Name: Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes Clostridium difficile Strain R20291 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Découvrez le modèle murin à la céfopérazone pour étudier l'infection à Clostridium difficile avec la souche R20291. Ce protocole détaillé permet de surveiller la progression clinique, d'évaluer la charge bactérienne et d'analyser les changements histopathologiques.

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Les auteurs tiennent à remercier Trevor Lawley du Wellcome Trust Sanger Institute pour les spores de C. difficile R20291 et James S. Guy du North Carolina State University College of Veterinary Medicine pour les cellules Vero, toutes deux utilisées dans ce manuscrit. L’histopathologie animale a été réalisée dans la plateforme d’histopathologie animale du LCCC de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, avec l’aide spéciale de Traci Raley et Amanda Brown. La plateforme d’histopathologie animale du LCCC est financée en partie par une subvention de soutien de base du NCI Center (2P30CA016086-40) accordée au Lineberger Comprehensive Cancer Center de l’UNC. Nous tenons également à remercier Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie et Cassie Schumacher pour leurs discussions utiles sur le protocole de test de cytotoxicité des cellules Vero. JAW est financé par la subvention Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training T32OD011130 par les NIH. CMT est financé par la bourse de développement de carrière en métabolomique K01GM109236 par le NIGMS du NIH.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer pour le moment.

Ce protocole caractérise l’évolution clinique, y compris la perte de poids, la colonisation bactérienne, la cytotoxicité des toxines et les changements histopathologiques dans le tractus gastro-intestinal, de souris traitées aux antibiotiques et exposées par des spores de C. difficile R20291. Le protocole comporte plusieurs étapes critiques où l’attention portée aux détails est essentielle. Il est essentiel de calculer avec précision l’inoculum des spores de C. difficile . Ce calcul est basé sur le déno...

Clostridium difficile est un anaérobie, bacillus sporulé Gram positif qui provoque la vie en danger de la diarrhée 1. Infection à C. difficile (ICD) est associée à une augmentation de la morbidité et la mortalité humaines et les résultats dans plus de 4,8 milliards $ en coûts de soins de santé par an 1-4. En 2013, les Centers for Disease Control and Prevention catégorisés C. difficile comme un risque urgent de résistance aux antibiotiques, ce qui indique qu&#39;il constitue une menace urgente pour la santé publique 1. Actuellement, le traitement antibiotique vancomycine et métronidazole sont considérés comme la norme de soins pour CDI 5. Malheureusement, la récurrence du CDI après un traitement réussi avec des antibiotiques est élevée, se produisant dans 20 - 30% des patients 2,5-7. Par conséquent, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques contre cet agent pathogène entérique est nécessaire. Pour évaluer la thérapeutique contre C. difficile, un modèle animal approchant la maladie humaine en courant alternatifsouche linically pertinente est nécessaire. Dans un premier temps , les postulats de Koch ont été établies pour C. difficile en 1977 en utilisant un modèle de hamster syrien clindamycine traité 8. Ce modèle est encore utilisé aujourd&#39;hui pour étudier les effets des toxines de C. difficile sur la pathogenèse 9,10. Cependant, le CDI dans le modèle hamster entraîne des taux de mortalité élevés et ne se rapproche pas les manifestations de la maladie insidieuse chroniques qui peuvent être vus chez l&#39; homme avec CDI 10,11. Sur la base de l&#39;accessibilité et de disponibilité des plates-formes réactif de souris dans la recherche d&#39;un modèle de souris de la CDI est pertinente. En 2008, un modèle de souris robuste de CDI a été créé par le traitement des souris avec un cocktail d&#39; antibiotiques dans l&#39; eau potable (kanamycine, gentamicine, la colistine, le métronidazole et la vancomycine) pendant 3 jours , suivie d&#39;une injection intrapéritonéale de clindamycine 12. Cette souris rendues sensibles à la colite CDI et sévère. Dépendretion de la dose d&#39;inoculum administré, une gamme de signes cliniques et la létalité peut être observée en utilisant ce modèle. Depuis ce temps, divers traitements antibiotiques ont été étudiés qui modifient le microbiote intestinal murin, ce qui diminue la résistance à la colonisation au point où C. difficile peut coloniser le tractus gastro - intestinal (revue dans Best et al. Et Lawley &amp; Young) 13,14. Plus récemment, une céphalosporine à large spectre, céfopérazone, étant donné dans l&#39;eau de boisson pendant 5 ou 10 jours rend reproductible des souris sensibles à la CDI 15. Depuis l&#39; administration des céphalosporines de troisième génération sont associés à un risque accru de CDI chez l&#39; homme, l&#39; utilisation du modèle de céfopérazone reflète plus fidèlement la maladie 16 d&#39;origine naturelle. Céfopérazone souris traitées sensibles à C. difficile ont été provoquées avec les deux spores de C. difficile et les cellules végétatives de diverses souches cliniques allant dansla pertinence et la virulence 17. Malgré certaines des études originales utilisant des cellules végétatives C. Difficile comme la forme infectieuse, spores de C. difficile sont considérés comme le principal mode de transmission 18. Dans la dernière décennie, C. difficile R20291, a / BI / 027 souche NAP1, a vu le jour, ce qui provoque des épidémies de CDI 19,20. Nous avons cherché à déterminer l&#39;évolution clinique de la maladie , lorsque les souris céfopérazone traités ont été exposés à la souche de C. difficile cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. Ce protocole détaille l&#39;évolution clinique, y compris la perte de poids, la colonisation bactérienne, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques dans le tractus gastro - intestinal des souris infectées avec des spores de C. difficile R20291. Dans l&#39;ensemble, ce modèle de la souris se révèle être une plate-forme expérimentale précieuse pour CDI approchant la maladie humaine. Ce modèle de souris caractérisé peut donc être utilisée pour évaluer les effetsde nouveaux produits thérapeutiques sur l&#39;amélioration de la maladie clinique et sur la restauration de la résistance à la colonisation contre C. difficile.

<table><tbody><tr><td>#62 Perisept Nettoyant Désinfectant Sporidicial&nbsp ;</td><td>SSS Navigator</td><td>48027</td><td>Ce produit nécessitera une dilution telle que recommandée par le fabricant</td></tr><tr><td>0,22 &mu ; m filter</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-3</td><td>Alternative à la plaque filtrante pour les échantillons individuels testés dans le Vero Cell Assay</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Doit être chauffé au bain-marie à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>0,4 % Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1 % Péniciline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>10 % inactivé par la chaleur</td><td>FBS Gibco</td><td>16140-071</td><td>Doit être chauffé au bain-marie à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Seringue en plastique de 1 ml&nbsp ;</td><td>BD Medical Supplies</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Micro centrifugeuse Bouchon à vis</td><td>Corning</td><td>430917</td><td></td></tr><tr><td>96 puits culture cellulaire plaque à fond plat</td><td>Costar Corning</td><td>CL3595</td><td></td></tr><tr><td>96 puits plaque filtrante</td><td>Millipore</td><td>MSGVS2210</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Seal</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211684</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Cefoperazone</td><td>MP Bioworks</td><td>199695</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitine</td><td>Sigma</td><td>C47856</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Antitoxin Kit</td><td>Tech Labs</td><td>T5000</td><td>Utilisé comme contrôle pour le test Vero Cell</td></tr><tr><td>Toxine Clostridium difficile A</td><td>List Biological Labs</td><td>152C</td><td>Contrôle positif pour le test Vero Cell</td></tr><tr><td>D-cycloserine</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>Gibco</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x Media</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Doit être chauffé au bain-marie à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Fructose</td><td>Fisher</td><td>L95500</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Bright-Line, Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>MgSO4 (anhydre)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &mu ; m filter</td><td>Millex-GS</td><td>SLGS033SS</td><td>Filtre pour plaques TCCFA</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Lame de scalpel jetable numéro 10</td><td>Miltex, Inc</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Plaques PCR</td><td>Fisherbrand</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en plastique</td><td>Kord-Valmark Brand</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>Épandeur de cellules en forme de L en plastique stérile</td><td>Fisherbrand</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>Seringue pas à pas</td><td>Dymax Corporation</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>Taurocholate</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td>Partie des plaques TCCFA (voir ci-dessous)</td></tr><tr><td>Eau distillée ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Souris</td><td>Le laboratoire Jackson</td><td>664</td><td>Les souris doivent être âgées de 5 à 8 semaines</td></tr><tr><td>Microscope optique Olympus BX43F</td><td>Appareil</td> photo DP27 d’Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Dimension logiciel&nbsp ;</td><td>Olympus Sciences de</td><td></td><td></td> la vie</tr></tbody></table>

céfopérazone traité souris modèle de cliniquement pertinentes<em&gt; clostridium difficile</em&gt; strain r20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile est un pathogène entérique anaérobie, à Gram positif et sporulé qui est associé à une morbidité et à une mortalité croissantes et constitue par conséquent une menace urgente pour la santé publique. La récurrence d’une infection à C. difficile (ICD) après un traitement antibiotique réussi est élevée, survenant chez 20 à 30 % des patients, nécessitant ainsi la découverte de nouvelles thérapies contre cet agent pathogène. Les modèles animaux actuels d’ICD entraînent des taux de mortalité élevés et ne se rapprochent donc pas des manifestations chroniques et insidieuses de la maladie observées chez l’homme atteint d’ICD. Pour évaluer les traitements contre C. difficile, il est nécessaire de disposer d’un modèle murin se rapprochant de la maladie humaine à l’aide d’une souche cliniquement pertinente. Ce protocole décrit le modèle murin de céfopérazone de l’ICD à l’aide d’une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. Les techniques de surveillance clinique de la maladie, de dénombrement bactérien de C. difficile, de cytotoxicité des toxines et de changements histopathologiques tout au long de l’ICD dans un modèle murin sont détaillées dans le protocole. Comparé à d’autres modèles murins d’ICD, ce modèle n’est pas uniformément létal à la dose administrée, ce qui permet d’observer une évolution clinique prolongée de l’infection concordant avec la maladie humaine. Par conséquent, ce modèle murin de céfopérazone de l’ICD s’avère une plate-forme expérimentale précieuse pour évaluer les effets de nouvelles thérapies sur l’amélioration de la maladie clinique et sur la restauration de la résistance à la colonisation contre C. difficile.

Au cours d&#39;une étude représentative, 5-week-old C57BL / 6 souris WT ont été prétraités avec céfopérazone dans leur eau potable (0,5 mg / ml) pendant 5 jours et autorisés par jour 2 se laver avec de l&#39;eau potable régulière. Les souris ont été provoquées avec 5 à 10 spores de C. difficile R20291 par gavage oral au jour 0 (figure 1A). Les souris ont été surveillés pour la perte de poids et les signes cliniques (léthargie, inappétence, la diarrhée...

Ce protocole décrit le modèle de souris céfopérazone d&#39;infection à Clostridium difficile (CDI) en utilisant une souche cliniquement pertinente et génétiquement traitable, R20291. L&#39; accent mis sur la surveillance clinique de la maladie, C. énumération bactérienne difficile, la toxine cytotoxicité, et des changements histopathologiques tout au long de CDI dans un modèle de souris sont détaillés dans le protocole.

Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

L'objectif général de ce protocole est de fournir un guide étape par étape pour la mise en œuvre du modèle murin de Clostridium difficile utilisant la cefopérazone, en mettant particulièrement l'accent sur la surveillance de la maladie clinique, le dénombrement bactérien, la cytotoxicité des toxines et les modifications histopathologiques après le défi. Ce protocole détaillé aidera les chercheurs à exécuter avec précision un modèle murin d'infection à Clostridium difficile, ce qui est essentiel pour étudier la pathogenèse de cette bactérie et évaluer de nouvelles thérapies. Le principal avantage de l'utilisation de ce modèle murin est qu'une exposition à un seul antibiotique pendant cinq jours rend les souris sensibles à la colonisation par C. difficile et à un cours clinique prolongé de l'infection, similaire à la maladie humaine.Pour commencer, prenez la souche de C.difficile d'intérêt et vortexez. Dans une hotte à flux laminaire, diluez la souche dans de l'eau stérile dans un tube à vis de manière à obtenir une concentration de dix puissance cinq spores par 25 microlitres. Étiquetez le mélange comme inoculum de spores et placez le tube dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pend

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Winston, J. A., et al. Modèle murin traité par Cefoperazone de souche cliniquement pertinente de Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre la procédure d’inoculation des souris pré-traitées par antibiotiques avec des spores de Clostridium difficile afin d’établir un modèle murien d’infection pour étudier la pathogenèse et les réponses de l’hôte.

Établissement d’un modèle murin de l’infection à Clostridium difficile

Source : Winston, J. A. et al. Modèle murin traité par Cefoperazone de souche cliniquement pertinente de Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo démontre la quantification de Clostridium difficile dans des échantillons fécaux issus d’un modèle murin infecté à l’aide de techniques de culture sélective. Il décrit les procédures de collecte d’échantillons, de traitement anaérobie, de dilution en série et d’énumération des colonies afin d’évaluer la colonisation bactérienne et...

Quantification de Clostridium difficile dans des échantillons fécaux à partir d’un modèle de souris infectée

Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude des infections bactériennes entériques ainsi que l'hôte réponses immunitaires et la colite chez la souris. Ce protocole décrit la mesure du intégrité de la barrière, la charge de pathogènes et les dommages histologiques permettant la caractérisation approfondie des contributions pathogène et de l'hôte à la colite infectieuse murin.

La<em&gt; Citrobacter rodentium</emModèle de souris&gt;: Étudier Contributions des agents pathogènes et l&#39;hôte de la colite infectieuse

Imagerie multi-modalité est une approche intéressante pour l'étude de la colonisation bactérienne dans les petits modèles animaux. Ce protocole décrit l'infection de souris avec...

4D imagerie multimodalité des<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infections chez les souris

La capacité à modéliser les infections des voies urinaires (IVU) est cruciale pour pouvoir comprendre la pathogenèse bactérienne et favoriser le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce travail est de démontrer des modèles murins d’infections urinaires expérimentales et d’infections urinaires associées à un cathéter qui récapitulent et prédisent les résultats observés chez l’homme.

Création et caractérisation de l&#39;UTI et Cauti dans un modèle de souris

L’efficacité des antibiotiques est le plus souvent déterminée en effectuant des études cinétiques de destruction et en mesurant les unités formant colonies (UFC). En intégrant la microscopie électronique à balayage (MEB) à ces méthodes standard, nous pouvons distinguer les effets pharmacologiques du traitement entre différents antibiotiques.

Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En réponse au traitement antibiotique

Ici, nous décrivons une méthode pour induire la méningite méningococcique par une voie intracisternal d'infection chez les souris adultes. Nous présentons un protocole étape par étape de l'infection méningococcique de la préparation de l'inoculum à l'infection intracisternal ; enregistrez ensuite la survie animale et évaluez les charges bactériennes dans les tissus murines.

Induire la méningite méningococcique Sérogroupe C chez les souris par l'intermédiaire de la livraison intracisternal

Un modèle murin d’inoculation transurétrale d’E. coli uropathogène (UPEC) pour établir des réservoirs de vessie intracellulaire latents et une exposition ultérieure de la vessie à G. vaginalis pour induire une infection urinaire UPEC récurrente est démontré. Le dénombrement des bactéries, la cytologie de l’urine et la fixation et le traitement in situ de la vessie pour la microscopie électronique à balayage sont également démontrés.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Ici, nous présentons un protocole pour établir le modèle murin de colite induite par le sulfate de dextran sans germes pseudo-germes induits par des antibiotiques afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans la régulation des effets positifs de Bacillus cereus sur la colite.

Étude des effets atténuants de l’administration de Bacillus cereus sur la colite par la modulation du microbiote intestinal

La naissance prématurée (accouchement &lt; 37 semaines) est un problème de santé mondial urgent, avec des options de prévention et de traitement sous-optimales. Nous présentons un modèle murin d’accouchement prématuré induit par une infection bactérienne vaginale ascendante et décrivons comment analyser la morbidité et la mortalité néonatales qui en résultent.

Modélisation de l’infection vaginale ascendante, de l’accouchement prématuré et de la morbidité néonatale chez la souris

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la colonisation de souris avec pks+ Escherichia coli dans des conditions non inflammatoires, ainsi que des méthodes non invasives pour la validation de la colonisation et l’évaluation de l’expansion de pks+ E. coli dans les selles.

Colonisation avec Escherichia coli murine pks+ dans des conditions non inflammatoires

Découvrez le modèle murin à la céfopérazone pour étudier l'infection à Clostridium difficile avec la souche R20291. Ce protocole détaillé permet de surveiller la progression clinique, d'évaluer la charge bactérienne et d'analyser les changements histopathologiques.

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