Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique

L’objectif global de cette technique de modélisation est de simuler l’environnement mécanique vécu par le développement des mâchoires de poisson-zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine musculo-squelettique, telles que : comment les modèles de charge mécanique changent-ils au fil du temps ? Et comment ces charges stimulent-elles le comportement cellulaire.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’analyser les modèles d’expression des gènes et les modifications du comportement cellulaire dans le contexte de l’environnement mécanique. Cette méthode peut donner un aperçu du développement du squelette. Il peut également être appliqué à toute autre structure biologique qui subit une charge mécanique, comme les éléments squelettiques chez les vertébrés supérieurs ou le système cardiovasculaire.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés, car la terminologie et le logiciel supposent une formation en ingénierie. Pour visualiser la forme des éléments squelettiques, quantifier les muscles et identifier l’emplacement exact des attaches musculaires, immunocolorer le poisson à l’âge approprié pour la myosine squelettique et le collagène de type II. Tout d’abord, fixez une larve de poisson dans du paraformaldéhyde à 4 % et du PBS pendant une heure.

Ensuite, lavez le fixateur à l’aide de deux lavages PBT. Ensuite, déshydratez la larve dans du méthanol à 50 % et du PBT pendant cinq minutes, puis à 100 % de méthanol pendant cinq minutes. Les larves peuvent ensuite être stockées dans du méthanol à 100 % jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires.

Au besoin, réhydratez la larve dans du méthanol à 50 % et du PBT pendant cinq minutes. Ensuite, lavez-le au PBT pendant cinq minutes. Maintenant, perméabilisez la larve avec 0,25 % de trypsine et de PBT sur la glace pendant cinq à six minutes.

Ensuite, lavez-le au PBT pendant cinq minutes et répétez le lavage PBT trois fois de plus. Avant d’appliquer les anticorps, bloquez la larve pendant deux à trois heures dans du sérum à 5 % et du PBT. Ensuite, incubez la larve dans la dilution recommandée de collagène anti-type II de lapin et d’anticorps anti-myosine de souris avec 5 % de sérum et PBT.

Effectuez cette incubation pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir appliqué les anticorps primaires, laver la larve dans du PBT au total six fois pendant 15 minutes par lavage. Après les lavages PBT, appliquez un sérum à 5 % et un bloc PBT pendant une ou deux heures.

Maintenant, appliquez les anticorps secondaires, en gardant désormais la préparation dans l’obscurité autant que possible. Utilisez des anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin marqués par fluorescence dans 5 % de sérum et PBT. Après avoir appliqué les anticorps secondaires, laver la larve dans du PBT six fois pendant 10 minutes par lavage.

Toute larve qui est colorée comme décrit, ou qui exprime des étiquettes fluorescentes, peut maintenant être imagée à l’aide d’un microscope confocal comme suit. Prenez une pile d’images confocales de la région d’intérêt à l’aide de l’objectif 10x avec un zoom numérique d’environ 2,5x. Excité les canaux vert et rouge à l’aide d’un laser de 488 nanomètres et d’un laser de 561 nanomètres.

Ensuite, prenez des images de 512 pixels carrés en utilisant un intervalle de 1,3 micron avec trois moyennes linéaires. Environ 100 sections z rempliront la pile. Exportez les données sous forme de pile d’images TIFF.

Ouvrez la pile d’images TIFF et visualisez toutes les chaînes dans le logiciel approprié. Faites un clic droit sur le canal cartilagineux, sélectionnez orthoslice et créez. Ensuite, faites un clic droit sur le canal cartilagineux et sélectionnez Traitement d’image, Lissage et débruitage, sélectionnez le filtre d’image et basculez le lissage gaussien.

Dans la vue du projet, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image filtrée et sélectionnez Segmentation de l’image, puis modifiez la nouvelle étiquette. Créez une nouvelle étiquette pour chaque matériau, comme le cartilage et l’articulation. Ensuite, sélectionnez la région cartilagineuse de l’image à l’aide de l’outil baguette magique avec l’option Toutes les tranches activées, et utilisez l’outil pinceau pour supprimer le bruit des contours.

Ensuite, sélectionnez la région de l’articulation à l’aide de l’outil Pinceau, attribuez-la au composant de l’articulation et répétez l’action sur toute l’articulation. Pour lisser plusieurs tranches à la fois, sélectionnez Segmentation dans le menu supérieur, puis sélectionnez Lisser les étiquettes. Ensuite, pour produire un rendu de surface 3D du composant, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image et sélectionnez Générer la surface.

Maintenant, cliquez sur la surface rendue et enregistrez les données en tant que fichier HMASCII pour le maillage software. 3D la génération de maillage est une étape critique dans la génération d’un bon modèle. Vous devez faire un compromis entre un maillage qui représente la vraie forme de la structure que vous essayez de modéliser, sans inclure trop de détails pour ne pas introduire d’éléments problématiques, tels que ceux dont l’angle est trop petit ou trop grand.

Pour générer le maillage, importez le modèle 3D dans un progiciel compatible. Pour générer un maillage bidimensionnel des surfaces du cartilage et des articulations, utilisez l’outil d’emballage sous le menu 2D. Choisissez une taille d’élément comprise entre 1,5 et 2,5.

Une gamme de maillages de surface de différentes tailles peut être réalisée pour effectuer l’optimisation du maillage 3D. Afin de garantir que le maillage est continu entre les surfaces de l’articulation et du cartilage, tous les éléments situés à la frontière doivent partager des nœuds communs. Pour ce faire, retirez la surface intérieure du joint en laissant un tube creux.

Utilisez la touche de fonction F2 pour accéder au raccourci vers le menu Supprimer des éléments. Sélectionnez les éléments à supprimer. Ajustez les nœuds limites pour qu’ils correspondent à la surface du cartilage.

Utilisez une combinaison de touches de fonction F2, F3 et F6 pour supprimer, déplacer des nœuds et créer de nouveaux éléments, respectivement. Enfin, dupliquez la surface du cartilage au niveau de l’articulation à l’aide du menu d’organisation des composants du collecteur. Utilisez la touche de fonction F2 pour supprimer tous les éléments non liés.

Ensuite, effectuez des contrôles de qualité en accédant au panneau Vérifier les éléments. Vérifiez qu’il n’y a pas d’éléments, d’insertions et de pénétrations dupliqués dans le maillage. S’ils sont trouvés, modifiez-les à l’aide de l’onglet Outils.

Vérifiez les angles dièdres à l’aide de l’onglet utilitaire situé dans l’option de l’arbre du modèle. Pour générer un maillage 3D à partir de maillages de surface 2D de différentes tailles d’éléments, utilisez l’outil Tetramesh. Comparez différentes tailles de maillage et sélectionnez le modèle EF avec la taille de maillage la plus basse qui converge après d’autres simulations et ne compromet pas la définition de la fonctionnalité.

Ensuite, à l’aide de l’outil Distance, transformez le maillage pour que le modèle de mâchoire soit à l’échelle. Assurez-vous que les composants du cartilage et de l’articulation sont connectés dans le modèle en exportant un modèle fusionné ou en utilisant des liens. Ensuite, appliquez des charges, des contraintes et des propriétés de matériau au modèle EF pour simuler la fonction de la mâchoire.

En utilisant les piles confocales étiquetées comme guide, définissez les muscles. Tout d’abord, attribuez des nœuds qui correspondent aux points d’attache musculaires. Ensuite, créez des vecteurs entre les nœuds qui représentent l’origine et l’insertion de chaque muscle.

Une fois tous les muscles définis, créez un collecteur de charge d’historique et appliquez une charge à chaque muscle. Spécifiez l’amplitude en newtons et attribuez le vecteur associé. Ensuite, attribuez aux matériaux isotropes élastiques les propriétés appropriées, telles que déterminées par la littérature.

Ensuite, créez un collecteur de charge limite et appliquez quelques contraintes initiales au modèle. Sélectionnez les nœuds à contraindre et sélectionnez un facteur de degrés de liberté similaire à l’amplitude de mouvement naturelle du muscle défini par ces nœuds. Maintenant, créez un pas de charge pour chaque type de mouvement à simuler.

Dans le menu d’analyse, sélectionnez toutes les charges et contraintes pertinentes pour simuler le mouvement spécifié. Ensuite, sélectionnez statique dans le menu déroulant. Lorsque vous êtes prêt, exportez le modèle dans un format de fichier approprié, y compris le maillage, les charges, les contraintes et les propriétés du matériau.

Dans ce cas, c’est le format INP qui est choisi. Ensuite, chargez le modèle dans le logiciel d’analyse EF. Dans ce cadre, créez et exécutez une tâche pour le modèle, et analysez les résultats pour la contrainte, la déformation, le déplacement, etc.

Sélectionnez trois à six larves de poisson-zèbre transgénique et anesthésiez légèrement les larves avec 0,02 % de MS-222 jusqu’à ce qu’elles cessent de répondre au toucher, mais que leur cœur batte toujours. Ensuite, montez les larves latéralement sur des lamelles de couverture dans de l’agarose tiède à faible point de fusion de 1 % dans la solution de Danieau. Ensuite, retirez soigneusement l’agarose autour de la tête et de la mâchoire avec une pince.

Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, rincer la solution fraîche de Danieau sur la tête de la larve pour éliminer l’anesthésique. Faites-le jusqu’à ce que le mouvement normal de la bouche reprenne. Maintenant, utilisez un logiciel de capture de films pour prendre des vidéos fluorescentes à grande vitesse des mouvements de la bouche.

Filmez à la fréquence d’images la plus élevée aussi longtemps que nécessaire pour enregistrer plusieurs cycles d’ouverture de la mâchoire. Plus tard, analysez le déplacement maximal de la mâchoire. Choisissez les cadres qui montrent la mâchoire ouverte le plus large et mesurez la distance entre l’extrémité antérieure du cartilage de Meckel et la mâchoire supérieure.

Le point de la mâchoire supérieure correspond à l’extrémité de la plaque ethmoïdale. L’immunomarquage des muscles et du cartilage, ou imagerie des rapporteurs transgéniques, permet de visualiser la structure 3D de la mâchoire, ainsi que la musculature associée. En imageant à haute résolution, il a été possible de construire un modèle qui capture la forme tridimensionnelle de la mâchoire.

Le modèle intègre des charges dont le placement et l’amplitude ont été dérivés des images confocales du muscle et du cartilage. À partir de ce modèle, une gamme de propriétés de matériaux différentes a été testée. En utilisant le déplacement in vivo observé grâce à la capture vidéo à haute vitesse, un modèle a été sélectionné qui reproduit le mieux cette amplitude de mouvement.

En utilisant les propriétés des matériaux, les charges et les données de forme de maillage les plus précises, le modèle EF a été utilisé pour explorer la meilleure estimation de l’environnement mécanique rencontré au cours de cette période. Par exemple, l’ampleur de la contrainte a été mesurée. Le modèle peut être agrandi pour voir les détails fins du motif, puis regardé dans des sections numériques pour observer les détails dans toutes les dimensions.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’imagerie confocale pour construire un modèle 3D physiologiquement précis d’une structure biologique soumise à une charge mécanique. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il s’agit d’un modèle linéaire et élastique, et que le cartilage ne se comporte pas entièrement comme un matériau linéaire. D’autres propriétés du matériau, telles que la perméabilité, peuvent être incorporées, mais peuvent nécessiter d’autres modifications du maillage.