Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes

L'objectif général de ce protocole est de fournir un guide étape par étape pour la mise en œuvre du modèle murin de Clostridium difficile utilisant la cefopérazone, en mettant particulièrement l'accent sur la surveillance de la maladie clinique, le dénombrement bactérien, la cytotoxicité des toxines et les modifications histopathologiques après le défi. Ce protocole détaillé aidera les chercheurs à exécuter avec précision un modèle murin d'infection à Clostridium difficile, ce qui est essentiel pour étudier la pathogenèse de cette bactérie et évaluer de nouvelles thérapies. Le principal avantage de l'utilisation de ce modèle murin est qu'une exposition à un seul antibiotique pendant cinq jours rend les souris sensibles à la colonisation par C. difficile et à un cours clinique prolongé de l'infection, similaire à la maladie humaine.

Pour commencer, prenez la souche de C.difficile d'intérêt et vortexez. Dans une hotte à flux laminaire, diluez la souche dans de l'eau stérile dans un tube à vis de manière à obtenir une concentration de dix puissance cinq spores par 25 microlitres. Étiquetez le mélange comme inoculum de spores et placez le tube dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, dans la hotte à flux laminaire, pipeter 50 microlitres de l'inoculum de spores chauffé dans un tube stérile de microcentrifugation et le transférer dans la chambre anaérobie jusqu'à utilisation ultérieure. Charger le reste de l'inoculum de spores dans une seringue d'un millilitre fixée à une canule stérile pour gavage gastrique à embout souple. Dans la hotte à flux laminaire, prendre une souris soumise à l'expérience et immobiliser sa tête en maintenant délicatement l'animal par la peau lâche du cou et du dos.

À l’aide de l’index, et en veillant à ce que l’animal ne vocalise pas ni ne manifeste de signes de détresse, immobiliser davantage la tête de l’animal et allonger l’œsophage. Maintenir la souris en position verticale, droite, puis introduire délicatement l’aiguille de gavage sur le côté de la bouche. Diriger l’aiguille de gavage le long de la voûte palatine et l’avancer lentement dans l’œsophage.

Lorsque l'aiguille est insérée d'environ la moitié dans l'œsophage, injectez 25 microlitres d'inoculum de spores, puis retirez délicatement l'aiguille. Replacez l'animal dans sa cage et observez-le afin de détecter tout signe de toux ou de détresse respiratoire, qui pourrait indiquer une administration accidentelle dans la trachée. Ensuite, prenez l'aliquot d'inoculum de spores précédemment conservé dans la chambre anaérobie, ainsi que l'inoculum de spores restant utilisé pour la gavage, et effectuez des dilutions sérielles de un à dix dans 180 microlitres de PBS 1x.

Effectuez quatre à cinq de ces dilutions. En utilisant une technique aseptique, transférez 100 microlitres de chaque dilution sériée dans une plaque TCCFA individuelle. En prenant à chaque fois un nouveau porte-échantillon stérile en forme de L, répartissez uniformément les inoculums de dilution sur chaque plaque.

Incuber les boîtes de Pétri dans des conditions anaérobies pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Enfin, compter les colonies de C.difficile sur chaque boîte de dilution et calculer les unités formant des colonies afin d'obtenir la dose infectieuse administrée aux souris. Pour prélever des échantillons fécaux chez les souris en vue d'une évaluation, immobiliser d'abord légèrement mais fermement la souris par la peau lâche du cou et du dos, en veillant à ce que l'animal ne soit pas en détresse.

À l’aide du petit doigt, soulevez délicatement la queue de l’animal afin d’exposer l’anus. Tenez un tube stérile de microcentrifugeuse de poids connu directement sous l’anus de l’animal, en veillant à ce que le tube ne touche pas directement la souris. Lorsque l’animal défèque, recueillez la pastille fécale dans le tube.

Conserver le tube à température ambiante jusqu'à ce que tous les échantillons nécessaires soient collectés. Peser les tubes contenant les selles sur une balance analytique et noter la masse avec quatre décimales. Calculer le poids du culot fécal en soustrayant le poids du tube.

Ensuite, effectuez une dilution de un à dix du contenu et resuspendez dans du PBS 1x. Utilisez la pointe de la pipette pour disperser délicatement les matières fécales dans la solution. Incubez les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes, en laissant le contenu se déposer.

En maintenant les solutions en conditions anaérobies, effectuez des dilutions sériées pour chaque échantillon dans du PBS 1x. Transférez 100 microlitres de chaque dilution sériée sur des boîtes de gélose TCCFA. Utilisez un étaleur stérile en forme de L et appliquez uniformément le milieu sur les boîtes.

Incuber les plaques dans des conditions anaérobies à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Enfin, dénombrer les colonies de C.difficile et calculer l'unité formant colonie par gramme de contenu fécal. Cette figure montre le poids des souris dans les jours suivant une infection par C.difficile R20291.

Au jour zéro, le poids de base est fixé à 100. Le poids corporel moyen des souris a été mesuré chaque jour par la suite, pendant 14 jours. Une diminution significative du poids a été observée chez les souris infectées entre les jours deux et sept après l'infection.

Les souris semblaient s'être remises et avoir regagné du poids à partir de ce moment. Ici, la charge de C. difficile dans les selles dans les jours suivant le défi est indiquée. À 24 heures après le défi, toutes les souris étaient colonisées avec 10 à la puissance sept UFC par gramme de selles.

Cette charge avait diminué à partir du septième jour, bien que C. difficile soit encore présent. L'examen histopathologique des souris au cours de l'infection a révélé les changements pathologiques les plus marqués au niveau du cæcum. Les scores histologiques totaux du cæcum différaient significativement entre le jour zéro et les jours deux et quatre après l'inoculation.

En général, les personnes novices avec ce modèle murin peuvent éprouver des difficultés avec le calcul et la préparation de l'inoculum de spores utilisé pour infecter les souris, ainsi qu'avec le calcul de la charge bactérienne fécale de C.difficile. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de garder à l'esprit que des modifications de la dose ou de la souche de spores de C.difficile administrées aux souris peuvent modifier l'issue de ce modèle.