Name: Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation dun modèle Chambered lamelle couvre-objet (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Découvrez la visualisation du développement du biofilm en réponse aux expectorations et aux antibiotiques à l'aide d'un modèle de chambre à lamelle. Cette méthode permet l'observation directe et l'analyse quantitative des changements architecturaux.

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TB reconnaît une bourse de recherche de Fibrose kystique Canada.

Notez que Comité d&#39;éthique de la recherche (CER) est nécessaire pour recueillir et stocker des échantillons de crachats de sujets humains. Ces études ont été approuvées par le Hospital for Sick Children REB # 1000019444. 1. Préparation des échantillons d&#39;expectoration CF <ol><li> Prélever un échantillon de crachat de patients au cours des visites de routine à la clinique de fibrose kystique et de garder sur la glace. </li><li> Transports échantillon de crachat sur la glace dans la première heure de la collecte, au laboratoire de recherche, de se soumettre à un traitement. </li></ol> 2. expectorations Processing <ol><li> Enregistrer le volume de l&#39;échantillon de crachat obtenu. Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 2 fois le volume de l&#39;échantillon ( par exemple, 2 parties du PBS, 1 partie de l&#39; échantillon). </li><li> Mélanger le puits d&#39;échantillon avec une pipette de transfert. Vortex l&#39;échantillon sur le réglage le plus élevé pour 1 min pour mélanger complètement. </li><li> Aliquote de 1 ml de mélange ci-dessus dans le numéro 1,5 ml microtubes appropriés et centrifuger à 5000 xg pour20 min à 4 ° C. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et jeter le culot. </li><li> Filtre stériliser le surnageant à travers un filtre de 0,22 um et de recueillir dans un tube propre. NOTE: Stérilité du filtrat est testé par étalement sur gélose LB et inoculer des milieux liquides. </li><li> Rangez surnageant expectoration à -80 ° C pour une utilisation future. NOTE: Les expectorations provenant de plusieurs patients peuvent également être mises en commun après filtration. </li><li> Avant utilisation, diluer expectoration filtrat 1/10 v / v (100 pi d&#39;expectoration, 900 pi de médias) dans le support souhaité. NOTE: Ici, le bouillon de lysogeny standard (LB) Les médias ont été utilisés. </li></ol> 3. Chambered lamelle couvre-objet Méthode de formation de biofilms <ol><li> Cultivez isolat bactérien d&#39;intérêt durant la nuit dans le support souhaité à 37 ° C sous agitation (200 rpm). Note: Un certain nombre de bactéries différentes ont été utilisées, y compris des isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia et xylosoxidans Achromobacter. Choix des médias dépend des souches et des conditions d&#39;intérêt, mais les médias LB peuvent être utilisés pour des expériences initiales. </li><li> A partir de la culture pendant une nuit, placer 40 ul de la culture dans 4 ml de milieu frais et faire croître pendant 3-4 heures à 37 ° C sous agitation (200 tours par minute) pour obtenir une culture avec une densité optique à 600 nm (DO 600) d&#39;environ 0,5 -0.6. </li><li> Diluer la culture de l&#39;étape 3.2 à 1/5 dans le support désiré avec 10% de crachats filtrat ou sans filtrat expectorations (comme témoin). D&#39; autre concentration des crachats filtrat peut être testée ( par exemple, 50% ou 100%). </li><li> Utiliser 200 ul de la dilution pour ensemencer des puits de chambres à glissière. </li><li> Permettre aux bactéries de se fixer pendant 4 heures à 37 ° C sans agitation. </li><li> Après 4 heures, retirer les médias et laver délicatement le biofilm avec un milieu frais 1x. Remplacez-le par 200 ul de milieu frais. REMARQUE: Pour étudier les effets de crachats sur le biofilm, les fresh médias devraient contenir des crachats surnageant. </li><li> Laisser biofilms de croître pour la quantité désirée de temps à 37 ° C sans agitation, en remplaçant tous les médias 12 h, sans lavage jusqu&#39;à ce que le temps pour la microscopie. NOTE: Pour étudier l&#39;effet des surnageants de crachats sur la sensibilité aux antibiotiques biofilm, les antibiotiques sont ajoutés aux médias suivants 24 h de croissance du biofilm et sont maintenues dans les médias jusqu&#39;à ce que la coloration et l&#39;imagerie des biofilms. </li></ol> 4. Coloration biofilms et Microscopie confocale <ol><li> Après le temps de croissance désiré (24-48 h fonctionne le mieux), retirer le support des puits de chambre et laver délicatement chaque chambre deux fois avec 300 pi de PBS stérile. </li><li> Préparer le mélange coloration pour biofilm en mélangeant 1 pi de chaque colorant (fourni dans le kit de viabilité) pour chaque ml de solution nécessaires. Faire un colorant dans une solution d&#39;eau ou de milieux. NOTE: L&#39;eau est recommandé par le fabricant. </li><li> Ajouter 200 pi de mélange de colorants dans chaque puits de covergla chambréss et incuber à température ambiante, dans l&#39;obscurité pendant 45 min. </li><li> Retirer le mélange de coloration des chambres et laver chaque puits avec 300 pi de PBS stérile. Retirer PBS et le remplacer par l&#39;eau douce ou les médias. </li><li> Procéder à la visualisation de biofilms par microscopie confocale. </li></ol> 5. Visualizing biofilms avec Microscopie confocale <ol><li> Lire biofilms tachées dans les chambres immédiatement après coloration (à moins de 1 h). Minimiser retard dans la visualisation des diapositives par coloration 1 à 2 chambres 8 puits à la fois. </li><li> Effectuer l&#39;imagerie utilisant microscope confocal avec des lasers pour l&#39;excitation et de filtrage des ensembles pour l&#39;acquisition. NOTE: Ici, le système de disque confocale de filage avec des lasers borealis spectrales (vert: 491nm, Rouge: 561 nm) ont été utilisés pour l&#39;excitation. Émission des jeux de filtres de 515/40 et 624/40 ont été utilisés pour visualiser les taches du kit biofilm de viabilité. </li><li> Prendre des images en utilisant un objectif d&#39;eau 25X sur microscope confocal avec la caméra. </li><li&gt; Utiliser Z-Stacks pour modéliser le biofilm. Prenez des photos tous les 0,5-1 um à partir du premier plan de mise au point à la dernière image de mise au point du biofilm (couvrant généralement 30-80 um pour 48 biofilms hr) </li><li> Prendre 3-5 images de chaque puits. NOTE: Ainsi, pour un 8 coverglass bien chambré, 24-40 images seront générées. </li><li> Enregistrer des images pour l&#39;analyse. REMARQUE: Les images doivent être enregistrées en tant que fichiers OME-TIFF à être analysés en utilisant COMSTAT 18,19. Instructions pour l&#39;analyse d&#39;images de biofilm peuvent être trouvés à http://www.comstat.dk/. Une fois que les images sont importées, des paramètres tels que l&#39;épaisseur moyenne, la biomasse et la couverture de surface pour chaque canal (rouge et vert) peuvent être analysés. </li></ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
<li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li>
<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
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<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

Les procédés décrits ici permettent une visualisation des biofilms bactériens cultivés en présence de produits exogènes. Sans surprise, la production des exoproducts est d&#39;une importance lors de l&#39;utilisation de ce type de système. Par exemple, dithiothréitol (DTT), est souvent utilisé sur des échantillons de crachats humains pour aider à liquéfier les échantillons. Cependant, l&#39;effet de DTT seul peut réduire le développement de biofilm et la viabilité (données non présentées). Ainsi, des contrôles approprié...

biofilms bactériens sont des groupes de micro-organismes qui sont reliés les uns aux autres et enfermés dans une matrice auto-sécrété. 1,2 Classiquement, ils représentent les bactéries physiquement attachés à une surface abiotique ou biotique formé dans des conditions d&#39;écoulement. Biofilms ont également été montré à croître dans des conditions statiques (absence d&#39;écoulement) et distal par rapport à des surfaces, par exemple à l&#39;interface air-liquide des piscines thermales ou aux pellicules formées dans des tubes à essai. Ces biofilms sont reconnus depuis longtemps dans l&#39;environnement et sont un préjudice important aux procédés industriels, car ils peuvent se former dans les réservoirs d&#39;eau ou dans les tuyaux, ce qui entraîne l&#39;encrassement biologique, la corrosion et les blocages. 3,4 Les biofilms sont également critiques dans les milieux de soins de santé, comme il a été démontré être impliqués dans les infections liées au cathéter, les infections pulmonaires chez les patients atteints de fibrose kystique, ainsi que dans de nombreuses autres infections. 5,6 L&#39; une des caractéristiques des infections biofilm est le deaugmenté la sensibilité des bactéries aux antibiotiques et une altération de la clairance par le système immunitaire inné. 7-9 Le plus bien étudiés, des scénarios cliniquement pertinentes impliquant une infection à base biofilm se produit chez les patients atteints de fibrose kystique (FK), qui sont chroniquement infectés par Pseudomonas biofilms aeruginosa. P. aeruginosa peut subir un certain nombre de changements lors de l&#39; établissement d&#39; une infection chronique qui le rendent très difficile à traiter. 10,11 biofilms peuvent différentiellement activer l&#39; immunité innée et conduire l&#39; inflammation. 12-14 Comme ces infections conduisent à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose, il est essentiel de comprendre les facteurs qui peuvent influer sur le développement du biofilm dans ce contexte. Une étude récente suggère que l&#39; hôte facteurs sont essentiels à la formation de P. aeruginosa agrégats de biofilm. 15 Ces biofilms contribuent à une sensibilité réduite aux antibiotiques et les mécanismes de défense de l&#39; hôte. Le presence de facteurs dérivées de l&#39;hôte, telles que l&#39;élastase neutrophile, ainsi que les produits sécrétés à partir de micro-organismes présents dans le poumon CF, ont la capacité de moduler considérablement la formation de biofilm et de développement. 16 En outre, les biofilms interagir avec l&#39;hôte pour moduler l&#39; expression de nombreuses voies et initier l&#39; inflammation. Bien que les méthodes à haut débit, tels que le test de cristal violet standard, peuvent fournir des informations en ce qui concerne le processus de biofilm, la visualisation du biofilm en réponse à ces facteurs fournissent plus d&#39;informations en profondeur. Dans ce manuscrit , nous décrivons une méthode d&#39;utilisation des facteurs de l&#39;expectoration des patients atteints de mucoviscidose pour étudier le développement de biofilms in vitro. Cette méthode permet une visualisation rapide des biofilms exposés à des crachats contenant des facteurs de l&#39;hôte en utilisant un kit biofilm viabilité commerciale. Cette technique peut être utilisée pour identifier visuellement des changements qui se produisent lors de la croissance du biofilm en présence d&#39;exógenonous produits, et représente une méthode améliorée pour analyser les changements dans le développement du biofilm dans diverses conditions.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Verre de protection à chambre, borosilicate #1.5, 8 puits</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de gélose au sang</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Confirmation de la viabilité par comptage des UFC ou sélection de colonies pour l’inoculation</td></tr><tr><td>Logiciel COMSTAT</td><td>disponible en ligne</td><td></td><td>COMSTAT est un logiciel d’analyse d’images de biofilms. Disponible à l’adresse www.comstat.dk&nbsp ;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Média standard pour la croissance du gowth/biofilm pendant la nuit</td></tr><tr><td>Millex-GV Filtres pour seringues</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtrage des expectorations</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Lavage des chambres de biofilm après l’enlèvement du média</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Les instructions pour ce logiciel peuvent être trouvées à l’adresse suivante : http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm utilisation d&#39;un modèle chambered lamelle couvre-objet

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Les biofilms sont constitués de groupes de bactéries enrobées dans une matrice auto-sécrété. Ils jouent un rôle important dans la contamination industrielle, ainsi que dans le développement et la persistance de nombreuses infections liées à la santé. Un des biofilms plus bien décrits et étudiés dans les maladies humaines se produit dans l&#39;infection pulmonaire chronique des patients atteints de fibrose kystique. Lors de l&#39;étude des biofilms dans le contexte de l&#39;hôte, de nombreux facteurs peuvent influer sur la formation et le développement de biofilm. Afin d&#39;identifier comment les facteurs de l&#39;hôte peuvent affecter la formation de biofilm et de développement, nous avons utilisé une méthode coverglass chambré statique de croître biofilms en présence de facteurs de l&#39;hôte dérivé sous forme de surnageants d&#39;expectorations. Les bactéries sont ensemencées dans des chambres et exposées à filtrats expectorations. À la suite de 48 h de croissance, les biofilms sont colorées avec un kit de viabilité commerciale du biofilm avant la microscopie et l&#39;analyse confocale. Suite à l&#39;acquisition de l&#39;image, les propriétés biofilm peuvent être évaluées en utilisant différentes plates-formes logicielles.Cette méthode nous permet de visualiser les propriétés clés de la croissance du biofilm en présence de différentes substances, notamment des antibiotiques.

La conception d&#39; ensemble de l&#39;expérience est représenté sur la figure 1. L&#39;utilisation de ce protocole fournit une méthode pratique pour visualiser les changements dans les biofilms cultivés pour différentes périodes de temps (par exemple, 24, 48 ou 72 h). Surtout, des signaux exogènes tels que des crachats filtrats peuvent être ajoutés pour visualiser les changements dans le développement du biofilm. Comme on le voit sur la figure 2,</stron...

Ce protocole décrit la visualisation du développement du biofilm suite à une exposition à des facteurs de l’hôte à l’aide d’un modèle de chambre à lames. Ce modèle permet de visualiser directement le développement du biofilm ainsi que d’analyser les paramètres du biofilm à l’aide de logiciels informatiques.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser et de quantifier les modifications des biofilms en réponse à la présence de crachats et d'antibiotiques. Cette méthode peut être utilisée par les chercheurs pour répondre à des questions essentielles, telles que l'impact des crachats sur l'efficacité de divers antibiotiques contre les biofilms bactériens. Le principal avantage de cette méthodologie est qu'elle permet d'observer les changements survenant dans les biofilms en réponse à différents facteurs.Pour commencer l'expérience, enregistrez le volume de l'échantillon de crachats obtenu précédemment. Ajoutez du chlorure de sodium tamponné au phosphate, ou PBS, en quantité égale à deux fois le volume de l'échantillon. Ensuite, utilisez une pipette de transfert pour mélanger complètement l'échantillon.Vortexez l'échantillon au réglage le plus élevé pendant une minute afin de le mélanger complètement. Prélèvez un millilitre du mélange dans des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez les tubes.Après la centrifugation, conserver le surnageant et éliminer le culot. Stériliser le surnageant par filtration à travers un filtre de 0,22 micron et le recueillir dans un tube microcentrifuge propre. Conserver le surnageant de crachats à 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Placer 40 microlitres de culture préparée au préalable dans quatre millilitres de bouillon Luria frais, ou milieu LB, et faire croître les bactéries afin d'obtenir une culture ayant une densité optique de 0,55 à 600 nanomètres. Ensuite, diluer 100 microlitres de culture à 0,5 OD dans 400 microlitres de filtrats de crachats à 10 % préparés dans du LB. Utiliser 200 microlitres de la dilution pour ensemencer les puits des chambres à lame. Laisser les bactéries s'attacher pendant quatre heures à 37 degrés Celsius sans agitation.Après quatre heures, retirez le milieu et rincez délicatement le biofilm avec du LB frais 1X. Remplacez le milieu restant par 200 microlitres de LB frais. Incubez les biofilms à 37 degrés Celsius sans agitation. Renouvelez le milieu toutes les 12 heures sans rinçage jusqu’à ce que le biofilm soit prêt pour la microscopie. Il est très important de rincer délicatement les lames afin de ne pas perturber les bactéries attachées.Après la croissance, retirez le milieu des puits de la chambre et lavez doucement chaque chambre deux fois avec 300 microlitres de PBS stérile. Ensuite, pour préparer le mélange de coloration du biofilm, ajoutez un microlitre de chaque colorant fourni dans le kit de viabilité par millilitre de solution nécessaire et mélangez la solution. La quantité optimale de colorant et la durée de coloration sont déterminées empiriquement pour chaque organisme.Ajouter 200 microlitres du mélange de coloration dans chaque puits de la lamelle-chambre. Incuber la lamelle. Après l'incubation, retirer le mélange de coloration des chambres et laver chaque puits avec 300 microlitres de PBS stérile.Remplacer le PBS par du milieu frais. Enfin, procéder à la visualisation par microscopie confocale. Des images représentatives du complexe Burkholderia cepacia, ou isolats cliniques de BCC, après 48 heures de croissance dans des lamelles-chambres avec du milieu seul ou en présence de 10 % de filtrats de crachats montrent que leur présence peut modifier l'architecture du biofilm.Les images ont été analysées à l'aide du logiciel Comstat afin d'obtenir des paramètres clés du biofilm, notamment l'épaisseur moyenne du biofilm, qui augmentait lorsqu'il était traité avec 10 % de crachat. Afin d'évaluer les effets des différents facteurs sur la croissance du biofilm, des isolats cliniques ont été cultivés dans un milieu uniquement, ou avec du crachat, et ont été traités ou non avec un antibiotique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la formation et du traitement des biofilms sur des lamelles à chambre, ainsi que de leur préparation pour la coloration et l'analyse en microscopie confocale.

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Cet article décrit la procédure pour la formation et la visualisation d'un biofilm bactérien grandi au sein d'une chambre de glisser de 8...

Dans la formation de biofilms in vitro dans une diapositive Chambre de 8 puits

Source : Beaudoin, T., et al. Visualisation des effets des crachats sur le développement du biofilm à l’aide d’un modèle de verre de couverture à chambre. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre l’utilisation d’un verre de couverture à chambre pour étudier l’effet des facteurs de l’héscorte de la mucoviscidose issue du patient sur le développement du biofilm bactérien.

Une méthode de verre de couverture à chambre pour la formation in vitro de biofilms bactériens

Source : Beaudoin, T., et al. Visualisation des effets des crachats sur le développement du biofilm à l’aide d’un modèle de verre de couverture à chambre. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une méthode in vitro pour évaluer comment la mucoviscidose dérivée du patient influence la formation de biofilms bactériens. Grâce à des lames de chambre, à la coloration fluorescente et à la microscopie confocale, elle révèle une épaisseur accrue, une architecture modifiée et une biomasse viable plus...

Imagerie confocale des biofilms bactériens induits par des filtrats de crachats chez des patients atteints de mucoviscidose kystique

Des protocoles pour l’étude de la formation de biofilms dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux sont discutés. Le dispositif microfluidique se compose d’un réseau de micro-piliers et la formation de biofilms par Pseudomonas fluorescens dans ce dispositif est étudiée.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Cette étude présente le développement de méthodologies reproductibles pour étudier les inhibiteurs de biofilm et leurs effets sur la multicellularité de Bacillus subtilis.

Méthodologies pour l&#39;étude<em&gt; B. subtilis</em&gt; biofilms comme un modèle pour Caractériser Inhibiteurs biofilm petites molécules

Les voies respiratoires du mucus des patients atteints de fibrose kystique (CF) sont un environnement idéal pour que les agents pathogènes microbiens puissent prospérer. Le manuscrit décrit une nouvelle méthode pour étudier le microbiome des poumons des FC dans un environnement qui imite où ils causent des maladies et comment les altérations des conditions chimiques peuvent entraîner une dynamique microbienne.

Le modèle WinCF - Un microcosme peu coûteux et abordable d&#39;une menthe bronchée à mousqueton pour étudier la microbiologie des infections pulmonaires

Ce protocole décrit l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisées personnalisables pour visualiser la formation de biofilms de Candida albicans dans des conditions physiologiques hôte.

Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique

Nous décrivons le montage, exploitation, et le nettoyage d’un appareil à débit conçu pour la formation de biofilms fongiques d’image en temps réel sous flux. Nous également fournissons et discuter des algorithmes quantitatifs pour être utilisé sur les images acquises.

Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

Les modifications induites par les antimicrobiens de l’architecture du biofilm de Pseudomonas aeruginosa diffèrent entre les isolats cliniques cultivés chez des patients atteints de mucoviscidose et d’infection pulmonaire chronique. Après la microscopie confocale, le logiciel COMSTAT peut être utilisé pour quantifier les variations de l’architecture du biofilm (p. ex., surface, épaisseur, biomasse) pour des isolats individuels afin d’évaluer l’efficacité des agents anti-infectieux.

Quantification des effets des antimicrobiens sur l’architecture des biofilms in vitro à l’aide du logiciel COMSTAT

Découvrez la visualisation du développement du biofilm en réponse aux expectorations et aux antibiotiques à l'aide d'un modèle de chambre à lamelle. Cette méthode permet l'observation directe et l'analyse quantitative des changements architecturaux.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation dun modèle Chambered lamelle couvre-objet (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d'un modèle Chambered lamelle couvre-objet

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