Name: Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez l'assemblage du protéasome par coexpression de sous-unités et mélange post-lyse avec PAGE non dénaturant. Cette méthode permet d'analyser rapidement les intermédiaires d'assemblage pour la biologie moléculaire.

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Ce travail a été soutenu en partie par un soutien des fonds de subvention de la recherche (RSFG) de l&#39;Indiana University-Purdue, Indianapolis, et en partie par un prix de l&#39;American Heart Association 14GRNT20390154, à ARK

1. Expression bactérienne. Nota: Les plasmides d&#39;expression utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 1. Solutions, les médias et les tampons utilisés dans cette étude sont décrits dans le tableau 2. Le clonage des gènes de sous - unités du protéasome archées et la génération de plasmides d&#39;expression sont décrits ailleurs 18,20. En bref, des plasmides pour coexpression recombinant de sous - unités emploient une stratégie de opéron bicistronique qui aide à obtenir des niveaux d&#39;expression comparables de sous - unités individuelles 18,20. Les paramètres d&#39;expression énumérés ci-dessous ont été déterminées de façon empirique comme étant optimale pour les sous-unités du protéasome dans cette étude. Il peut être nécessaire pour optimiser l&#39;expression d&#39;autres mutants protéasome, pour proteasomes d&#39;autres espèces d&#39;archées, ou pour d&#39;autres complexes de protéines recombinantes (voir Discussion). <ol><li> Transformer le plasmide d&#39; expression d&#39;intérêt dans chimiquement compétente E.coli BL21 (DE3). </li><li> Ajouter 1 - 2 pi de plasmide (généralement 50 - 100 ng) à une aliquote de cellules DE3 qui ont été fraîchement décongelé sur de la glace, et de continuer à incuber sur de la glace pendant 20 min. </li><li> Le choc thermique des cellules à 42 ° C pendant 45 s et le tube de retour à la glace pour additionl 2 min. </li><li> Ajouter 1 ml de milieu LB et on incube à 37 ° C sous agitation (150 tpm) pendant 1 h. </li><li> Étaler 1-200 ul du mélange de transformation sur du milieu LB-kan plaques (plaques contenant du milieu LB solide, additionné de kanamycine (tous les plasmides utilisés dans cette résistance de codage d&#39;étude à cet antibiotique)). Incuber les plaques à 37 ° C O / N. </li><li> Le lendemain, inoculer une seule colonie de la plaque de LB-kan dans 3 ml de liquide milieu LB-kan dans un tube de culture en verre. Incuber à 37 ° C sous agitation (150 rpm) pendant environ 2,5 à 3 h, ou jusqu&#39;à ce que la turbidité est observée. </li><li> Mesurer la densité optique de la culture à 600 nm (DO 600) dans un spectrophotomètre. Diluer le culte cellulaireure avec une quantité appropriée de milieu LB préchauffée-KAN à une DO 600 de 0,4 dans un volume final de 6 ml. Reprendre agitation à 37 ° C pendant 40 min. </li><li> Induire l&#39;expression des protéines dans les cultures liquides en ajoutant IPTG à partir d&#39;une solution mère à une concentration finale de 1 mM. Incuber à 37 ° C sous agitation (150 rpm) pendant environ 6-7 h. </li><li> Récolte des cultures de cellules bactériennes dans leur intégralité dans 1,5 ml microtubes. </li><li> Ajouter 1,5 ml d&#39;une culture dans le tube à centrifuger. Centrifugeuse à 10.000 x g pendant 1 min. </li><li> Jeter le surnageant et on ajoute encore 1,5 ml de la même culture de la pastille. Centrifugeuse à 10.000 x g pendant 1 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.11 jusqu&#39;à ce que toute la culture est récolté dans le tube à centrifuger. </li><li> Stocker les pastilles induites à -80 ° C jusqu&#39;à ce que la lyse. </li></ol> 2. Lyse bactérienne et Lysat de mélange. Remarque: </strong&gt; Pour les échantillons étudiés par coexpression, suivez la section 2.1 (et ses sous-sections). Pour les échantillons nécessitant lysat mélange, suivez la section 2.2 (et ses sous-sections). L&#39;analyse TSP (Total, soluble, Pellet) qui est inclus dans le protocole est utile pour optimiser l&#39;expression des protéines qui peuvent aider à assurer que des quantités à peu près égales de sous-unités a et ß sont combinés lors de lysat de mélange (voir Discussion). Il fournit également un contrôle important si les résultats en aval ne sont pas comme prévu (il vérifie que la protéine a été exprimée et soluble). Ainsi, nous recommandons fortement, y compris l&#39;analyse de TSP initialement. Une fois un protocole optimal a été atteint pour une combinaison de sous-unité particulière, l&#39;analyse TSP est pas strictement nécessaire, ce qui est la raison pour laquelle il est décrit comme option ci-dessous. <ol><li> La lyse des cellules bactériennes et de préparation de fractions solubles. <ol><li> Décongeler le culot cellulaire induite par de la glace pendant 5 min. Remettre en suspension le culot dans 600 pl de tampon de lyse. </li><li> IncUbate la suspension à 30 ° C sous agitation (150 rpm) pendant 30 min pour générer lysat brut au total. Remarque: L&#39;étape suivante et le paragraphe qui suit sont facultatifs. </li><li> Retirer les deux 25 aliquotes ul du lysat brut totale dans 1,5 ml microtubes séparés et effectuer une analyse de TSP comme suit. <ol><li> L&#39;une des deux aliquotes de 25 ul, ajouter du tampon d&#39;échantillon SDS 5X à une concentration finale de 1X. Etiqueter le tube avec &quot;T&quot; pour &quot;lysat brut total». </li><li> Incuber l&#39;échantillon &quot;T&quot; à 100 ° C pendant 5 min pour dénaturer complètement les protéines. </li><li> Pendant ce temps, prendre la deuxième partie aliquote de 25 pi et centrifuger à 10000 × g pendant 10 min. Retirez délicatement le surnageant sans perturber le petit culot, et le transférer dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 ml. Nommez ce nouveau tube &quot;S&quot; pour &quot;fraction soluble&quot;. </li><li> Pour les behi minuscules granulés gauchee à l&#39;étape précédente, ajouter 25 ul de tampon de lyse et le vortex pour remettre en suspension. Nommez ce tube &quot;P&quot; pour &quot;fraction de culot&quot;. </li><li> Ajouter 6 tampon d&#39;échantillon pl de 5X SDS aux tubes et &quot;S&quot; &quot;P&quot; et incuber à 100 ° C comme décrit ci-dessus. Remarque: Si les échantillons TSP ne seront pas utilisés ce jour - là pour analyser l&#39; expression, ils peuvent être congelés à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Une fois décongelé, elles doivent être remises à incuber à 100 ° C, comme décrit ci-dessus, immédiatement avant le chargement sur un gel SDS-PAGE standard de 12% et / ou 15%. </li></ol></li><li> Bien que l&#39;analyse de TSP est effectuée, centrifugeuse 550 pi restante de lysat brut totale (ou la totalité de 600 pi de lysat brut total si l&#39; analyse TSP est pas effectuée) à 10.000 x g pendant 10 min. Recueillir le surnageant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ceci est le lysat soluble qui sera utilisé pour la purification. </li></ol></li><li> Lysat mélange. <ol><li> Effectuer la lyse comme décrit dans les étapes 2.1.1 et 2.1.2 ci-dessus. </li><li> Mélanger 600 pi de lysat brut total provenant de bactéries exprimant la sous-unité α désiré avec 600 pi de lysat brut total provenant de bactéries exprimant la sous-unité β souhaitée. Incuber à 37 ° C avec une lente agitation pendant 30 min. Remarque: Il peut être nécessaire d&#39;optimiser le temps d&#39;incubation pour obtenir l&#39; assemblage maximum pendant lysat de mélange (voir Discussion). Le temps et la température présentée ici sont optimales pour les protéines recombinantes dans cette étude et ont été déterminées ailleurs 18. </li><li> Centrifuger le lysat mélangé à 10 000 xg pendant 10 min pour séparer les matières solubles du culot insoluble. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Utilisez ce lysat soluble mixte pour la purification des protéines. </li></ol></li></ol> 3. Purification de la protéine par affinité Immobilisé cobalt Résine(I VOITURE). <ol><li> Equilibrer la résine. <ol><li> Remettre en suspension soigneusement la résine en retournant la bouteille et le transfert de 50 ul de la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 700 x g pendant 2 min à la résine de granules. Aspirer soigneusement surnageant. Note: Nous réalisons l&#39; aspiration de la pipette en utilisant une pointe de 1 ml de pipette bleu pour éliminer la majeure partie du liquide. Une pointe de 2 pi blanc est utilisé pour un contrôle fin de l&#39;enlèvement du surnageant restant, laissant une très mince couche de liquide recouvrant les perles. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon A. Mélanger doucement pour remettre en suspension la résine et centrifuger à 700 x g pendant 2 min pour sédimenter la résine. Aspirer délicatement le surnageant et répéter cette étape de lavage une fois de plus. </li></ol></li><li> Appliquer lysat soluble obtenue précédemment dans la section 2.1 ou 2.2 à la résine équilibrée. Incuber le tube avec une légère rotation à 4 ° C pendant 60 min. Centrifuger le tube à 700 × g &lt;/ Em&gt; pendant 5 min et soigneusement Aspirer le surnageant. </li><li> Laver la résine comme suit pour éliminer les protéines non spécifiquement liées. <ol><li> résine Resuspendre avec 1 ml de tampon A et incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 10 min. Centrifuger le tube à 700 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. </li><li> résine Resuspendre avec 1 ml de tampon B (tampon A avec mM imidazole 5) et incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 5 min. Centrifuger le tube à 700 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. </li><li> résine Resuspendre avec 1 ml de tampon C (tampon A avec 10 mM d&#39;imidazole) et incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 5 min. Centrifuger le tube à 700 g pendant 5 min et aspirer soigneusement le surnageant. </li></ol></li><li> Éluer la protéine par addition de 400 ul de tampon E (tampon A avec 200 mM d&#39;imidazole) to la résine. Incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 5 min. Centrifuger à 700 g pendant 5 min. </li><li> Transférer le surnageant contenant la protéine purifiée dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 ml. </li><li> Dessaler la protéine purifiée par centrifugation série comme suit. <ol><li> 400 ul de protéine purifiée, ajouter 100 pi de tampon A (ce qui réduit la concentration de 200 mM d&#39;imidazole à 160 mM). Appliquer la protéine purifiée à 0,5 ml filtres ultracentrifugation avec 10 kDa de poids moléculaire de coupure. Centrifugeuse à 14000 × g pendant 5 min. </li><li> Jeter le filtrat et ajouter 400 ul de tampon A à diluer le rétentat et centrifuger à nouveau. Continuer les cycles de centrifugation / dilution jusqu&#39;à ce que la concentration en imidazole tombe en dessous de 4 mM. A titre d&#39;exemple, si chaque centrifugation, 500 ul concentre jusqu&#39;à ~ 70 pl (soit environ 7 fois), puis deux cycles permettra de réduire la concentration de 160 mM d&#39;imidazole de départ (7 x 7 = 49 fois) à APPRoximately 3,3 mM. </li><li> Mesurer la concentration en protéines de l&#39;échantillon dessalé en utilisant le dosage BCA 21. Remarque: Le dessalage est nécessaire pour réduire les niveaux Imidazole dessous de la limite de tolérance pour le dosage BCA, comme décrit dans les instructions du fabricant. Notre laboratoire préfère le dosage BCA, car il est sensible, a une grande gamme dynamique, et présente beaucoup moins de variation de protéine à la protéine. Cependant, d&#39;autres méthodes pour déterminer la concentration en protéine peut être remplacé par le test de BCA. La clé est d&#39;être conscient des avantages et des limites de chaque méthode. </li></ol></li><li> Ajouter un tampon d&#39;échantillon natif 5X à une concentration finale de 1X et procéder à une électrophorèse. Vous pouvez également conserver les échantillons à -20 ° C pour une analyse ultérieure. </li></ol> 4. dénaturant gel de polyacrylamide électrophorèse (PAGE). Attention: acrylamide non polymérisé est une neurotoxine. Porter gea de protection appropriér. <ol><li> Préparer le gel dénaturant PAGE de la manière suivante. <ol><li> Préparer la cassette de gel pour la coulée en utilisant des plaques de verre propres et de coulée stand. Placez le fabricant gradient au-dessus d&#39;un petit agitateur magnétique et placer une barre d&#39;agitation minuscule dans chaque chambre. </li><li> En utilisant 40% (p / v) d&#39;acrylamide et de 2% (p / v) de solutions mères bisacrylamide, de préparer 5% et 10% (p / v) de solutions de gel d&#39;acrylamide dans un tampon la résolution native. Veiller à ce que le rapport de l&#39;acrylamide à bisacrylamide totale est de 37,5: 1. Frissons sur la glace avant la coulée. Remarque: Le système dénaturant PAGE utilisé ici est essentiellement identique au système SDS-PAGE Laemmli, avec SDS omis 22. </li><li> Ajouter Ammonium Persulfate (de 10% (p v) solution / mère préparée dans de l&#39;eau) pour les solutions d&#39;acrylamide pour amorcer la polymérisation. La concentration finale de persulfate d&#39;ammonium est de 0,1% (p / v). </li><li> Verser la solution d&#39;acrylamide dans les deux chambres de la machine à gradient. Avec le b tubulure de sortie inséréntre les plaques de la cassette de gel, d&#39;activer l&#39;agitateur magnétique et d&#39;ouvrir les vannes à gradient de fabricant. Verser le 5 - gel à gradient dénaturant de 10%. </li><li> Une fois coulé, recouvrir le gel avec une couche mince d&#39;alcool isopropylique et laisser le gel se polymériser pendant 30 minutes. Pendant ce temps, préparer la solution de gel d&#39;acrylamide à 5% frais dans un tampon natif résoudre. Après les jeux de gel, verser Isopropanol et rincer la partie supérieure du gel avec de l&#39;eau déminéralisée à partir d&#39;une bouteille d&#39;injection. </li><li> A la solution de gel 5% préparée ci-dessus, ajouter Persulfate d&#39;ammonium (exactement comme décrit dans 4.1.3) et verser sur le dessus du gel polymérisé jusqu&#39;à ce que les plaques de verre sont pleines. Insérez un peigne de gel. Laisser le gel de superposition polymériser pendant 30 minutes supplémentaires. </li><li> Une fois que le gel est polymérisé, assembler la cassette de gel dans l&#39;appareil d&#39;électrophorèse. Vous pouvez également stocker le gel à 4 ºC, enveloppé dans des serviettes en papier humides et une pellicule de plastique jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Une fois que le gel de PAGE non dénaturant est assemblé dans elecappareil de phorèse, remplir le réservoir avec un tampon de fonctionnement natif 1X fraîchement préparés à partir d&#39;un tampon 10X de fonctionnement natif stock. </li><li> Charge 10 pg de protéine purifiée, obtenue à la fin de l&#39;article 3, dans chaque puits à l&#39;aide d&#39;une seringue en verre. </li><li> Charge 2 ul d&#39;étalon de poids moléculaire élevé native de la protéine (dilué dans du tampon de fonctionnement natif 1X) dans l&#39;un des puits. </li><li> Exécutez gel à 55 V et 4 ºC jusqu&#39;à ce que le front de colorant coule le gel (environ 4 à 4,5 h). </li><li> En plus du gel non dénaturant, l&#39; analyse des aliquotes de la protéine purifiée par SDS-PAGE 22 norme. <ol><li> Mélanger aliquotes (10 ug) des échantillons de protéines purifiées, obtenues à la fin de l&#39;article 3, avec un tampon 5X SDS-échantillon à une concentration finale de 1X. </li><li> Incuber à 100 ° C pendant 5 min et charger sur la norme de 12% et / ou 15% des gels SDS-PAGE 22. </li><li> Exécutez à 80V pendant 20 min, puis à 120 V jusqu&#39;à ce que le front de colorant coule le gel (ce qui est d&#39;environ un additional 75 min pour un gel à 12% et 120 min pour un gel à 15%). </li></ol></li></ol> Activité 5. Visualisation et coloration des protéines. <ol><li> Après électrophorèse, les plaques de verre soigneusement séparé et transférer le gel non dénaturant à une plaque de gel contenant 50 ml d&#39;eau déminéralisée. Rincer gel avec doux balancement pendant 5 min. Jeter l&#39;eau et répétez cette étape de lavage à trois reprises. </li><li> Effectuer test de recouvrement de substrat comme suit. <ol><li> Ajouter 1 ml de tampon de développement contenant le substrat peptidique fluorogène Suc-LLVY-AMC et étaler uniformément sur le gel. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. Remarque: une tige de verre ou d&#39; un agent libérant de gel (petit coin de plastique utilisé pour les plaques de verre séparées) peuvent être utilisées pour répartir le liquide sur le gel. </li><li> transférer soigneusement le gel sur le transilluminateur UV du système d&#39;imagerie de gel et d&#39;observer la fluorescence due au substrat peptidique clivé. image Record. Soigneusement transférer les ba de gelck sur le plateau de gel. </li><li> Rincer le gel deux fois avec 50 ml d&#39;eau déminéralisée pendant 5 min avec doux balancement. </li><li> Colorer le gel avec 10 ml d&#39;un réactif de Coomassie tache colloïdale pendant 60 min avec doux balancement. gel de Destain avec 50 ml d&#39;eau jusqu&#39;à ce fond devient clair. Cette étape de coloration applique aux gels SDS-PAGE standard ainsi. </li></ol></li></ol>

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<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Chen, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocatalytic+subunit+processing+couples+active+site+formation+in+the+20S+proteasome+to+completion+of+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly.</a> Cell. 86, 961-972 (1996).</li>
<li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li>
<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous démontrons au profit d&#39;une approche combinée à l&#39;analyse de l&#39;assemblage du protéasome par dénaturants PAGE en utilisant proteasomes archées recombinantes. La méthode habituelle 9,11 de coexpression bactérienne des sous - unités du protéasome permet une analyse rapide , mais peut ne pas révéler des intermédiaires d&#39;assemblage clés. Nous vous suggérons de combiner coexpression avec lysat de mélange pour développer une image plus large des événements de l&#39;Assemblée. <p class="jove_c...

Complexes multiprotéiques effectuent de nombreuses activités cellulaires critiques 1. Pour beaucoup de ces complexes, beaucoup plus on connaît leur structure et leur fonction que de leur assemblage 2,3. Le protéasome est un tel complexe et se retrouve dans tous les domaines de la vie. Chez les eucaryotes, cette machine moléculaire est au cœur du système protéasome / Ubiquitin (UPS) et fournit la principale voie de dégradation des protéines intracellulaires 4. Le protéasome eucaryote (dénommé protéasome 26S) est composé de deux ensembles principaux sous: un protéasome 20S, ou Core particules (CP) 5, qui peut être coiffé sur une ou deux extrémités par une particule réglementaire 19S (RP) 6. Le protéasome 20S est une grande protéase compartimentée. Sa structure quaternaire est complètement conservée dans tous les domaines de la vie et se compose d&#39;un empilement de quatre cycles à sept chaînons contenant au moins deux types de sous-unités de structure apparentée, α; et ß 5,7,8. Chez les eucaryotes, les deux bagues extérieures sont chacune composées de sept sous-unités a différentes et les deux bagues intérieures sont constitués chacun de sept sous-unités ß distinctes; une activité protéolytique réside dans trois des sous-unités ß. En revanche, les anneaux de CP de archéobactéries et des bactéries sont habituellement constituées d&#39;un seul type de α et une sous-unité β type. Proteasomes Archaea ont fourni un important système modèle pour étudier l&#39; assemblage du protéasome due à la fois à leur simplicité de composition et de leur partager un mécanisme d&#39;assemblage commun avec leurs homologues eucaryotes 9-13. En bref, les sous-unités alpha assemblent en anneaux d&#39;a d&#39;abord, qui servent comme un échafaudage sur lequel ß sous-unités se rassemblent. Les demi-protéasomes résultant (α 7 β 7) dimériser, donnant lieu à des entièrement assemblés CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Au cours de la dimérisation, les propeptides présents sur les sous-unités ßsont enlevées par voie autocatalytique, ce qui expose les thréonines catalytique N-terminal. L&#39;utilisation des protéasomes archéobactéries pour modéliser l&#39; assemblage prend souvent l&#39; avantage de la production de protéines recombinantes dans protéasome archéobactéries Escherichia coli. Cette approche est utile, car elle permet aux sous-unités à produire dans diverses combinaisons, à la fois comme WT et versions mutantes, dans un organisme hôte qui ne produit pas ses propres protéasomes. Contrôle de l&#39;assemblage des complexes multi-protéiques nécessite biochimiquement une sorte de méthode de fractionnement qui sépare les complexes entièrement assemblés à partir des intermédiaires d&#39;assemblage et de précurseurs. En raison de sa capacité de résoudre supérieure, non dénaturant sur gel de polyacrylamide L&#39; électrophorèse (PAGE) est avéré être particulièrement utile pour le fractionnement de divers grands complexes multiprotéiques 14-17. La combinaison de la production de protéasome Archaea recombinant et PAGE dénaturant est devenue une approche puissante en dissecting assemblage de protéasome 9,11,12,18. Cependant, la méthode habituelle par laquelle cette approche est appliquée ( par exemple. Par la co - expression recombinante de sous - unités a et ß) présente un inconvénient important. Les réactions de l&#39; Assemblée sont coopératifs et fortement dépendante de la concentration 3. Étant donné que la concentration de la protéine dans les cellules est très élevée 19, en raison des effets de volume exclu, les réactions d&#39;assemblage se déroulent rapidement in vivo. Il est donc possible de manquer des intermédiaires d&#39;assemblage importants lorsque a et ß sous-unités sont coexprimaient. Ici, nous plaidons pour une approche combinée à l&#39;étude de l&#39;ensemble de protéasome en utilisant des sous-unités du protéasome archées recombinantes. Dans cette approche, les deux méthodes de mélange coexpression et lysat sont utilisés. La première permet une analyse rapide de l&#39;ensemble parce coexpression est moins de travail. Celle-ci dépend de l&#39;expression séparée des sous-unités a et ß, suivi par le mélange. Bien que ce requires un peu plus d&#39;effort que coexpression, il est plus que compensée par la capacité à détecter les intermédiaires qui sont manqués pendant coexpression. Ensemble, ces deux méthodes peuvent fournir une image plus complète de l&#39;ensemble de protéasome.

<table><tbody><tr><td>Solution d’acrylamide (40 %)</td><td>Biorad</td><td>1610104 L’acrylamide</td><td>non polymérisé est une neurotoxine. Porter un équipement de protection approprié</td></tr><tr><td>Filtres centrifuges Amicon ultra 0,5 mL</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bisacrylamide (2 %)</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bleu</td> <td>de bromophénolSigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 cellules compétentes</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Réactif de coloration colloïdale de Coomassie pour gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Système de documentation du gel</td></tr><tr><td>Libérateurs de gel</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Plastique en forme de coin utilisé pour séparer les plaques de gel ; utile pour l’épandage de liquide.</td></tr><tr><td>Tige en verre</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Seringue en verre pour le chargement des</td></tr><tr><td>gels HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Kit d’étalonnage natif</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>Étalons protéiques de haut poids moléculaire</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Fabricant</td></tr><tr><td>de gradient Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>Pour l’induction de l’expression des protéines</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka analytique</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Appareil d’électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmide</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard pour SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Kit de mutagenèse Quickchange</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Substrat fluorogénique</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>Plateau d’échantillonnage UV</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>Pour l’imagerie UV des gels</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examiner assemblée protéasome avec recombinant archaeal protéasomes et dénaturant page: le cas pour une approche combinée

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Protéasomes se trouvent dans tous les domaines de la vie. Ils fournissent la principale voie de dégradation intracellulaire des protéines chez les eucaryotes, bien que leur montage ne soit pas complètement compris. Tous les protéasomes contiennent une particule de noyau structurellement conservée (CP), ou le protéasome 20S, contenant deux sous-unités ß des anneaux de heptamériques pris en sandwich entre deux anneaux de sous-unités α heptamériques. Archaea 20S protéasomes ont une composition plus simple par rapport à leurs homologues eucaryotes, mais ils partagent tous deux un mécanisme d&#39;assemblage commun. Par conséquent, 20S archées proteasomes continuent à être des modèles importants pour l&#39;assemblage du protéasome eucaryote. Plus précisément, l&#39;expression recombinante de 20S archées proteasomes couplée à l&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (PAGE) a donné de nombreuses informations sur protéasome biogenèse. Ici, nous discutons un moyen d&#39;améliorer la stratégie habituelle de coexpression des archées protéasome α et sous-unités ß avant nondenaturing PAGE. Nous démontrons que, bien que rapide et efficace, une approche de coexpression seul peut manquer des intermédiaires d&#39;assemblage clés. Dans le cas du protéasome, coexpression peut ne pas permettre la détection de la demi-protéasome, un contenant un α-anneau complet intermédiaire et un β-anneau complet. Cependant, cet intermédiaire est facilement détectée par lysat mélange. Nous suggérons que la combinaison coexpression avec lysat mélange donne une approche plus approfondie dans l&#39;analyse de l&#39;assemblage, mais il reste encore du travail non intensif. Cette approche peut être utile pour l&#39;étude d&#39;autres complexes multiprotéiques recombinantes.

Protéasome assemblage (Figure 1) commence lorsque les sous - unités alpha se combinent pour former des anneaux 9. Ceci peut être illustré lorsque a sous - unités de l&#39;archée Methanococcus maripaludis S2 sont exprimés dans E. coli C-terminale hexahistidine marqué (son-tagged) dérivés (tableau 1). Lorsque le recombinant α-sa protéine a été purifiée par ICAR et analysé par PAGE non dénaturant, deux bandes ont été observées (Figure 2A, piste...

Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l&#39;ensemble de protéasome recombinant.

Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Le but général de cette expérience est d'analyser l'assemblage d'un complexe multi-protéique tel que le protéasome, à l'aide de sous-unités recombinantes et d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturante, ou PAGE. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du protéasome, comme par exemple quelles espèces intermédiaires sont rencontrées au cours de la voie d'assemblage de ce complexe protéique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet un criblage rapide de l'assemblage selon deux approches parallèles, permettant la détection d'intermédiaires sur la voie ou hors voie. Cette procédure commence par une expression bactérienne, comme décrit dans le protocole textuel. Pour réaliser la lyse bactérienne, décongelez sur glace pendant cinq minutes le culot cellulaire induit coexprimant la combinaison souhaitée de sous-unités du protéasome. Une fois décongelé, resuspendez le culot dans 600 microlitres de tampon de lyse. Incubez la suspension à 30

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Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée

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