Plunge congélation: un outil pour les études ultrastructurales et immunolocalisation de cellules en suspension dans microscopie électronique à transmission

L’objectif des expériences suivantes est de proposer un outil pour les études d’ultrastructuration et d’immunolocalisation de cellules en suspension pour la visualisation en microscopie électronique à transmission. Cette technique est facile à utiliser, peu coûteuse et permet une excellente préservation de la structure cellulaire. Il s’agit d’une culture de cellules en suspension.

Tout d’abord, les cellules sont récoltées par différentes centrifugeuses pour obtenir une pastille dans un tube de microcentrifugation. Dans un second temps, l’échantillon est rapidement congelé par congélation plongeante qui immobilise les cellules et limite la formation de cristaux de glace. Ensuite, la substitution par congélation est effectuée afin de remplacer l’eau par un solvant contenant du tétroxyde d’osmium comme fixateur pour stabiliser les structures cellulaires.

Les résultats montrent que la congélation par immersion, et la substitution par congélation, préservent parfaitement l’infrastructure des cellules. La fixation chimique était une méthode primaire de fixation de tissus ou de cellules pour la microscopie électronique à transmission, mais avec cette méthode, des artefacts et l’extraction du contenu cellulaire sont généralement observés. Une alternative à la fixation chimique est la cryofixation.

Cette méthode représente le meilleur choix pour produire la plus haute qualité de morphologie dans des sections minces en résine. La congélation par immersion est une technique de cryofixation qui immobilise instantanément les molécules de la cellule pour éviter les dommages causés par la fixation chimique conventionnelle. Avant de plonger la congélation de l’échantillon, une grille découpée avec un film Formvar doit être préparée pour être utilisée comme support pour la congélation.

Polissez la lame de verre avec un chiffon non pelucheux jusqu’à ce qu’elle soit brillante et essuyez-la. Trempez la lame de verre dans une solution de Formvar 0,3 % dans du chloroforme pendant quelques secondes et laissez sécher debout dans un bécher. La manipulation doit être réalisée sous une hotte à l’aide d’un équipement de protection individuelle en raison de la présence de chloroforme.

Après avoir rempli un cristalliseur d’eau distillée, passez sur la surface de l’eau une barre de verre pour enlever la poussière. Lorsque le film est sec, marquez les bords avec une lame de rasoir tranchante afin que le film puisse se détacher. Givrez la diapositive en expirant fortement sur la diapositive pour obtenir une couche de vapeur d’eau sur le film.

Faites immédiatement flotter le film sur la surface de l’eau en touchant le bas du toboggan avec un angle d’environ 30 degrés par rapport à la surface de l’eau. Abaissez lentement la glissière dans le bain, en taquinant le film si nécessaire. Le film Formvar se dépose lentement à la surface de l’eau.

Fixez le film sur le bord du cristalliseur à l’aide d’une pince à épiler. Posez délicatement les grilles de cuivre de 400 mailles face vers le bas sur le film dans les zones de l’épaisseur appropriée et sans plis. Le film avec des grilles est ramassé en les recouvrant de papier Joseph pendant qu’ils flottent à la surface de l’eau.

Prenez le bord du papier Joseph et le film avec des grilles devrait l’accompagner. Ne laissez pas vos doigts toucher la surface de l’eau ou vous courez le risque de laisser un film dans l’eau. Laissez sécher les grilles plusieurs heures avant de les utiliser.

Pour les études ultrastructurales, placez l’ampoule de tétroxyde d’osmium dans une fiole en verre. Agitez bien la fiole pour casser l’ampoule. Ajouter le volume approprié d’acétone à 100 % pour obtenir une concentration finale de 4 % Agiter le flacon contenant le milieu de substitution de congélation et verser des aliquotes de 1,5 millilitre dans des cryoflacons à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.

Fermez tous les bouchons et conservez-le au congélateur à moins 84 degrés avant de l’utiliser. Pour les études d’immunomarquage des protéines, préparez 0,1 % d’acétate d’uranyle dans de l’acétone. Lorsque la solution devient claire, filtrez à l’aide d’un filtre de 0,2 micromètre et distribuez des aliquotes de 1,5 millilitre dans des cryoflacons.

Conserver au congélateur à moins 84 degrés avant utilisation. Pour être sûr d’avoir la consistance appropriée des granulés de différents types de cellules, des cellules de levure crues dans un minimum de milieu liquide complet pour obtenir un 10 à neuf cellules. Escherichia coli dans le milieu DTY pour obtenir cinq cellules bactériennes de 10 à 10.

Leishmania flagellum en milieu AM et Trypanosoma brucei en milieu SDM79 pour obtenir cinq cellules parasitaires de 10 à huit. Transférez le milieu de culture contenant des cellules de suspension dans un tube de propylène de 50 millilitres et centrifugez pendant trois minutes à 1 500 g. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de culture cellulaire respectif.

Centrifuger dans un tube de microcentrifugation pendant une minute à 3 900 g. Retirer complètement le surnageant. Pour la méthode de congélation par immersion, une bouteille de propane avec un tube relié à la bouteille de propane doit être utilisée.

Le propane étant potentiellement explosif, réalisez la liquéfaction dans une pièce bien ventilée ou dans une hotte. Aucune flamme nue n’est autorisée. Un équipement de protection individuelle, y compris des cryogants, doit toujours être porté lors de l’utilisation d’azote liquide.

Mettez une petite quantité d’azote liquide dans un plateau en polystyrène. Placez la coupelle en laiton dans de l’azote liquide. Des bulles apparaissent.

Attendez que les bulles se calment. La coupelle en laiton est ensuite congelée. Mettez le tube relié à la bouteille de propane en contact avec la paroi du capuchon en laiton.

Ouvrez doucement le robinet de la bouteille de propane. Beaucoup de fumée se forme car le propane ne commence pas à se liquéfier. Lorsque le propane commence à se liquéfier, la fumée disparaît.

Arrêtez la liquéfaction en fermant le robinet de la bouteille de propane et en retirant rapidement le tube relié à la bouteille de propane. Remplissez le plateau en polystyrène avec de l’azote liquide jusqu’à cinq millimètres du haut de la coupelle en laiton. Congelez des petits gobelets en laiton où nous remplacerons l’échantillon après congélation en les mettant dans de l’azote liquide.

Mettez une tasse pour un échantillon. Attention à ne pas mélanger les échantillons. Pour obtenir la consistance appropriée du granulé, il suffit de respecter les conditions de culture et les paramètres de centrifugation indiqués précédemment.

Congelez la pince à épiler avant de l’utiliser. Prenez une grille de microscopie en cuivre de 400 mailles découpée avec Formvar. Plongez une aiguille de dissection à double tranchant dans la pastille.

Déposez, à l’aide de l’outil, une goutte de granulé sur la grille. Plongez très rapidement le réseau dans du propane liquide et remuez quelques secondes. Transférez rapidement la grille congelée dans la petite coupelle en laiton.

Pour chaque échantillon, faites au moins trois grilles. N’oubliez pas de congeler la pince à épiler avant de prendre une grille. Congelez la pince à épiler avant de l’utiliser.

Retirez rapidement la tasse et transférez les grilles congelées dans le cryoflacon à l’aide de la pince à épiler. Remettez le capuchon sur le cryovial. Répétez l’opération pour chaque grille de chaque échantillon.

Fermez les bouchons et remuez le cryoflacon pour vous assurer que les échantillons sont dans le milieu de substitution de congélation. Laissez les cryoviaux pendant trois jours dans le congélateur à moins 84 degrés. Transportez les cryoflacons dans un plateau en polystyrène pour éviter une augmentation soudaine de la température jusqu’au congélateur à moins 30 degrés.

Laisser une heure à moins 30 degrés. Transportez les cryoflacons à moins 15 degrés pendant deux heures, puis mettez les échantillons à quatre degrés pendant deux heures et 30 minutes à température ambiante. Retirez le produit de substitution de congélation à l’aide de pipettes de transfert en plastique et placez-le dans une bouteille de déchets appropriée clairement identifiée.

Mettez environ 500 microlitres de 100 % d’acétone. Ouvrez le flacon en verre et remuez le cryoflacon et placez rapidement le milieu de substitution de congélation dans un flacon en verre. Rincez un flacon cryogénique avec de l’acétone à 100 %.

Rincez trois fois 10 minutes avec de l’acétone à 100 %. Transportez les cryoflacons dans un plateau en polystyrène pour éviter une augmentation soudaine de la température jusqu’au congélateur à moins 30 degrés. Laissez deux heures à moins 30 degrés.

Après avoir placé les échantillons dans un flacon en polypropylène, remplacez le milieu de substitution de congélation par un milieu de substitution de congélation frais et laissez agir deux heures à moins 30 degrés. Rincez une heure avec de l’acétone à 100 % et trois fois une heure avec de l’éthanol à 100 %. La méthode de substitution de congélation/congélation en plongée a permis d’obtenir une excellente conservation des structures intracellulaires des cellules en suspension.

Chez Saccharomyces cerevisiae, les structures ne sont pas rétrécies et le cytoplasme semble dense. De plus, les membranes sont lisses, ce qui est la preuve d’une bonne conservation. Tous les organites, tels que le noyau, les mitochondries et les vacuoles, peuvent être parfaitement identifiés.

Une excellente conservation est également observée chez Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei et Escherichia coli. Dans le noyau, la double membrane formant l’enveloppe nucléaire, le pore nucléaire, le corps du pôle fusiforme et les ribosomes attachés à la membrane externe de l’enveloppe nucléaire sont clairement visibles. Dans les mitochondries, les invaginations de la membrane interne, appelées crêtes, sont clairement visibles.

Les organites critiques sont les vacuoles, car de gros cristaux de glace peuvent se développer facilement. Sur l’image, les vacuoles sont parfaitement préservées sans dommages causés par les cristaux de glace. La méthode de substitution de congélation/congélation en plongée peut également être utilisée pour effectuer l’immunolocalisation des protéines.

La procédure préserve parfaitement l’antigénicité des protéines et, comme mentionné précédemment, les organites sont clairement identifiés. Différents anticorps ont déjà été testés pour cibler différentes protéines de levure, telles que l’anti-ATP synthase et l’anti-porine. Une telle expérience est également possible pour différents systèmes expérimentaux, comme dans Leishmania, où la protéine flabarine a été localisée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’échantillons avec la méthode de substitution de congélation/congélation en plongée pour les visualiser en microscopie électronique à transmission. Cette technique est rapide, facile à utiliser, peu coûteuse et permet une excellente préservation des infrastructures cellulaires. Attention à l’azote liquide, mais surtout au tétroxyde d’osmium et à l’acétate d’uranyle.

Ils doivent être manipulés dans la hotte tout en portant l’équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants.