Name: Mesure de Différentiellement méthylé INS ADN Espèce dans des échantillons de sérum humain en tant que mort cellulaire Biomarker de lIslet β (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Découvrez la mesure de l'ADN INS différentiellement méthylé dans le sérum humain comme biomarqueur de mort des cellules β par PCR digitale. Cette méthode sensible permet de détecter précocement le diabète de type 1.

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Ce travail a été soutenu par la subvention UC4 DK104166 des National Institutes of Health (à RGM). Nous tenons à souligner l’aide du Centre de recherche sur le diabète de l’Indiana, soutenu par la subvention P30 DK097512 des National Institutes of Health.

Énoncé d’éthique : Les protocoles ont été approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Indiana. Les parents des sujets ont fourni un consentement éclairé écrit, et les enfants de plus de 7 ans ont donné leur consentement à leur participation.
1. Traitement du sérum
REMARQUE : Le test décrit a été rigoureusement testé en utilisant du sérum humain isolé comme suit.
<ol>
	<li>Prélever le sang dans un tube de prélèvement sanguin rouge (sans additif, non enrobé).</li>
	<li>Laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre au caillot de se former.</li>
	<li>Tube de centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante. Transférez le surnageant (sérum) dans un nouveau tube destiné à l’entreposage du sérum (tubes à vis en polypropylène, dont la taille dépend des échantillons).</li>
	<li>Conservez les échantillons à -80 ºC jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’isolement de l’ADN.</li>
</ol>
2. Extraction de l’ADN sérique
REMARQUE : L'ADN est extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN à l'aide de 50 μl de sérum (recommandé), en suivant le protocole du fabricant avec quelques modifications.
<ol>
	<li>Préparez 200 μl de tampon de lyse + 1 μl de poly(A) (5 μg) par échantillon dans un tube de microcentrifugation. Vortex pendant 15 sec. Mettez de côté jusqu’à l’étape 2.3.</li>
	<li>Prélever des échantillons de sérum dans un congélateur à -80 ºC et les décongeler à température ambiante. Porter le volume total de l’échantillon sérique à 200 μl à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, avec chlorure de calcium et chlorure de magnésium).</li>
	<li>Lyser l’échantillon en ajoutant 20 μl de protéase (1,4 unité Anson/ml) à l’échantillon, suivi d’un mélange tampon de lyse/polyA de 200 μl (de l’étape 2.2) et d’un vortex pendant 8 secondes. Incuber l’échantillon à 56 °C pendant 10 minutes, puis centrifuger brièvement pendant 7 secondes à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse (>10 000 x g).</li>
	<li>Faites précipiter l’ADN en ajoutant 230 μl d’éthanol à 100 % dans l’échantillon et agitez le vortex pendant 8 secondes. Centrifugez brièvement pendant 7 secondes à vitesse maximale (>10 000 x g).</li>
	<li>Appliquez l’ADN sur la colonne de spin en ajoutant un mélange d’échantillons de 600 μl dans la mini colonne de spin. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu et placez la colonne dans un tube propre.</li>
	<li>Lavez l’ADN en ajoutant 500 μl de tampon de lavage 1 à la colonne. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux continu et placez la colonne dans un tube propre. Ajouter 500 μl de tampon de lavage 2 dans la colonne et centrifuger à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 3 min. Placez la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et centrifugez à nouveau à vitesse maximale pendant 1 min.</li>
	<li>Éluez l’ADN en plaçant la colonne dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et en ajoutant un tampon d’élution de 60 μl directement sur le filtre. Il est important d’échanger les pointes entre les échantillons pour éviter la contamination croisée. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. Ajouter 60 μl supplémentaires de tampon d’élution et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min. </li>
	<li>Stockez l’ADN à -20 ºC pour une utilisation ultérieure, ou procédez immédiatement à la conversion au bisulfite.</li>
</ol>
3. Conversion au bisulfite
REMARQUE : La conversion au bisulfite est effectuée à l'aide d'un kit de conversion au bisulfite, en suivant le protocole du fabricant avec quelques modifications.
<ol>
	<li>Pour convertir les cytosines non méthylées en uraciles, ajoutez 130 μl de réactif de conversion au bisulfite à 20 μl d’ADN à partir de l’étape 2.7 dans un tube PCR (tube PCR unique de 0,2 ml ou tubes PCR à 8 bandelettes). Conservez les 40 μl d’ADN restants pour une utilisation ultérieure ou utilisez-les dans des réactions répétées. Mélangez 20 fois en pipetant de haut en bas et centrifugez brièvement pour vous assurer qu’il n’y a pas de gouttes sur les côtés ou le couvercle. Incuber dans un bain-marie ou un thermocycleur comme suit : 98 °C pendant 8 min, 54 °C pendant 60 min, 4 °C pendant 5 min.
	<ol>
		<li>Passez à l’étape 3.2 ou conservez à 4 °C pendant 20 h maximum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ajoutez 600 μl de tampon de liaison à la colonne d’essorage et placez la colonne dans le tube de collecte fourni. Appliquez l’ADN bisulfité dans la colonne et mélangez en pipetant de haut en bas 10 fois. Centrifugeuse à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 30 sec. Jeter le flux.</li>
	<li>Laver l’ADN en ajoutant 100 μl de tampon de lavage dans la colonne et la centrifugeuse à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 30 secondes.</li>
	<li>Effectuer une désulfonation pour éliminer le groupe sulfonate afin de finaliser la conversion des cytosines non méthylées en uracile en ajoutant 200 μl de tampon de désulfonation à la colonne. Laisser reposer à température ambiante pendant 20 min, puis centrifuger à vitesse maximale (>10 000 x g) pendant 30 sec.</li>
	<li>Lavez l’ADN en ajoutant 200 μl de tampon de lavage dans la colonne et centrifugez à pleine vitesse pendant 30 secondes. Jetez le flux continu et répétez cette étape de lavage.</li>
	<li>Placez la colonne dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Elutez l’ADN en ajoutant un tampon d’élution de 10 μl directement dans le filtre de colonne. Incuber pendant 1 min. Centrifugeuse pendant 30 s à pleine vitesse pour éluer l’ADN. Quantifier l’ADN récupéré par spectrophotométrie à A260. 
	REMARQUE : L’ADN détecté par spectrophotométrie représente principalement l’ADN polyA porteur qui a été ajouté à l’étape 2.3 ci-dessus. En règle générale, la récupération de polyA est de ≥85 % de l’entrée (>4,25 μg).</li>
	<li>Conservez l’ADN à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à passer à la PCR numérique.</li>
</ol>
4. PCR numérique multiplex
<ol>
	<li>Faites un mélange maître avec suffisamment de solution pour chaque échantillon et contrôle. Inclure au moins un échantillon contenant de l’eau (témoin négatif), un échantillon d’un plasmide contenant des INS non méthylés (1 pg, témoin positif), un échantillon de plasmide contenant des INS méthylés (1 pg, témoin positif) et un échantillon contenant un mélange 1:1 de plasmides.
	<ol>
		<li>Pour préparer le mélange maître PCR, ajoutez 12,5 μl par réaction de tampon PCR (par exemple, 125 μl pour 10 échantillons), 1,25 μl par mélange d’amorce de réaction/sonde (par exemple, 12,5 μl pour 10 échantillons), 8,25 μl par eau de réaction (par exemple, 82,5 μl pour 10 échantillons), 0,5 μl par enzyme EcoR1 de réaction (par exemple, 5 μl pour 10 échantillons). 
		REMARQUE : Les amorces et les sondes utilisées ici sont les suivantes : Amorce avant : 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTTTTTTTTTTATTTGT-3' ; Amorce inversée : 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3' ; Sonde FAM : FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB ; Sonde VIC : VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mettre en place une réaction PCR multiplex dans une plaque à 96 puits. Ajouter 19,5 μl de mélange maître dans chaque puits. Ajouter 2,5 μl d’échantillon d’ADN converti au bisulfite dans chaque puits approprié (conserver les 7,5 μl restants d’ADN converti au bisulfite ou l’utiliser dans des réactions de répétition). Mélanger en pipetant plusieurs fois de haut en bas. 
	REMARQUE : Les 8 puits alignés doivent contenir un échantillon ou un tampon de contrôle.</li>
	<li>Scellez avec un scellage en aluminium à l’aide d’une scelleuse à plaques et centrifugez dans une toupie à plaques jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide sur les côtés des puits.</li>
	<li>Configurer le générateur de gouttelettes automatisé sur l’écran tactile. 
	REMARQUE : Les 8 puits de la cartouche doivent contenir un contrôle d’échantillon ou de tampon.
	<ol>
		<li>Réglez le nombre de rangées utilisées en touchant la ou les rangées dans lesquelles les échantillons sont chargés sur la plaque à 96 puits à partir de l’étape 4.2 et mettez la ligne en surbrillance en bleu pour indiquer une rangée active.</li>
		<li>Chargez les consommables de l’arrière vers l’avant pour éviter toute contamination. Pour commencer, ajoutez des cartouches le long de la rangée arrière de l’instrument. Chargez les pointes dans la rangée centrale de l’instrument. 
		REMARQUE : Les cartouches ne peuvent s’insérer dans les supports que dans le bon sens.</li>
		<li>Placez une plaque à 96 puits dans l’instrument. Sortez un bloc froid du congélateur à -20 °C et placez-y une nouvelle plaque à jupe de 96 puits. Placez-le à l’intérieur de l’instrument à côté de la plaque de 96 puits chargée d’échantillons.</li>
		<li>Ajoutez de l’huile dans le distributeur à l’avant de l’instrument. Sélectionnez le type d’huile sur l’écran tactile.</li>
		<li>Appuyez sur le bouton de démarrage bleu pour démarrer la course. Confirmez la configuration de la plaque et appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Une fois terminé, retirez la plaque à 96 puits qui contient les gouttelettes nouvellement formées et scellez-la avec un joint en aluminium à l’aide d’une scelleuse de plaques.</li>
	<li>Effectuez la PCR10 sur un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 95 °C pendant 10:00 min ; 40 cycles à : 94 °C pendant 00:30 min, 57,5 °C pendant 01:00 min ; 98 °C pendant 10:00 min ; 12 °C pendant 10 min ou jusqu’à 24 h.</li>
	<li>Placez la plaque sur le lecteur de gouttelettes et installez le lecteur.
	<ol>
		<li>Cliquez sur l’onglet Configuration. Ouvrez un nouveau modèle en cliquant sur le modèle > nouveau. Entrez un nom de fichier.</li>
		<li>Utilisez l’éditeur de puits pour définir les paramètres de chaque échantillon. Donnez un nom unique à chaque échantillon, définissez l’expérience sur Détection d’événements rares (R-RED) et le master mix sur le mélange utilisé à l’étape 4.1.</li>
		<li>Donnez un nom à la cible 1 (c’est-à-dire non méthylé) et définissez la cible 1 comme inconnue (U). Donnez un nom à la cible 2 (c’est-à-dire méthylé) et définissez la cible 2 comme référence (R).</li>
		<li>Cliquez sur l’onglet Exécuter pour démarrer l’exécution. Dans la fenêtre des options d’exécution, sélectionnez la chimie de détection (FAM/VIC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analyse des données
<ol>
	<li>Ouvrez les résultats dans l’onglet Analyser et analysez-les à l’aide d’un tracé 2D basé sur des commandes positives (voir Figure 1).</li>
	<li>Exportez le fichier CSV généré par le lecteur de gouttelettes vers un tableur pour l’analyse des données.</li>
	<li>Pour générer des « copies par μl » de sérum, utilisez la formule : (concentration*250)/(volume de sérum utilisé pour l’isolement de l’ADN en μl). 6 
	REMARQUE : Les données sont généralement converties en log10 lorsqu’elles sont acquises à partir de sérum humain pour assurer une distribution normale. Alternativement, les données peuvent être tracées sur une échelle logarithmique10 et analysées par des statistiques non paramétriques.</li>
</ol>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthylation de cytosines par ADN méthyltransférases permet le contrôle épigénétique de la transcription de nombreux gènes. Le gène de l&#39; INS chez l&#39;être humain est presque exclusivement exprimée dans des cellules d&#39; îlots β, et il semble y avoir une corrélation entre la fréquence de méthylation de cytosine dans le gène INS silençage de sa transcription 11. En tant que tel, la plupart des types de cellules présentent sensiblement plus hautes fréquences de méthylation du gène de...

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto - immune qui se caractérise par la destruction des îlots de Langerhans productrices d&#39;insuline par les cellules β des cellules T autoréactives 1. Le diagnostic de DT1 est généralement faite sur mesure (glycémie&gt; 200 mg / dl) de l&#39;hyperglycémie chez un jeune individu maigre, qui pourrait présenter une acidocétose comme preuve d&#39;une carence en insuline. Au moment du diagnostic de diabète de type 1, il existe des preuves pour une perte substantielle de la fonction des cellules β et la masse (50-90%) 2. Dans les études cliniques, plusieurs médicaments modulateurs immunitaires qui ont été instituées au moment du diagnostic ont donné lieu à la stabilisation de la fonction des cellules β (et probablement de masse), mais aucune n&#39;a abouti à une rémission clinique de la maladie, une constatation qui a soulevé l&#39;appel pour le développement de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et pour le suivi longitudinal de l&#39; efficacité de la combinaison des thérapies 3,4. Les efforts déployés par des consortiums internationaux, une telleest le Consortium Réseau de recherche sur l&#39; îlot humain au National Institutes of Heath 5, ont souligné la nécessité de développer des biomarqueurs qui mettent l&#39; accent sur le stress cellulaire β et la mort dans le DT1. Conformément à ces efforts, notre groupe et d&#39; autres ont récemment mis au point des tests de biomarqueurs qui mesurent en circulation, des fragments d&#39;ADN épigénétique modifiés qui découlent principalement de la mort des cellules ß 6-9. Dans tous les essais publiés à ce jour, l&#39;accent a été mis sur la quantification du gène humain codant pour la préproinsuline (INS), ce qui démontre un plus grand degré de sites CpG non méthylés dans les régions codantes et du promoteur par rapport à d&#39; autres types de cellules. La libération de fragments d&#39; ADN non méthylé INS a émis l&#39; hypothèse que découlant principalement de la mort (nécrotiques, apoptotiques) cellules ß. Nos études récentes ont montré que chez les jeunes, les élévations de l&#39;ADN non méthylé INS à la fois et méthylé en position -69 pb ( par rapport à til transcriptionnelle site de départ) ont été observés dans la nouvelle apparition du DT1, et ensemble a servi en tant que biomarqueurs spécifiques pour cette population 6. Ces dosages de marqueurs biologiques impliquent l&#39;isolement de l&#39;ADN acellulaire de sérum ou de plasma en utilisant des kits commerciaux de rotation, suivie d&#39;une conversion au bisulfite de l&#39;ADN isolé (pour convertir les cytosines non méthylées à uraciles, en laissant intact cytosines méthylées). Dans ce rapport, nous décrivons les aspects techniques de la collecte des échantillons de sérum, l&#39; isolement de l&#39; ADN sans cellules à partir de sérum, conversion au bisulfite, et les performances des gouttelettes PCR numérique (désormais, PCR numérique) pour l&#39; ADN méthylé INS différentiellement.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer à haut rouge&nbsp ;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>sans additif, intérieur non revêtu,</td></tr><tr><td>tube cryovial</td> de 10 ml <td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>, tube à bouchon à vis, n’importe quelle taille</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>détesté dans le tampon TE (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) à 5 & micro ; g/&micro ; l&nbsp ;</td></tr><tr><td>Éthanol absolu (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (avec CaCl2 et MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml PCR 8 bandelettes</td><td>Tubes MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8 bandelettes Capuchons, Dôme</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Kit de méthylation-foudre</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP)</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Control pour sondes</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, semi-jupe</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>Thermoscellage à feuille perçable</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Scelleuse de plaques</td><td>PCR Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Droplet Système PCR numérique</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>Huile de génération de gouttelettes automatisée pour sondes</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 Cartouche pour générateur de gouttelettes automatisé</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette pour générateur de gouttelettes automatisé</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Bacs à pointes de pipette pour générateur de gouttelettes automatisé</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermocycleur tactile</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lecteur de gouttelettes</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de gouttelettes ddPCR Huile</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de différentiellement méthylé<em&gt; ins</em&gt; adn espèce dans des échantillons de sérum humain en tant que mort cellulaire biomarker de l&#39;islet β

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

La mort des cellules des îlots β est censée être à l’origine de la pathogenèse de pratiquement toutes les formes de diabète et précéder le développement de l’hyperglycémie franche, en particulier dans le diabète de type 1. La mise au point de biomarqueurs sensibles et fiables de la mort cellulaire β peut permettre une intervention thérapeutique précoce pour prévenir ou retarder le développement du diabète. Récemment, plusieurs groupes, dont le nôtre, ont rapporté que l’ADN acellulaire et méthylé différentiellement codant pour la préproinsuline (INS) dans la circulation est corrélé à la mort cellulaire β dans le prédiabète de type 1 et le diabète de type 1 d’apparition récente. Ici, nous présentons un protocole étape par étape utilisant la PCR numérique pour la mesure de l’ADN INS acellulaire qui est méthylé de manière différentielle à la cytosine à la position -69 pb (par rapport au site de départ transcriptionnel). Nous démontrons que le test peut faire la distinction entre la cytosine méthylée et non méthylée à la position -69 pb, qu’il est linéaire sur plusieurs ordres de grandeur, qu’il fournit une quantification absolue du nombre de copies d’ADN et qu’il peut être appliqué à des échantillons de sérum humain provenant d’individus atteints de diabète de type 1 d’apparition récente et de témoins sans maladie. Le protocole décrit ici peut être adapté à n’importe quelle espèce d’ADN pour laquelle la détection de cytosines méthylées différentiellement est souhaitée, que ce soit à partir de la circulation ou de cellules et de tissus isolés, et peut fournir une quantification absolue des fragments d’ADN.

Pour interpréter les données de manière appropriée, nous utilisons des contrôles plasmidiques tant pour l&#39;ADN cible non méthylé et méthylé INS dans chaque essai de PCR numérique. Ces contrôles assurent que les signaux correspondant à l&#39;ADN méthylé et non méthylé se distinguent clairement. La figure 1 montre les diagrammes de dispersion 2-D correspondant aux gouttes pour les contrôles de plasmide contenant le bisulfite converti méthylé INS ADN <s...

β la mort cellulaire précède le développement du diabète de type 1, et la détection de ce processus peut permettre une intervention thérapeutique précoce. Nous fournissons ici une description détaillée de la façon de mesurer les espèces d’ADN INS méthylées de manière différentielle dans le sérum humain en tant que biomarqueur de la mort cellulaire β.

Mesure de Différentiellement méthylé<em&gt; INS</em&gt; ADN Espèce dans des échantillons de sérum humain en tant que mort cellulaire Biomarker de l&#39;Islet β

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer les espèces d'ADN de préproinsuline différentiellement méthylées dans le sérum humain en tant que biomarqueur de la mort des cellules bêta. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diabète, telles que : la mort des cellules bêta se produit-elle à un moment donné pendant le développement du diabète de type 1 ? Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que, grâce à la PCR numérique, nous pouvons déterminer la quantité de mort des cellules bêta à partir de très faibles volumes de sérum.Après avoir prélevé le sérum à partir d'échantillons de sang humain conformément au protocole décrit, préparez 200 µL de tampon de lyse et 1 µL de poly(A) par échantillon dans un tube de microcentrifugeuse. Vortexez le tube pendant 15 secondes. Retirez les échantillons de sérum du congélateur à -80 °C et laissez-les dégeler à température ambiante.Ensuite, utilisez du PBS pour ajuster le volume de l'échantillon de sérum à 200 microlitres. Lysis les échantillons en ajoutant 20 microlitres de protéase et 200 microlitres du tampon de lyse poly(A)mix. Vortexez les tubes pendant huit secondes et incubez les échantillons à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes.Ensuite, centrifuger les tubes à vitesse maximale pendant sept secondes. Précipiter l'ADN en ajoutant 230 microlitres d'éthanol à 100 % aux échantillons et vortexer les tubes pendant huit secondes. Ensuite, centrifuger les tubes à vitesse maximale pendant sept secondes.Ensuite, appliquez 600 µL de mélanges d'échantillons sur des colonnes de centrifugation et centrifugez les colonnes à 6000 ×g pendant une minute. Jetez le flux traversant et placez les colonnes dans des tubes propres. Ajoutez 500 µL de tampon de lavage 1 sur les colonnes et centrifugez les échantillons à 6000 ×g pendant une minute.Ensuite, jetez le flux traversant et placez les colonnes dans des tubes propres. Ajoutez 500 microlitres du tampon de lavage deux sur les colonnes et centrifugez-les à vitesse maximale pendant trois minutes. Puis, placez les colonnes dans de nouveaux tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifugez-les à nouveau pendant une minute.Pour éluer l'ADN, placer les colonnes dans de nouveaux tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre et ajouter 60 microlitres de tampon d'élution directement sur les filtres. Après une incubation des colonnes à température ambiante pendant cinq minutes, centrifuger les échantillons à 6000 ×g pendant une minute. Jeter la colonne et conserver les échantillons jusqu'au moment de la conversion au bisulfite.Pour convertir les cytosines non méthylées en uraciles, ajouter 130 µL de réactif de conversion au bisulfite à 20 µL d'ADN dans des tubes PCR. Mélanger les échantillons 20 fois par aspiration et expulsion à l'aide d'une pipette, puis effectuer une courte centrifugation afin de s'assurer qu'aucune goutte ne reste sur les parois ou le couvercle. Incuber les échantillons dans un bain-marie ou un thermocycleur comme indiqué ici.Placer les colonnes dans les tubes de collecte fournis et ajouter 600 microlitres de tampon de liaison aux colonnes de centrifugation. Appliquer l'ADN bisulfité sur les colonnes et mélanger en pipetant 10 fois vers le haut et vers le bas. Ensuite, centrifuger les échantillons à vitesse maximale pendant 30 secondes et jeter le flux traversant.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de lavage sur la colonne et centrifugez pendant 30 secondes. Puis, afin d'éliminer les groupes sulfinate et de finaliser la conversion des cytosines non méthylées en uracile, ajoutez 200 microlitres de tampon de désulfination sur les colonnes. Après avoir laissé les échantillons se reposer à température ambiante pendant 20 minutes, centrifugez les colonnes pendant 30 secondes.Lavez l'ADN en ajoutant 200 microlitres de tampon de lavage sur les colonnes et centrifugez-les pendant 30 secondes. Ensuite, jetez le flux traversant et répétez l'étape de lavage. Placez les colonnes dans des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre et éluez l'ADN en ajoutant 10 microlitres de tampon d'élution directement sur les filtres des colonnes.Incuber les échantillons pendant une minute, puis les centrifuger pendant 30 secondes pour éluer l'ADN. Jeter les colonnes et conserver les échantillons. Quantifier l'ADN récupéré par spectrophotométrie à une absorbance de 260 nanomètres.Préparez un mélange maître contenant suffisamment de solution pour chaque échantillon et témoin. Incluez au moins un échantillon contenant de l'eau, un échantillon de plasmide contenant de l'insuline non méthylée, et un échantillon contenant un mélange équimolaire de plasmides. Mettez en place des réactions de PCR multiplex dans une plaque de 96 puits en ajoutant d'abord 19,5 µL de mélange maître dans chaque puits.Ajoutez 2,5 µL d'échantillon d'ADN converti au bisulfite dans les puits appropriés. Ensuite, mélangez les puits en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Utilisez du papier d'aluminium et un scelleur de plaque pour fermer la plaque, puis centrifugez-la dans un centrifugeuse pour plaque jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de liquide sur les parois des puits.Pour configurer le générateur de gouttelettes automatisé sur l'écran tactile, sélectionnez le nombre de lignes utilisées en touchant les lignes dans lesquelles les échantillons sont chargés dans les puits de la plaque. Pour éviter toute contamination, chargez les consommables de l'arrière vers l'avant, en commençant par les cartouches placées le long de la rangée arrière de l'appareil. Ensuite, insérez les pointes dans la rangée centrale.Ensuite, placez la plaque 96 puits dans l'appareil. Puis, après avoir retiré un bloc réfrigéré du congélateur à moins 20 degrés Celsius, insérez une nouvelle plaque 96 puits à bords surélevés dans ce bloc. Placez le bloc contenant la plaque dans l'appareil, à côté de la plaque contenant les échantillons.Ajoutez de l'huile dans le distributeur situé à l'avant de l'instrument et sélectionnez le type d'huile sur l'écran tactile. Appuyez sur le bouton bleu Démarrer pour lancer l'exécution. Ensuite, confirmez la configuration de la plaque et appuyez sur le bouton Démarrer l'exécution pour commencer.Une fois l'exécution terminée, retirez la plaque de 96 puits contenant les gouttelettes nouvellement formées et utilisez un scelleur de plaque pour la sceller avec du papier d'aluminium. Effectuez maintenant une PCR dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant. Placez la plaque sur le lecteur de gouttelettes et configurez le lecteur en cliquant sur l'onglet Configuration.Ensuite, ouvrez un nouveau modèle en cliquant sur Modèle Nouveau. Utilisez l'éditeur de puits pour définir les paramètres de chaque échantillon. Attribuez un nom unique à chaque échantillon.Configurer l'expérience sur Détection d'événements rares et régler le mélange maître sur le mélange utilisé pour préparer la réaction. Donner un nom à la Cible 1, par exemple Non méthylée, et définir la Cible 1 comme inconnue, ou U. Donner un nom à la Cible 2, par exemple Méthylée, et définir la Cible 2 comme référence, ou R. Cliquer sur l'onglet Exécuter pour démarrer l'analyse et saisir un nom de fichier. Ensuite, dans la fenêtre Options d'exécution, sélectionner la chimie de détection.Pour analyser les données, ouvrez les résultats dans l'onglet Analyser et utilisez le graphique 2D basé sur les témoins positifs pour analyser les données. Cette figure montre les diagrammes de dispersion 2D correspondant aux gouttelettes pour les témoins plasmidiques, contenant de l'ADN d'insuline bisulfite-converti non méthylé, de l'ADN d'insuline méthylé, et un mélange un pour un des deux plasmides. Notez que dans ce panneau, il y a un léger décalage des gouttelettes positives en FAM vers le canal VIC, indiquant la sonde pour l'ADN d'insuline méthylé.De même, on observe un très léger décalage des gouttelettes positives pour VIC dans le canal FAM, indiquant une réactivité croisée de la sonde pour l'ADN non méthylé avec l'ADN méthylé. Pour démontrer la linéarité des amorces, des mélanges des deux plasmides, couvrant plusieurs ordres de grandeur, ont été utilisés dans les réactions de PCR. Comme illustré ici, des concentrations variables d'un plasmide peuvent être détectées de manière linéaire en présence d'une quantité constante du second plasmide.Dans cette figure, des échantillons provenant de quatre individus atteints de diabète de type 1 récent et de quatre échantillons témoins sans diabète de type 1 ont été analysés. Les données montrent que les individus atteints de diabète de type 1 présentent des taux élevés d'ADN d'insuline méthylé et non méthylé par rapport aux témoins, comme cela a déjà été démontré. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures pour 30 échantillons si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'éviter toute contamination à chaque étape. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du diabète pour explorer son utilisation comme biomarqueur dans le développement du diabète de type 1. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer la quantité de mort des cellules bêta en mesurant la préproinsuline non méthylée et méthylée dans l'ADN libre de cellules provenant de sérum humain.N'oubliez pas que le travail avec des tampons d'extraction de l'ADN peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et d'une blouse de laboratoire, ainsi que l'absence d'utilisation d'agents désinfectants contenant de l'eau de Javel, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Génétique

Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d'imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Cette vidéo présente la détection par électrochimiluminescence des auto-anticorps des îlots dans le sérum humain. Les anticorps présents dans le sérum font le lien entre l’antigène conjugué au ruthénium et l’antigène de capture biotinylé, formant des complexes qui sont détectés par des mesures d’électrochimiluminescence.

Détection d’auto-anticorps d’îlots humains à l’aide d’un test d’électrochimiluminescence

Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Ici, nous présentons une méthodologie pour générer et administrer un composé de microsphères poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) chargées d’intérêt à des îlots de souris intacts en culture, avec analyse ultérieure par immunofluorescence de la prolifération des cellules β. Cette méthode convient pour déterminer l’efficacité des mitogènes β cellules candidates.

Administration soutenue de mitogenes β-cellules à Intact Islets souris<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Utilisation Biodegradable poly (acide lactique-co-glycolique) Microsphères

Ici, nous avons présenté les méthodes pour détecter des autoanticorps d’îlots pancréatiques humains à l’aide de dosages par électrochimiluminescence (ECL). Le protocole utilisé pour prédire le diabète de type 1, peut être étendu à pour détecter des auto-anticorps pour d’autres maladies auto-immunes.

Par électrochimiluminescence dosages pour îlots pancréatiques humains autoanticorps

Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d'ARN à base de gouttelettes.

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Cette étude utilise des marqueurs de mort cellulaire et d’apoptose basés sur la fluorescence multicoloration, combinés à la microscopie confocale pour évaluer l’apoptose induite par les cytokines et la mort spécifique des cellules β dans les îlots pancréatiques. Il révèle des changements spatiaux et temporels dans la mort cellulaire et l’apoptose en réponse à des stimuli extracellulaires.

Traitement isolé des îlots pancréatiques et mesure de l’apoptose

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Découvrez la mesure de l'ADN INS différentiellement méthylé dans le sérum humain comme biomarqueur de mort des cellules β par PCR digitale. Cette méthode sensible permet de détecter précocement le diabète de type 1.

Mesure de Différentiellement méthylé INS ADN Espèce dans des échantillons de sérum humain en tant que mort cellulaire Biomarker de lIslet β (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure de Différentiellement méthylé

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