Visualiser le tissu interrénal stéroïdogénique et son vasculaire Microenvironnement dans Zebrafish

L’objectif global de cette procédure est de détecter des cellules stéroïdogéniques interrénales différenciées chez le poisson-zèbre en développement grâce à un simple test d’activité enzymatique sur l’ensemble du mont. Cette procédure de coloration peut aider à répondre à des questions clés concernant les mécanismes moléculaires et cellulaires de la formation et de la malformation des glandes interrénales. Le principal avantage de ce test de coloration est qu’il est rapide, simple et fiable, ce qui en fait un outil puissant pour les criblages génétiques ou chimiques chez le poisson zèbre.

Cette procédure peut être effectuée sur des lignes rapporteures fluorescentes transgéniques, marquant le rein et les vaisseaux sanguins afin que plusieurs tissus d’un même embryon puissent être analysés. En combinaison avec la coupe par vibratome, l’immunohistochimie et la microscopie confocale, le microenvironnement vasculaire du tissu interrénal peut également être visualisé. Après avoir préparé des solutions mères pour trois colorations de l’activité bêta-Hsd conformément au protocole de texte, placez les embryons de poisson-zèbre en développement dans 0,03 % de PTU dans de l’eau d’œuf pour inhiber la formation de pigments.

Fixer les embryons déchorionnés, ou larves, dans 2 % ou 4 % de PFA dans le PBS avec 0,1 % de Tween 20, ou PFAT. Avec le PBST, lavez les embryons quatre fois pendant 10 minutes chacun, en veillant à ce que les échantillons ne se dessèchent pas entre les lavages. Avant les réactions de coloration, préparez fraîchement les pièces A et B dans des tubes séparés, puis vortex et centrifugez les solutions.

Il est essentiel de préparer les pièces A et B dans des tubes séparés. L’ajout de tous les composants directement dans un seul tube provoquera immédiatement de fortes précipitations. Ajoutez tout le tube de la partie A à tout le tube de la partie B.Mélangez bien et répartissez immédiatement un millilitre dans chaque tube de microfuge contenant des embryons fixés et lavés.

Utilisez du papier d’aluminium pour envelopper les tubes et placez-les à température ambiante sur un rotateur ou une plate-forme à bascule en secouant doucement. Déterminez empiriquement le temps de réaction à l’aide d’un microscope pour surveiller les signaux chromogènes. De légères précipitations se développeront au fil du temps qui n’interféreront pas avec le processus de réaction.

Arrêtez la réaction en utilisant du PBST pour laver les embryons quatre fois pendant 10 minutes chacune, puis post-fixez les embryons colorés avec 4 % de PFAT à température ambiante pendant 60 minutes. Pour la microscopie à montage entier, utilisez 50 % de glycérol dans le PBS pour éliminer les embryons. Ensuite, après les avoir orientés avec la face dorsale vers le haut, observez les échantillons à l’aide d’un microscope droit sous un éclairage en fond clair.

Désenjaune l’embryon et utilisez-le pour préparer un support plat. Ensuite, capturez une image haute résolution de la morphologie du tissu interrénal. Pour analyser le microenvironnement vasculaire du tissu stéroïdogène, post-fixez les embryons colorés avec 2 % de PFA.

Complétez-le avec 1 % de Triton X-100 à quatre degrés Celsius pendant une heure et utilisez PBST-X pour laver les embryons à température ambiante quatre fois pendant 10 minutes chacun. Pour encastrer les embryons, préparez de l’agarose à bas point de fusion à 4 % en dissolvant l’agarose dans du PBS à 95 degrés Celsius. Ensuite, aliquote dans des tubes de microcentrifugation et stockage à quatre à huit degrés Celsius.

Faites fondre une aliquote de 4 % d’agarose à bas point de fusion à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis maintenez l’aliquote à 47 degrés Celsius. À l’aide d’un capuchon détaché d’un tube de microcentrifugation de 1,5 % d’un millilitre comme moule, incorporez un embryon dans de l’agarose fondue et laissez-le refroidir jusqu’à ce qu’il soit solide. Pour effectuer le sectionnement du vibratome, collez un morceau de ruban adhésif sur la plate-forme sèche du vibratome.

Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour retirer le bloc d’agarose durci du moule. Appliquez de la superglue sur le ruban de papier sur la plate-forme et fixez le bloc d’agarose sur le ruban de papier avec la face antérieure de l’échantillon vers le haut. Ensuite, coupez le bloc d’agarose en forme de prisme trapézoïdal avec environ quatre à huit millimètres de chaque côté des facettes supérieure et inférieure respectivement.

Utilisez un compte-gouttes rempli de PBS froid avec 0,5 % de Trident X-100 pour rincer le bloc d’agarose. Ensuite, utilisez un vibratome selon les instructions du fabricant pour préparer des sections de 100 micromètres. À l’aide d’une aiguille de calibre 26, retirez les sections coupées du vibratome et transférez-les sur une plaque d’appoint contenant 500 microlitres de PBST-X froid à 0,5 % par puits.

Prélevez les trois coupes de tissus à activité bêta-Hsd positive en les vérifiant au microscope de dissection, et utilisez une pointe de pipette pour transférer les sections dans une plaque à 96 puits contenant 0,5 % de PBST-X froid. Colorez et imagez davantage les sections selon le protocole de texte. Pour déterminer comment le tissu interrénal stéroïdogène co-se développe avec le glomérule rénal pronéphrique et son système vasculaire naissant, le test d’activité enzymatique à trois bêta-Hsd a été réalisé sur un embryon de poisson-zèbre double transgénique, exprimant à la fois une fluorescence spécifique du rein et une fluorescence spécifique de l’endothélial.

Comme le montre ici, trois tissus stéroïdogènes bêta-Hsd positifs sont situés à droite de la ligne médiane et se dorlotent immédiatement vers le glomérule rénal pronéphrique. Certaines cellules stéroïdogènes commencent également à migrer à travers la ligne médiane. Ces coupes de vibratome d’embryons transgéniques exprimant la GFP endothéliale soumis aux trois tests bêta-Hsd ont été analysées par immunohistochimie pour détecter la fibronectine et son effecteur en aval, la kinase d’adhésion focale phosphorylée.

Le dépôt péri-dorsal de fibronectine dans l’aorte est essentiel pour soutenir la croissance des vaisseaux interrénaux. Pour l’embryon ou la larve de poisson, la coloration histochimique de l’ensemble du montage peut être effectuée en une journée si elle est effectuée correctement. Bien que cette méthode de coloration soit simple et rapide, il est important de se rappeler qu’elle ne détecte qu’une seule enzyme de la voie stéroïdogène.

Si l’on vise une analyse développementale du tissu interrénal, en plus de ce test, une habitisation in situ devra être réalisée pour détecter l’expression d’autres gènes critiques impliqués dans la stéroïdogenèse.