Name: En ligne Taille-exclusion et déchange dions chromatographie sur SAXS Beamline (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Apprenez à intégrer la chromatographie d'exclusion stérique et d'échange d'ions en ligne avec SAXS pour améliorer la qualité des données structurales. Cette méthode minimise la dénaturation des échantillons et optimise l'analyse des protéines.

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Nous remercions le soutien financier du projet par la subvention française REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 et par les subventions de recherche du Service de Santé des Armées et de la Délégation Générale pour l’Armement. Nous sommes reconnaissants à l’ESRF pour le temps de faisceau SAXS. Nous remercions Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister et Guy Schoehn pour leur soutien financier et scientifique.

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<li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li>
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<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSAXS+Sample+Changer%3A+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li>
<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour beaucoup de macromolécules, une étape de purification finale par chromatographie est nécessaire avant la collecte des données SAXS pour obtenir un bon ensemble de données de qualité. Cependant, tous les échantillons restent stables; elles peuvent être sujettes à l&#39;agrégation ou rééquilibration à un mélange d&#39;états d&#39;oligomérisation. Par conséquent, une étape de purification finale en ligne sur la ligne de lumière est nécessaire pour minimiser le temps écoulé entre la purification et de collecte de données afin d&#39;obtenir des données SAXS de la meilleure qualité. Selon les propriétés biophysiques de la protéine d&#39;intérêt, la SEC SAXS ou IEC-SAXS peuvent être choisies de manière à obtenir une qualité optimale de l&#39;échantillon. Ici, une construction de protéine dérivée de l&#39;hélicase / primase D5, deux techniques sont expliquées et discutées. Acquisition de données SEC-SAXS devient de plus en plus standardisée et est disponible sur de nombreux BioSAXS beamlines. L&#39;analyse des données, en particulier soustraction de fond, est relativement simple et facile. Cependant, un signal de tampon stable,et la séparation suffisante des espèces macromoléculaires reste essentielle. Par conséquent, il est essentiel de prévoir suffisamment de temps pour équilibrer la colonne à fond. Échec de cette méthode peut être dû à des contaminants persistants de taille similaire à la protéine d&#39;intérêt, de faibles concentrations, et les tampons sensibles aux rayonnements. Dans la pratique, au départ, la SEC SAXS est susceptible d&#39;être utilisé comme méthode de choix pour la plupart des échantillons macromoléculaires. Pourtant, de nombreux protocoles de purification nécessitent une étape CEI avant en raison de la présence de contaminants ou de l&#39;agrégation. Étant donné que chaque étape de concentration et chromatographie est associée à des pertes d&#39;échantillon (estimé à 30-50%) et le temps, directement IEC-SAXS est avantageux. Pour les échantillons qui ne peuvent être purifiés par la SEC, que ce soit en raison de la présence de &quot;contaminants&quot; de taille similaire ou parce qu&#39;ils sévèrement global aux concentrations nécessaires, IEC-SAXS serait toujours l&#39;approche mieux adaptée. En outre, les débits plus élevés soutenuspar de nombreuses colonnes IEC peuvent aider à réduire le temps de transit entre la purification et la mesure. Dans l&#39;exemple présenté ici, la CEI a été utilisé avec une élution par étape, ce qui permet la séparation des pics proches de D5 323-785 de contaminants en choisissant avec soin les étapes de concentration de sel. En principe, le nombre d&#39;étapes est illimité, mais pratiquement, au moins 1 étape par pic est nécessaire, et pas trop doit être choisi. Pour la méthode de soustraction de fond décrit ci-dessus, il est essentiel de mesurer un nombre relativement élevé de compositions tampons différents afin de trouver celui correspondant. Un inconvénient commun de ces deux techniques est le manque d&#39;information de la concentration de protéines précise. Pour cette raison, détermination de la masse précise basée sur la diffusion en avant est pas possible. Pour les protéines globulaires telles que D5 323-785, le volume Porod offre une alternative, quoique moins précis, une estimation de masse, mais pour des protéines hautement flexibles ou désordonnés, Cette approche ne serait pas valide. Une variation du gradient par étapes selon la norme IEC-SAXS présentée ici est l&#39;utilisation d&#39;un gradient linéaire à la place. Bien qu&#39;il soit possible de travailler avec autant d&#39;étapes comme souhaité pour isoler les sous-pics en utilisant une élution par étapes, dans l&#39;approche de gradient linéaire, il est nécessaire d&#39;optimiser avec soin les conditions de gradient pour séparer les pics complètement avant de commencer l&#39;SAXS expérience. Contexte soustraction dans cette approche pourrait être fait frame-sage et pourrait être vérifiée par la comparaison des images individuelles, mais elle nécessite une manipulation de données plus avancées, et un logiciel dédié n&#39;existe pas encore. Le choix d&#39;une colonne appropriée est critique pour les deux techniques, car il détermine la séparation des espèces macromoléculaires. des colonnes d&#39;exclusion de taille diffèrent en capacité de chargement, la gamme de taille de macromolécules séparables, et la résolution, tandis que les colonnes d&#39;échange d&#39;ions varie dans le genre et la densitéde leurs charges immobilisées. Bien que le protocole présenté ici est spécifique à la ligne de lumière BM29 de l&#39;ESRF, l&#39;adaptation à une autre ligne de lumière SAXS est, en principe, simple. Les principales exigences sont un flux suffisamment élevé de rayons X et un détecteur approprié (idéalement un seul comptage de photons), pour acquérir des données raisonnables signal-bruit dans la gamme de secondes ou moins, et un système de chromatographie en ligne de liquide capable de créer gradients. La mise en œuvre exacte serait, bien sûr, dépendra de l&#39;environnement de ligne de faisceau local. Les résultats obtenus sur D5 323-785 en utilisant les deux méthodes diffèrent légèrement. Le rayon de giration est légèrement plus petite pour les données d&#39;IEC que pour les données SEC et le minimum local de la courbe de diffusion sont décalés vers un peu plus grande dispersion des vecteurs. Cela signifie que le D5 323-785 mesuré avec IEC-SAXS est légèrement plus compact que le D5 323-785 mesuré avec SEC-SAXS. Cela pourrait be en raison de différences dans la préparation de l&#39;échantillon, dans le temps entre la purification et de mesure (IEC est plus rapide), ou, moins probablement, à un contaminant dans l&#39;échantillon SEC-purifié. Les modèles de perles obtenues de manière totalement indépendante avec les deux méthodes sont comparables (Figure 1 H). 323-785 D5 montre le creux, la structure attendue 18 hexamérique. En conclusion, l&#39; échange d&#39; ions en ligne et de chromatographie d&#39;exclusion stérique en ligne sont importants procédés de purification biochimiques qui peuvent être couplés directement à SAXS 6,7,9-12,25,26. La soustraction des données IEC-SAXS arrière-plan est un peu plus difficile et ambiguë que pour SEC-SAXS, mais il est néanmoins possible. Selon les propriétés biophysiques de la protéine d&#39;intérêt, à la fois SEC et IEC-SAXS permettent l&#39;optimisation de la séparation des espèces avec des avantages inhérents. Fournir l&#39;esprit que les étapes de validation (comme décrit) sont correctement observés, les données résultantes peuvent être analyséesh la confiance, et les modèles peuvent être déterminées en utilisant les outils standards disponibles dans la communauté. Ensemble, les deux techniques permettent la séparation en ligne pour une large gamme de macromolécules biologiques, fournissant des données non accessibles par des mesures statiques standard.

BioSAXS est un outil puissant pour déterminer la forme des objets de taille nanométrique 1-4. La diffusion des rayons X par une solution contenant des macromolécules, de taille dans la gamme de nm, est enregistré à très faibles angles. Cette plage angulaire contient des informations sur les paramètres globaux: le rayon de giration; la distance la plus grande intraparticulaire; forme de particules; et le degré de pliage, la dénaturation, ou d&#39;un trouble. La technique ne nécessite pas de cristaux et la macromolécule reste en solution et ne peuvent donc être conservés dans des conditions mimant certains paramètres importants de la cellule, telles que la force ionique, le pH, etc. La connaissance de ces facteurs pourrait contribuer à déterminer, par exemple, l&#39;état oligomérique physiologiquement pertinente d&#39;une protéine d&#39;intérêt ou de valider un modèle proposé d&#39;un complexe. La caractérisation des interactions protéine-protéine dans des conditions de tampon différentes, la création de modèles de domaines manquants, le raffinement des modèles d&#39;homologie, et determinaison d&#39;états pliée et dépliée discrets peut être effectuée rapidement et facilement 5. Comme toute technique, BioSAXS a des faiblesses intrinsèques: des échantillons agrégés ou dénaturées, des mélanges de particules, des échantillons hétérogènes, dégâts d&#39;irradiation, et l&#39;inadéquation des tampons peut entraîner des données non-interprétable. Pour de nombreuses méthodes d&#39;analyse, il est implicitement supposé que l&#39;échantillon est monodispersée, une exigence qui est souvent difficile à obtenir en pratique. Dans de nombreux cas, la dégradation de l&#39;échantillon est subtile et ne peut être détectée dans les données sur son propre, et toute tentative d&#39;interpréter les données donne des résultats inexacts ou même trompeurs. Pour surmonter ces obstacles, la combinaison de chromatographie d&#39;exclusion stérique (SEC) et SAXS a été mis en œuvre sur de nombreuses lignes de lumière pour assurer la qualité des données et de rendre cette technique plus accessible pour les échantillons de plus en plus difficiles 6-11. Récemment, nous avons ajouté une nouvelle méthode pour le répertoire en développant l&#39;échange d&#39;ions en ligneChromatographie (IEC) -coupled SAXS 12. Les deux techniques ouvrent SAXS à un large éventail de particules biologiques autrefois impossibles à analyser. Le choix de la méthode à utiliser dépend des propriétés biophysiques des particules d&#39;intérêt. SEC sépare les macromolécules par leur taille, de sorte qu&#39;au moins une différence de 10% de la masse moléculaire apparente est nécessaire pour la séparation. Les limites physiques de la colonne et les propriétés physiologiques des échantillons, comme des surfaces hydrophobes, la flexibilité et le manque de stabilité, compliquent également la collecte de données, l&#39;analyse et l&#39;interprétation. Chromatographie par échange d&#39;ions, qui sépare les molécules en fonction de leur charge et, par conséquent, leur affinité de liaison à la colonne CEI, peut être utilisé à la place ou en plus de la SEC. La charge totale peut être facilement manipulée en modifiant le pH, ou en faisant varier la concentration en sel du tampon, en fournissant un procédé relativement simple pour le contrôle elution des molécules de la colonne IEC. En utilisant la charge, la séparation des types et tailles de molécules similaires, qui seraient autrement difficiles à séparer, peut être effectuée régulièrement avec la CEI. En outre, la CEI a l&#39;avantage d&#39;être en mesure de traiter les échantillons dilués, permettant d&#39;éviter les étapes de concentration, qui portent le risque potentiel de dénaturation de la protéine. Malheureusement, comme la distribution de charge est très dépendante de l&#39; échantillon, la CEI nécessite une optimisation en ce qui concerne le pH et les concentrations en sel 13,14. Pour de nombreuses protéines qui sont difficiles à exprimer, purifier ou les deux, que de faibles quantités d&#39;échantillons sont disponibles pour étudier. Il est important d&#39;être efficace et de minimiser le nombre d&#39;étapes de purification et, par conséquent, les pertes. Pour cette raison, la dernière étape de purification est en ligne directement avant l&#39;acquisition de données SAXS, afin d&#39;augmenter la probabilité de la collecte d&#39;un bon ensemble de données. Ici, Nous présentons et comparer en ligne SEC-SAXS et IEC-SAXS. Les deux techniques ont été mises en œuvre sur la ligne de lumière BioSAXS BM29 à l&#39;European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) à Grenoble, France 15. En cas de test, nous avons utilisé le domaine D5N et hélicase de la protéine du virus de la vaccine D5, qui était assez difficile à analyser structurellement en utilisant d&#39;autres méthodes. Le virus de la vaccine est un membre de la famille des Poxviridae et 98% identique au virus de la variole, la cause de la petite vérole. En utilisant le système de la vaccine, nous étudions les mécanismes de réplication, en mettant l&#39;accent ici sur l&#39;essentiel D5 hélicase-primase. D5 est une protéine de 95 kDa avec un archéo-eucaryote primase (AEP) domaine N-terminal 16 suivie d&#39;une région de groupe de cystéine (res. 240-345) 16. Plus loin vers l&#39;extrémité C-terminale vient un domaine D5N (rés. 340-460), qui est toujours associée à hélicases D5 type, et enfin une superfamille 3 (SF3) domaine hélicase (rés. 460-785) 17 (Figure 1A). Le domaine hélicase de D5 construit une structure en anneau hexamérique qui est nécessaire pour la liaison étanche à l&#39;ADN. Merci aux récentes études SAXS et EM, les structures à faible résolution de la primase et les domaines d&#39;hélicase sont maintenant connus 18. Ici, nous montrons comment utiliser les techniques de chromatographie en ligne mis en place sur la ligne de lumière BioSAXS BM29 à l&#39;ESRF pour obtenir un aperçu de la structure du fragment C-terminal (résidus 323-785) de D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-dithiothreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10 % Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>acide acétique glacial</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Filtres centrifuges Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophénol bleu&nbsp ;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Colonne de dessalage</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB bouillon Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp ;</td><td>Vecteur HTb ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&nbsp ; Eurofins mwg opéron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit d’extraction de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Coloration sûre au gel d’ADN</td><td>Invitrogen life technology</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>home made</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen life technology</td><td>C404003&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R colonne&nbsp ;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle de ligne de faisceau BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>développement local</td></tr><tr><td>Logiciel Camserver</td><td>Dectris</td><td>n.a.logiciel</td> <td>de contrôle de détecteur</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programme pour aligner les modèles ab initio&nbsp ;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio programme de reconstruction de modèles</td></tr><tr><td>Programme HPLC Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programme HPLC LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Développement local</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programme, qui effectue la manipulation avec le logiciel expérimental SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td> <td>logiciel pour la visualisation</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programme pour superposer des structures 3D</td></tr><tr><td>Name</td><td>Entreprise<</td><td>strong>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac Collecteur de fractions</td><td>Système</td> HPLC Biorad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biotech</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

en ligne taille-exclusion et d&#39;échange d&#39;ions chromatographie sur saxs beamline

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biologique petit angle diffusion des rayons X (BioSAXS) est une technique puissante en biologie moléculaire et structurale utilisée pour déterminer la structure de la solution, la taille des particules et la forme, et le rapport surface-volume de macromolécules. La technique est applicable à une très grande variété de conditions de solution couvrant une large gamme de concentrations, les valeurs de pH, forces ioniques, des additifs, des températures, etc., mais l&#39;échantillon est nécessaire pour être monodispersés. Cette mise en garde a conduit à la mise en œuvre des systèmes de chromatographie en phase liquide sur beamlines SAXS. Ici, nous décrivons l&#39;intégration en amont d&#39;exclusion stérique (SEC) et Chromatographie d&#39;échange d&#39;ions (IEC) sur une ligne de lumière, différentes méthodes de fond optimale soustraction, et la réduction des données. A titre d&#39;exemple, nous décrivons comment nous utilisons sec- et IEC-SAXS sur un fragment de la protéine du virus de la vaccine essentielle D5, consistant en un domaine hélicase D5N. Nous déterminons sa forme globale et le poids moléculaire, montrant la structure hexamérique de thprotéine e.

Les résultats de l'analyse invariante sans modèle sont listés dans le tableau 1. L'analyse des données 323-785 SEC-SAXS D5 a montré une estimation de masse moléculaire ( à partir d' une analyse Porod) de 345 kDa contre 338 kDa, observée en utilisant IEC-SAXS. Les deux sont en accord avec la masse attendue de 6 fois 53,5 kDa (321 kDa) pour un hexamère. La modélisation ab initio des deux ensembles de données a été réalisée sans symétrie imposée (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3,1) et en utilisant C6 symétrie (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Comme les ajustements globaux pour les données de diffusion pour les reconstructions sont comparables dans les deux cas (figure 1D et E), C6 symétrie peut supposer. Ainsi, le modèle correspond à une structure en forme de cône hexagonal avec un canal central, qui apparaît partiellement obstruée (SEC: Figure 1F; IEC: Figure 1H). Un examen des modèles individuels avant moyennage montre que cet obstacle est susceptible d'être un artefact du processus de calcul de moyenne. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> Figure 1: SAXS analyse des données et la comparaison de D5 323 -785 (figure adapté des références 12 et 18). A) structure de domaine schématique de la protéine D5 et D5 323-785. B) Hors ligne d'échange d' ions chromatogramme avec l'indication des trois pics. Orange courbe: Absorbance à 280 nm (au), courbe bleue: pourcentage de tampon B. Les pourcentages de tampon B au niveau des pics sont indiquées. C) En ligne chromatogramme d'échange d' ions. touche de couleur comme dans B. De plus, l'intensité mesurée est indiquée en vert. La dispersion expérimentale courbe ae courbe du modèle obtenu par SEC-SAXS D) et IEC E) analyse des données de D5 323-785 calculée. Modèle F) Perle de D5 323-785 sur la base des données de la SEC et les données G) IEC. H) Superposition des modèles de la SEC et de la CEI. Les panneaux F) à H) ont été créés à l' aide d' un logiciel de visualisation moléculaire 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Paramètres de collecte de données </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Longueur d'onde (nm) </td><td> 0,99 </td></tr><tr><td> q-gamme (Å -1) </td><td> 0,0032 à 0,49 </td></tr><tr><td> Sample-détecteur Distance </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Temps d'exposition (sec) </td><td> 1 par image </td></tr><tr><td> Plage de concentration </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Température (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Détecteur </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (photons / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Taille du faisceau (pm 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Paramètres structurels pour D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [de Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [de Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q max Rg utilisé pour Guinier </td><td> 0,77 à 1,24 </td></tr><tr><td> D max (nm) [P (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-plage utilisée pour p (r) (Å -1)</td><td> De 0,02 à 0,17 </td></tr><tr><td> Porod volume V p (Å 3) [de Scatter] </td><td> (570 ± 5) x 10 3 </td></tr><tr><td> Masse moléculaire M r (kDa) [de V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Calculé monomère M. de la séquence (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Paramètres structurels pour D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [de Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [de Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q max Rg utilisé pour Guinier </td><td> 0,44 à 1,29 </td></tr><tr><td> D max (nm) [P (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-plage utilisée pour p (r) (Å -1) </td><td> 0,03 à 0,18 </td></tr><tr><td> Porod volume V p (&amp; #197; 3) [de Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Masse moléculaire M r (kDa) [de V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Calculé hexamérique M. de la séquence (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: paramètres de données SAXS. Le tableau résume les paramètres d'acquisition de données SAXS et de l'analyse.

La détermination de la structure en solution d&#39;une protéine par diffusion aux petits angles des rayons X (SAXS) exige des échantillons monodispersées. Ici, nous présentons deux possibilités pour assurer un minimum de retards entre la préparation des échantillons et l&#39;acquisition de données: chromatographie en ligne d&#39;exclusion de taille (SEC) et la chromatographie par échange d&#39;ions en ligne (IEC).

En ligne Taille-exclusion et d&#39;échange d&#39;ions chromatographie sur SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

L’objectif global de la mise en œuvre de la chromatographie d’exclusion stérique et de la chromatographie d’échange d’ions en ligne sur les lignes de faisceau de diffusion des rayons X aux petits angles est d’obtenir des données de modèle basse résolution de meilleure qualité en garantissant des délais minimaux entre la préparation de l’échantillon et l’acquisition des données. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie structurale. Comme l’opération de rayon, la plus grande distance intra-particulière, la forme de la particule, le degré de dénaturation ou de désordre du pliage.SAXS nécessite des échantillons molaires dispersés. Le principal avantage de cette technique est que le temps entre la purification et la mesure est court, ce qui permet d’éviter la dénaturation ou l’advication de l’échantillon. Avant de se rendre à l’installation de la ligne de faisceau, préparez un échantillon concentré en utilisant les méthodes précédemment publiées et effectuez des essais SEC.À l’installation de la ligne de faisceau, placez un millilitre de tampon de filtration sur gel dans un tube de réaction de 1,5 millilitre. Ensuite, connectez le flacon de tampon de filtration en gel à un système HPLC en ligne avec le capillaire à flux continu de la configuration SAXS. Réglez le débit, la pression maximale de la colonne et le temps d’acquisition.Notez la contre-pression sans la colonne. Purgez les lignes, puis connectez et équilibrez la colonne de chromotographie d’exclusion de taille. Chargez l’échantillon tampon d’un millilitre dans le passeur d’échantillons.Sortez et sécurisez ou entrez dans le clapier expérimental, puis connectez-vous au logiciel de contrôle de la ligne de faisceau en mode passeur d’échantillons. Envoyez l’échantillon tampon dans le passeur d’échantillons directement à travers le capillaire à flux continu SAXS. Effectuez un court test SAXS et vérifiez que l’intensité de la diffusion des rayons X du son ne montre aucun signe de dommages causés par les rayonnements.Basculez le système de contrôle de la ligne de faisceau en mode HPLC et effectuez un test SAXS de la mémoire tampon via le système HPLC SAXS complet. Si les données ne correspondent pas à la première mesure, rééquilibrez et effectuez une autre série de tests. Ensuite, en laboratoire, centrifugez l’échantillon de protéines à 13 000 fois G pendant 10 minutes pour éliminer les agrégats.Transférez le surnageant dans un flacon en verre compatible HPLC. Chargez le flacon dans l’échantillonneur automatique en notant la position de l’échantillon. Verrouillez le clapier et créez un dossier pour les données de l’expérience dans le système de contrôle de la ligne de faisceau.Ensuite, dans le logiciel HPLC, cliquez sur lot rapide. Définissez le chemin d’accès au fichier et activez la conversion ascii automatique des données UV Vis. Entrez le volume d’injection et la position de l’échantillon dans l’échantillonneur automatique.Cliquez sur démarrer’pour ajouter l’exécution à la file d’attente. Entrez le nom du fichier, mais ne cliquez pas encore sur enregistrer. Dans le logiciel de contrôle de la ligne de faisceau, définissez le nombre de trames de données de sorte que le temps de collecte des données SAXS soit légèrement plus long que le temps d’acquisition HPLC.Ouvrez l’obturateur de ligne de faisceau et lancez la collecte de données SAXS. Passez au logiciel HPLC et cliquez sur Enregistrer pour injecter l’échantillon. Notez le numéro d’image au début de l’acquisition des données UV-Vis et surveillez l’intensité additionnée au fil du temps.Lors de la préparation de l’échantillon, effectuez un test CEI avec un gradient linéaire de chlorure de sodium de 25 millimolaires à une molaire. Pour chaque pic d’intérêt, déterminez la quantité correspondante de tampon B à haute teneur en sel dans la phase mobile. Pour commencer l’expérience CEI SAXS, mettez de côté des échantillons d’un millilitre de tampons A et B, puis connectez les tampons au système HPLC.Réglez les paramètres HPLC, puis purgez le système et rincez les conduites avec le tampon A à faible teneur en sel.Connectez et équilibrez la colonne d’échange d’ions avec le tampon A.Chargez les échantillons d’un millilitre des tampons A et B dans le passeur d’échantillons. Verrouillez la niche et effectuez un court test SAXS pour chaque échantillon de tampon en mode passeur d’échantillons afin de vérifier la sensibilité du tampon aux dommages causés par les rayonnements. Ensuite, passez en mode HPLC et effectuez une autre série de tests SAXS pour le tampon A.Comparez les modèles de diffusion à ceux obtenus à partir de la série de tests du passeur d’échantillons.Ensuite, créez un dossier pour les données de l’expérience. Ensuite, concevez un gradient HPLC par étapes qui commence par un tampon B à haute teneur en sel de zéro pour cent et augmente de cinq pour cent à des intervalles de deux volumes de colonne pour atteindre 100 % de tampon B.Configurez une exécution de gradient unique dans laquelle aucun échantillon n’est injecté. Ouvrez l’obturateur de la ligne de faisceau, démarrez la collecte de données SAXS et démarrez l’exécution HPLC.Notez le nombre d’images écoulées lorsque la collecte des données UV-Vis commence. Après la collecte des données, vérifiez que l’intensité additionnée est restée constante pendant au moins 100 images et qu’elle correspond aux valeurs obtenues à partir des échantillons de tampons A et B.Ensuite, appliquez une autre méthode HPLC de gradient par étapes, en commençant par zéro pour cent de tampon B.Créez un pas pour chaque valeur de pourcentage B déterminée dans le test de gradient IEC hors ligne. Ajoutez des étapes de dégradé un point de pourcentage en dessous et 1,5 point au-dessus de chacune de ces valeurs.Réglez chaque intervalle d’étape sur 2,5 volumes de colonne et l’étape finale du gradient sur 100 % B.Diluez le surnageant si nécessaire pour obtenir la composition du tampon A.Arrêtez les pompes HPLC, déconnectez le tube de la colonne des détecteurs et placez l’extrémité de la ligne dans un récipient pour recueillir le débit de la colonne. Ensuite, transférez la ligne tampon A dans l’échantillon dilué, en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est piégée dans le tube. Démarrez les pompes pour aspirer l’échantillon dans la colonne.Une fois que le récipient d’échantillon est presque vide, arrêtez les pompes et remettez la bouteille tampon A sur la ligne. Démarrez les pompes et faites passer la mémoire tampon A à travers la colonne sur deux volumes de colonne, puis arrêtez les pompes et reconnectez la colonne aux détecteurs. À l’aide de la nouvelle méthode par étapes, configurez une seule exécution HPLC sans injection automatique d’échantillon.Ouvrez l’obturateur de ligne de faisceau et acquérez les données SAXS et UV-Vis. Surveillez l’intensité additionnée au fil du temps. Ensuite, utilisez un logiciel de post-traitement pour convertir les données HPLC au format ascii.À l’aide d’un gestionnaire de données en ligne, identifiez les trames SAXS correspondant au pic d’élution de l’échantillon. Vérifiez que le rayon de giyration est stable tout au long du pic. Importez les images de crête dans un programme de traitement de données SAXS et créez une courbe de diffusion moyenne non corrigée.Pour SCC SAXS, vérifiez que la région Q élevée de la mémoire tampon moyenne, et pas seulement la courbe de diffusion non corrigée. Chargez et mettez à l’échelle les images soustraites automatiquement du pic et vérifiez qu’il n’y a pas de différences systématiques. Faites la moyenne de toutes les courbes pour obtenir la courbe SAXS finale.Pour IEC SAXS, il faut tirer en moyenne 50 images de chaque pas de dégradé. Comparez ces moyennes à la courbe non corrigée et sélectionnez l’étape de gradient avec la meilleure correspondance Q élevée. Soustrayez la moyenne choisie de la courbe non corrigée pour créer la courbe SAXS finale.Enfin, déterminez la distribution de la distance de paire et effectuez une modélisation ab initio pour déterminer le modèle le plus représentatif de la protéine. Les paramètres des données structurales obtenues à partir de SEC et IEC SAXS de la protéine D5 étaient très similaires. Les estimations de la masse moléculaire étaient toutes deux en accord avec la masse prédite.La modélisation ab initio a été réalisée sans symétrie imposée, et avec une symétrie C6. Les deux modèles sont compatibles avec les données de l’expérience, indiquant que la structure de la protéine possède une symétrie C6. La modélisation moléculaire produit une structure pyramidale hexogonale avec un canal central partiellement obstrué.Les modèles SEC et IEC moyennés étaient très similaires. En examinant des modèles individuels, on a constaté que les obstructions du canal étaient probablement un artefact du processus de calcul de la moyenne. SAXS devient de plus en plus standard, mais pour de nombreuses étapes de purification et d’autres chromotographie d’échange d’ions nécessaires pour se débarrasser des agrégats ou des contaminants.Dans ce protocole, nous avons présenté les deux techniques, la chromotographie d’exclusion stérique en ligne et la chromotographie d’échange d’ions en ligne sur une ligne de faisceau bio SAXS. Une mise en garde des deux techniques est que la concentration précise des protéines n’est pas connue, de sorte que nous ne pouvons pas déterminer la diffusion de la masse moléculaire. Cependant, pour les protéines globulaires, nous pouvons toujours estimer le volume massique.Un gradient linéaire pourrait être appliqué à la place du gradient par étapes que nous avons utilisé ici dans la chromotographie d’échange d’ions, bien que cela nécessite une optimisation de la condition de tampon pour une séparation optimale des pics. Ces techniques nous permettent de collecter des données SAXS de bonne qualité, même sur des systèmes complexes.

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