurs cycles d'ouverture de la mâchoire. Ensuite, analysez le déplacement maximal de la mâchoire. Choisissez les images où la mâchoire est ouverte au maximum et mesurez la distance entre l'extrémité antérieure du cartilage de Meckel et la mâchoire supérieure.Le point de la mâchoire supérieure correspond à l'extrémité de la plaque ethmoïdale. La coloration immunohistochimique des muscles et du cartilage, ou l'imagerie de marqueurs transgéniques, permet de visualiser la structure tridimensionnelle de la mâchoire ainsi que la musculature associée. En réalisant des images à haute résolution, il a été possible d'élaborer un modèle qui rend compte de la forme tridimensionnelle de la mâchoire.Le modèle intègre des charges dont le positionnement et l'amplitude ont été déduits des images confocales du muscle et du cartilage. À partir de ce modèle, différentes propriétés matérielles ont été testées. En utilisant le déplacement in vivo observé par enregistrement vidéo à haute vitesse, un modèle a été sélectionné car il reproduit au mieux cette amplitude de mouvement.En utilisant les propriétés des matériaux, les charges et les données de forme du maillage les plus précises, le modèle par éléments finis a permis d'explorer la meilleure estimation de l'environnement mécanique subi pendant cette période. Par exemple, les amplitudes des contraintes ont été mesurées. Le modèle peut être agrandi pour observer les détails fins du motif, puis examiné en sections numériques afin d'étudier le détail dans toutes les dimensions.Après avoir visionné cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la manière d'utiliser l'imagerie confocale pour construire un modèle 3D physiologiquement précis d'une structure biologique soumise à une contrainte mécanique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'il s'agit d'un modèle linéaire élastique, et que le cartilage ne se comporte pas entièrement comme un matériau linéaire. D'autres propriétés matérielles, telles que la perméabilité, peuvent être intégrées, mais pourraient nécessiter des modifications supplémentaires du maillage.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

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Décalage de pénétrance de Mutant squelettique létale Zebrafish Progeny test

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