Mesure de nitrites et de nitrates, Métabolites dans le Nitric Oxide Pathway, dans les matières biologiques en utilisant la méthode chimiluminescence

L’objectif de ce protocole est d’utiliser la chimiluminescence pour quantifier l’oxyde nitrique dans les échantillons biologiques en quantifiant les niveaux de nitrite et de nitrate, à l’aide de solutions réductrices de triiodure et de chlorure de vanadium. Ce protocole fournit un outil puissant pour suivre le métabolisme et la signalisation de l’oxyde nitrique, à la fois régionalement et longitudinalement, à partir d’une variété d’échantillons biologiques. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité et sa grande sensibilité.

Katelyn Cassel, notre boursière de l’IRTA, fera la démonstration de cette procédure. Elle nous montrera comment mesurer le nitrite par chimiluminescence couplée à une solution de triiodure. Pour commencer, préparez une solution de préservation des nitrites.

Préparez une solution contenant un NEM de 118 millimolaires et un ferrocyanure de potassium de 890 millimolaires dans de l’eau distillée. Dissoudre les solides jusqu’à ce que la solution soit jaune clair sans cristaux. Ajoutez ensuite cette solution à NP 40 dans un rapport volume par volume de 9 à 1.

Mélangez doucement la solution pour éviter la formation de mousse. Ne vortex jamais ce mélange. La solution de conservation des nitrites peut être utilisée pendant environ une semaine si elle est stockée à 4 degrés Celsius.

Le protocole peut être utilisé sur de nombreux échantillons biologiques fraîchement obtenus. Dans ce cas, du sang fraîchement prélevé a été centrifugé pour obtenir un échantillon de plasma à analyser. Il est très important de traiter le plus rapidement possible le sang ou tout échantillon biologique contenant une grande quantité de protéines hémiques, telles que l’hémoglobine ou la myoglobine, car les protéines héminiques réagiront avec le nitrite et détruiront le nitrite.

Maintenant, afin de préserver la majeure partie du nitrite de sang endogène, mélangez immédiatement le plasma avec une solution de préservation des nitrites dans un rapport volume par volume de 1 à 4. À n’importe quelle étape de cette préparation, l’échantillon peut être congelé sur de la glace carbonique. Pour déprotéiner l’échantillon, mélangez-le avec une partie égale de méthanol froid.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13000 G pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius pour précipiter les protéines. Prenez le surnageant et utilisez-le pour mesurer les nitrites. Pour une mesure sensible du nitrite, une solution réductrice de triiodure est considérée comme la plus efficace.

Lors de sa préparation, assurez-vous que tous les cristaux se dissolvent. Conservez la solution dans un flacon sombre et utilisez-la dans la semaine suivant la préparation. Une solution réductrice de chlorure de vanadium offre la plus grande précision pour mesurer le nitrate.

Une solution de 1 micromolaire de nitrite est utilisée pour déterminer la courbe standard du nitrite, ainsi que du nitrate. Installez l’analyseur d’oxyde nitrique selon les instructions du fabricant. Tout d’abord, ouvrez la bouteille d’oxygène, allumez l’instrument et connectez-le à un piège à acide, qui contient une molaire d’hydroxyde de sodium.

Ensuite, ouvrez le réservoir d’hélium, puis connectez la chambre de réaction en verre au réservoir d’hélium. Maintenant, chargez la chambre de réaction avec une solution de triiodure pour la mesure des nitrites. Ajouter un agent anti-mousse.

Ajustez le débit de gaz pour ralentir les bulles. Ensuite, connectez le piège à acide à la chambre de réaction. À l’aide d’essais et d’erreurs, ajustez le débit d’hélium à droite, pour qu’il corresponde à l’aspiration de l’instrument.

Maintenant, démarrez le logiciel liquide basé sur la programmation visuelle. Tout d’abord, activez la communication entre l’instrument et le logiciel d’acquisition à partir du menu Données, puis à partir du menu principal du panneau avant, lancez l’analyse. Attendez que le refroidisseur du photomultiplicateur refroidisse en dessous de moins 12 degrés Celsius et que le photomultiplicateur se stabilise.

Après environ 30 minutes, la ligne de base se sera stabilisée à 1 ou 2 millivolts près. La stabilité de la valeur est cruciale, pas la valeur elle-même. Une fois l’analyseur stabilisé, utilisez une seringue Hamilton bien lavée pour injecter les solutions.

Tout d’abord, injectez au moins trois volumes différents de l’étalon de nitrite de 1 micromolaire. Injectez les solutions dans la solution réductrice à travers le septum. Injectez chaque étalon ou échantillon deux fois.

Si l’on s’attend à des teneurs élevées en nitrites et à des échantillons élevés, il faut envisager d’injecter un quatrième volume important de solution étalon de nitrite pour mieux déterminer la pente de la courbe étalon. Observez toujours le résultat et attendez que l’analyseur se stabilise à nouveau à la ligne de base avant d’injecter l’échantillon suivant. Cela prend au moins une minute.

Utilisez des volumes d’échantillons dont la vitesse maximale est inférieure à 700 millivolts pour obtenir des résultats précis. Entre les passages, lavez soigneusement la seringue avec de l’eau déminéralisée. Il est très important de bien laver la seringue.

Une fois toutes les mesures effectuées, appuyez sur l’option d’arrêt dans le logiciel. Les données seront automatiquement enregistrées. Appuyez sur abort pour mettre fin à la mesure sans enregistrer les données.

Fermez le robinet d’arrêt sur le dessus de la cuve de réaction et débranchez la gaine reliant le piège à acide et la cuve de réaction. Après l’expérience, mettez l’analyseur en veille. Appuyez sur analyse sur le panneau principal et vérifiez qu’il passe en mode veille.

Ensuite, coupez l’alimentation en oxygène. Débranchez le tube du réservoir d’O2 vers le piège à acide. Ensuite, rincez la solution de triiodure à l’aide d’hélium.

Ensuite, fermez et déconnectez le réservoir d’hélium de la cuve de réaction en verre. Enfin, nettoyez le récipient avec de l’éthanol et de l’eau au besoin. Les normes de test ainsi que les échantillons de plasma montrent qu’immédiatement après leur injection, la tension du photomultiplicateur augmente et revient à la ligne de base une fois que tout le nitrite a été réduit, ce qui peut prendre jusqu’à une minute.

Pour quantifier le signal, une courbe standard a été construite à partir des normes, en utilisant l’aire sous le pic de saut de tension. En utilisant la courbe standard, la quantification des échantillons était très reproductible entre leurs injections en double. La chimiluminescence est considérée comme l’étalon-or pour déterminer les concentrations de nitrite.

Une fois maîtrisée, la limite de sensibilité pour le nitrite est aussi basse que vingt millimolaires. La chose la plus importante pour travailler avec la chimiluminescence est la précision. En raison de la grande sensibilité de la méthode, chaque erreur affectera le résultat final.

Alors prenez votre temps et ne vous précipitez pas. Après que cette technique ait été développée au début des années 2000, elle a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les voies métaboliques de l’oxyde nitrique et apprendre que les carences en oxyde nitrique sont à l’origine de nombreuses maladies, en particulier les maladies cardiovasculaires.