Une plate-forme de dosages anti-biofilm Adaptés à l'exploration des bibliothèques de composés naturels

L’objectif global de cette plateforme d’essai est de fournir un flux de travail de dépistage significatif combinant trois paramètres pertinents, la viabilité, la biomasse et la matrice du biofilm, pour l’identification et la caractérisation de nouveaux composés anti-biofilm. Cette plateforme peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte d’agents antibiofilm, en permettant une distinction précoce entre les effets chimiothérapeutiques à court terme et à long terme de manière rapide et explicative. Le principal avantage de cette plateforme développée est qu’elle combine différents dosages pour fournir une image plus complète des effets anti-biofilm des bibliothèques chimiques, en particulier des composés naturels.

Pour commencer l’expérience, préparez des échantillons de contrôle non traités avec 200 microlitres de 10 à la sixième UFC par millilitre de culture bactérienne par puits d’une plaque stérile de 96 micropuits. Inclure des contrôles de milieux sans culture bactérienne. Ensuite, sur les mêmes plaques de 96 puits, préparez des échantillons avec quatre microlitres de solution mère d’antibiotiques 50x et 196 microlitres de la culture bactérienne par puits, puis incubez les cultures.

Poursuivez la coloration à la resazurine en utilisant une pipette multicanaux pour transférer la solution planctonique entière, avec précaution, sans toucher les biofilms ni créer de bulles d’air, dans une plaque séparée, propre et à 96 puits. Encore une fois, à l’aide d’une pipette multicanaux, lavez les biofilms, une fois, avec du PBS stérile en ajoutant 200 microlitres par puits et retirez la solution avec soin. Ajouter 200 microlitres de solution de résazurine 20 micromolaires, par puits, de la plaque de biofilm et incuber le biofilm, dans l’obscurité, à 200 tr/min pendant 20 minutes, jusqu’à ce que les témoins de biofilm non traités soient uniformément roses.

Ensuite, mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques. Enlevez soigneusement la tache de résazurine des puits. Fixez les biofilms avec 200 microlitres de méthanol, pendant 15 minutes.

Après la fixation, retirez le méthanol et laissez la plaque sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez soigneusement 190 microlitres de solution de violet cristallin à 0,02 % au biofilm. Évitez de toucher les côtés des puits, avec la tache, pendant le pipetage, et évitez la formation de bulles d’air, et n’appuyez pas sur la pipette pour terminer l’éruption.

Ensuite, incubez la plaque pendant cinq minutes à température ambiante. À l’aide d’une pipette multicanaux, retirez la tache avec soin. Lavez le biofilm avec 200 microlitres d’eau déminéralisée.

Laissez sécher les puits pendant cinq minutes à température ambiante et dissolvez la tache restante dans de l’acide acétique à 33 %. Incuber la plaque pendant une heure à température ambiante. Après l’incubation, lire l’absorbance à 595 nanomètres.

Mesurer la turbidité à 595 nanomètres de la plaque de solution planctonique préparée. Cela peut être fait pendant l’incubation de la plaque colorée en violet cristallin. Ensuite, colorez les bactéries planctoniques, avec de la résazurine, en ajoutant 10 microlitres du stock de résazurine, par puits.

Pipetez la solution pour bien la mélanger. Incuber la plaque, dans l’obscurité, à température ambiante, à 200 tr/min, pendant environ cinq minutes, jusqu’à ce que les commandes non traitées soient uniformément roses. Ensuite, mesurez la fluorescence.

Procurez-vous l’une des plaques d’échantillonnage parallèles pour cette coloration et utilisez une pipette multicanaux pour retirer la solution planctonique des puits. Lavez soigneusement les puits, une fois, avec du steril PBS, sans toucher les biofilms. Ajoutez 200 microlitres d’agglutinine de germe de blé, ou de solution WGA, par puits, à colorer.

Ensuite, incubez l’assiette. Après l’incubation, lavez les cellules avec du PBS, trois fois, pour éliminer la coloration non liée. Laissez sécher la plaque pendant 15 minutes à température ambiante.

Visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence et d’un filtre FITC. Dissoudre la tache liée dans 200 microlitres d’acide acétique à 33 % par puits. Scellez les puits avec des capuchons à bande et sonicez-les à l’aide d’un sonicateur à bain d’eau.

Après sonication, incubez la plaque, pendant une heure, à 37 degrés Celsius. Au bout d’une heure, répétez la sonication tout en gardant les puits scellés entre les étapes de sonication. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques.

Encore une fois, prenez l’une des plaques d’échantillon parallèles pour cette coloration et, à l’aide d’une pipette multicanaux, retirez la solution planctonique des puits. Ensuite, lavez les puits une fois avec du PBS stérile. Ajoutez six microlitres de solution de coloration par puits et incubez la plaque dans l’obscurité pendant 15 minutes.

Avant la microscopie, retirez l’excès de liquide, manuellement, à l’aide d’une pipette multicanaux. Capturez les images à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un filtre FITC, pour la fluorescence verte, pour visualiser les cellules viables et un filtre TRITC, pour la fluorescence rouge, pour visualiser les cellules mortes. Utilisez l’une des plaques d’échantillon parallèles pour cette coloration, et retirez la solution planctonique des puits, et lavez les puits une fois avec du PBS stérile, à l’aide d’une pipette multicanaux.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution de coloration, par puits, et incubez-les, pendant 15 minutes, dans l’obscurité. Enfin, mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques. Deux projections ont été effectuées pour démontrer la performance de la plateforme en pourcentage du contrôle du biofilm non traité.

Le criblage d’une banque de dérivés d’alcaloïdes du quinquina a permis d’identifier un composé actif. Le criblage d’une banque de diterpénoïdes et de dérivés de type abiétane a permis d’identifier cinq composés actifs. La pénicilline G et la ciprofloxacine diminuent toutes deux considérablement la viabilité, la biomasse et la teneur en PNAG de la matrice du biofilm avant la formation du biofilm.

Cependant, ce n’était pas le cas lorsque la post-exposition a été utilisée. Le résultat le plus marquant a été l’augmentation de la matrice du biofilm à plus de 200 % lorsque les biofilms préformés ont été traités avec de fortes concentrations de pénicilline G. Cette image fluorescente confirme que la pénicilline G tue environ 50 % de la population bactérienne préformée, Staphylle doré, biofilm. La moyenne des rapports de fluorescence vert-rouge pour les puits de biofilm non traités indique une prédominance de cellules vivantes.

Alors que les puits traités à la pénicilline ont environ 56 % de cellules vivantes. Les cellules restées en vie, après le traitement à la pénicilline, ont produit une quantité significativement plus élevée de substance polymère extracellulaire, ou EPS, par rapport aux biofilms non traités. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de faire attention à la manipulation manuelle de la pipette pour éviter la contamination des bactéries et les taches entre les puits.

Grâce à cette plateforme, les composés antibiofilm efficaces contre Staphylococcus aureus peuvent être rapidement identifiés et caractérisés. Si d’autres espèces bactériennes sont utilisées, d’autres optimisations des protocoles de coloration seront nécessaires, mais la logique de la plateforme restera la même.