Céfopérazone traité Souris Modèle de Cliniquement pertinentes Clostridium difficile Strain R20291

L’objectif global de ce protocole est de fournir un guide étape par étape pour la mise en œuvre du modèle murin de céfopérazone de l’infection à Clostridium difficile, en mettant l’accent sur la surveillance clinique des maladies, le dénombrement des bactéries, la cytotoxicité des toxines et les changements histopathologiques après la provocation. Ce protocole détaillé aidera les chercheurs à exécuter avec précision un modèle murin d’infection à Clostridium difficile, ce qui est essentiel pour étudier la pathogenèse de cette bactérie et accéder à de nouveaux traitements. Le principal avantage de l’utilisation de ce modèle murin est que l’exposition à un antibiotique pendant cinq jours rend les souris vulnérables à la colonisation par C. difficile et à une évolution clinique prolongée de l’infection en même temps qu’une maladie humaine.

Pour commencer, prenez la souche d’intérêt et vortex de C. difficile. Dans une hotte à flux laminaire, diluer le stock dans de l’eau stérile dans un tube à bouchon à vis jusqu’à une concentration de dix à cinq spores par 25 microlitres. Étiquetez le mélange comme inoculum de spores et placez le tube dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, dans la hotte à flux laminaire, pipetez 50 microlitres de l’inoculum de spores chauffé dans un tube de microcentrifugation stérile et passez-le dans la chambre anaérobie jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement. Chargez l’inoculum de spores restant dans une seringue d’un millilitre attachée à une aiguille de gavage gastrique à bulbe stérile. Dans une hotte à flux laminaire, prenez une souris sujette et immobilisez la tête en retenant doucement l’animal par la peau lâche du cou et du dos.

À l’aide de l’index et en vous assurant que l’animal ne vocalise pas ou ne montre pas de signes de détresse, immobilisez davantage la tête de l’animal et allongez l’œsophage. Maintenez la souris en position verticale et verticale et passez doucement l’aiguille de gavage sur le côté de la bouche. Dirigez l’aiguille de gavage le long du toit de la bouche et faites-la avancer lentement dans l’œsophage.

Une fois que l’aiguille est à peu près à mi-chemin dans l’œsophage, injectez 25 microlitres d’inoculum de spores, puis retirez doucement l’aiguille. Remettez l’animal dans sa cage et observez-le pour tout signe de toux ou de détresse respiratoire qui pourrait indiquer une administration trachéale par inadvertance. Ensuite, prenez l’aliquote de l’inoculum de spores stockée précédemment dans la chambre anaérobie, et tout inoculum de spores de gavage restant, et faites une à dix dilutions en série dans 180 microlitres de 1x PBS.

Effectuez quatre à cinq de ces dilutions. À l’aide d’une technique aseptique, transférez 100 microlitres de chaque dilution en série dans une plaque TCCFA individuelle. En prenant à chaque fois un nouvel écarteur stérile en forme de L, répartissez uniformément l’inoculum de dilution sur chaque plaque.

Incuber les plaques dans des conditions anaérobies pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Enfin, comptez les colonies de C. difficile sur chaque plaque de dilution et calculez les unités formant colonies pour obtenir la dose infectieuse administrée aux souris. Pour prélever des échantillons fécaux de souris à des fins d’évaluation, retenez d’abord légèrement mais fermement la souris concernée par la peau lâche du cou et du dos, en vous assurant que l’animal n’est pas en détresse.

À l’aide du petit doigt, soulevez doucement la queue de l’animal, exposant l’anus. Tenez un tube de microcentrifugation stérile de poids connu directement sous l’anus de l’animal, en vous assurant que le tube ne touche pas directement la souris. Lorsque l’animal défèque, recueillez les boulettes fécales dans le tube.

Conservez le tube à température ambiante jusqu’à ce que tous les échantillons nécessaires soient prélevés. Pesez les tubes contenant des matières fécales sur une balance analytique et notez la masse à quatre décimales. Calculez le poids de la boule fécale en soustrayant le poids du tube.

Ensuite, calculez une dilution de un à dix du contenu et mettez à nouveau en suspension dans 1x PBS. Utilisez l’extrémité de la pipette pour perturber doucement la matière fécale en solution. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes, en laissant le contenu se déposer.

En maintenant les solutions en anaérobie, faites des dilutions en série pour chaque échantillon dans 1x PBS. Transférez 100 microlitres de chaque dilution en série sur des plaques TCCFA. Utilisez un épandeur stérile en forme de L et appliquez uniformément le milieu sur les plaques.

Incuber les plaques dans des conditions anaérobies à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Enfin, énumérez les colonies de C. difficile et calculez l’unité formant la colonie par gramme de contenu fécal. Cette figure montre le poids de la souris dans les jours suivant l’invocation par C. difficile R20291.

Au jour zéro, le poids de référence est fixé à 100. Le poids corporel moyen des souris a été mesuré chaque jour suivant, pendant 14 jours. Une diminution significative du poids a été observée chez les souris exposées du deuxième au septième jour suivant la provocation.

Les souris ont semblé récupérer et reprendre du poids après ce point. Ici, la charge de C. difficile dans les matières fécales dans les jours suivant le défi est montrée. 24 heures après le provocation, toutes les souris ont été colonisées avec 10 à 10 à 10 UFC par gramme de matières fécales.

Cette charge avait diminué à partir du septième jour, bien que C. difficile soit toujours présent. L’examen histopathologique des souris au cours de l’infection a montré les changements pathologiques les plus significatifs dans le caïcum. Les scores histologiques cæcaux totaux étaient significativement différents entre le jour zéro et les jours deux et quatre après la provocation.

En général, les individus qui ne connaissent pas ce modèle de souris peuvent avoir de la difficulté à calculer et à préparer l’inoculum de spores utilisé pour défier les souris et à calculer la charge bactérienne fécale de C. difficile. Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de se rappeler que les modifications de la dose ou de la souche de spores de C. difficile administrées à des souris peuvent modifier le résultat de ce modèle.