Évaluation de la Fonction bioénergétique dans les cellules endothéliales vasculaires cérébraux

Les objectifs généraux de cette procédure sont d’évaluer comment les altérations de la fonction mitochondriale affectent le développement de troubles neurologiques et de concevoir des traitements qui ont un effet direct sur les ouvertures de la barrière hémato-encéphalique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles neurologiques, telles que comment minimiser la mort des cellules neuronales après un AVC ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’évaluer en temps réel la fonction mitochondriale dans des cellules entières intactes.

Après avoir cultivé les cellules endothéliales vasculaires cérébrales dans un milieu complet, dans une fiole de culture tissulaire de 75 centimètres carrés, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 80 % de confluence, jetez le milieu de culture cellulaire et rincez les cellules avec de la trypsine EDTA. Ajoutez ensuite un à deux millilitres de trypsine EDTA fraîche dans le flacon et détachez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Après avoir confirmé que les cellules se sont soulevées sous un microscope inversé, arrêtez la réaction avec l’ajout doux de 10 millilitres de milieu cellulaire complet frais et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation.

Jetez le surnageant et lavez la pastille dans 10 millilitres de milieu de croissance complet frais pour une autre centrifugation. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un milieu de croissance complet à une concentration de deux fois 10 à cinq cellules par millilitre pour la sous-culture. Après le nombre approprié de sous-cultures, ensemencez 1,6 fois 10 à la quatrième cellules dans 80 microlitres de milieu complet par puits, sur une plaque de culture cellulaire à flux extracellulaire de 96 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Lorsque les cellules se sont fixées à la plaque, ajoutez le traitement d’intérêt aux puits appropriés et retournez les cellules dans l’incubateur. La veille de l’essai d’évaluation fonctionnelle mitochondriale, hydratez une cartouche de censure de flux extracellulaire avec 150 microlitres de solution de calibrant de flux extracellulaire et incubez la plaque pendant une nuit à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. Le lendemain matin, utilisez la station de lavage de plaques pour transformer le milieu de culture cellulaire en milieu d’essai de flux extracellulaire pH 7,0.

Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius, sans dioxyde de carbone, pendant 30 à 60 minutes. Une fois les cellules équilibrées, chargez la cartouche hydratée dans le bioanalyseur et cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’étalonnage. À la fin de l’étalonnage, cliquez sur l’invite Déverrouiller la cartouche pour retirer la plaque inférieure de la cartouche et charger la plaque de cellule.

Ouvrez ensuite le fichier de données pour obtenir les valeurs de débit du Bioanalyzer pour les exporter dans le fichier de tableur. Étant donné que la cinétique et l’intensité relative des réponses varient entre les différents types de cellules endothéliales vasculaires cérébrales, dans ces expériences, une série de concentrations de bEnd. 3 cellules a été utilisée pour identifier le nombre optimal de cellules pour mesurer les niveaux de taux de consommation d’oxygène dans un test de profilage métabolique.

Comme observé, les respirations basale et maximale et la capacité respiratoire de réserve démontrent une réponse proportionnelle à la densité cellulaire. Cependant, la production d’ATP diminue lorsque la plus forte concentration de cellules par puits est utilisée, ce qui suggère qu’une culture cellulaire sur-confluente ne convient pas à l’expérience. Les densités cellulaires optimales semblant se produire dans la plage médiane du nombre de cellules par puits.

Par conséquent, les niveaux de taux de consommation d’oxygène attendus ont été évalués dans cette expérience représentative à l’aide d’une concentration cellulaire moyenne, démontrant que les molécules d’ARNm précurseurs non codantes réduisent la fonction mitochondriale dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales. Ces expériences démontrent également que la respiration maximale et la capacité de réserve sont significativement diminuées par la surexpression de ces molécules dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales 24 heures après la transfection, même si la respiration basale, la production d’ATP et la fuite de protons ne présentent aucun changement significatif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours.

De la mise en plaques des cellules à l’accès à la fonction mitochondriale, si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il est extrêmement important de déterminer la densité cellulaire optimale avant de commencer toute autre procédure. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme la viabilité cellulaire ou les tests glycolytiques, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les changements qui se produisent dans la fonction mitochondriale en raison d’une diminution de la viabilité cellulaire ou de changements dans d’autres voies métaboliques.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la fonction mitochondriale pour l’utilisation de cellules intactes à l’intérieur de mitochondries isolées et d’une variété de maladies, notamment les maladies neurologiques, le cancer ou les troubles métaboliques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’accéder à la fonction mitochondriale dans les cellules endothéliales vasculaires cérébrales.