Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d'un modèle Chambered lamelle couvre-objet

L’objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier les changements dans les biofilms en réponse aux expectorations et aux antibiotiques. Cette méthode peut être utilisée par les chercheurs pour comprendre des questions clés, telles que la façon dont l’efficacité de divers antibiotiques contre les biofilms bactériens peut être affectée par la présence d’expectorations. Le principal avantage de cette méthodologie est qu’elle permet aux individus de voir les changements qui se produisent dans les biofilms en réponse à différents facteurs.

Pour commencer l’expérience, notez le volume de l’échantillon d’expectoration précédemment obtenu. Ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, ajoutez deux fois le volume de l’échantillon. Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour bien mélanger l’échantillon.

Vortex l’échantillon sur le réglage le plus élevé pendant une minute pour le mélanger complètement. Aliquote un millilitre du mélange dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, faites tourner les tubes.

Après la centrifugation, conservez le surnageant et jetez la pastille. Filtrez : stérilisez le surnageant à travers un filtre de 0,22 micron et recueillez-le dans un tube de microcentrifugation propre. Conservez les expectorations surnageantes à 80 degrés Celsius pour une utilisation future.

Placez 40 microlitres de culture préalablement préparée dans quatre millilitres de bouillon Luria frais, ou milieu LB, et cultivez les bactéries pour obtenir une culture avec une densité optique de 0,55 à 600 nanomètres. Ensuite, diluez 100 microlitres de culture à 0,5 OD dans 400 microlitres de filtrats d’expectorations préparés à 10 % dans LB. Utilisez 200 microlitres de dilution pour ensemencer les puits des chambres de glissement. Laissez les bactéries se fixer pendant quatre heures à 37 degrés Celsius sans secouer.

Après quatre heures, retirez le support et lavez délicatement le biofilm avec 1X fresh LB. Remplacez le support restant par 200 microlitres de LB frais. Laissez les biofilms se développer à 37 degrés Celsius sans trembler. Remplacez le support toutes les 12 heures sans le laver jusqu’à ce que le biofilm soit prêt pour la microscopie. Il est très important de laver doucement les lames afin de ne pas perturber les bactéries attachées.

Après la croissance, retirez le milieu des puits de la chambre et lavez doucement chaque chambre deux fois avec 300 microlitres de PBS stérile. Ensuite, pour préparer le mélange de coloration du biofilm, ajoutez un microlitre de chaque colorant fourni dans le kit de viabilité à chaque millilitre de solution nécessaire et mélangez la solution. La quantité optimale de colorant et le temps de coloration sont déterminés empiriquement pour chaque organisme.

Ajoutez 200 microlitres du mélange de coloration dans chaque puits du verre de couverture chambré. Incuber le verre de protection. Après l’incubation, retirez le mélange de coloration des chambres et lavez bien chaque puits avec 300 microlitres de PBS stérile.

Remplacez le PBS par un support frais. Enfin, procédez à la visualisation par microscopie confocale. Des images représentatives du complexe Burkholderia cepacia (isolats cliniques BCC), après 48 heures de croissance dans du verre de couverture chambré avec un milieu seul ou en présence de filtrats d’expectoration à 10 %, démontrent que leur présence peut modifier l’architecture du biofilm.

Les images ont été analysées avec le logiciel Comstat pour obtenir les paramètres clés du biofilm, y compris l’épaisseur moyenne du biofilm, qui a été augmentée lorsqu’elle a été traitée avec 10 % d’expectorations. Afin d’apprécier les effets des différents facteurs sur la croissance du biofilm, les isolats cliniques ont été cultivés dans des milieux uniquement ou avec des expectorations et ont été traités avec ou sans antibiotique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de former et de traiter les biofilms sur du verre de couverture chambré et de les préparer pour la coloration et l’analyse confocale.