Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

L’objectif de ce protocole est de présenter une méthode efficace d’identification des neurones patchés lors d’enregistrements électrophysiologiques à l’aide de la biocytine et de l’immunomarquage pour la récupération de la morphologie avant la recoloration avec des anticorps spécifiques afin de déterminer l’identité neurochimique. Cette méthode décrit donc une étape importante nécessaire pour étudier la diversité de la structure et de la fonction neuronales. C’est essentiel pour comprendre leur rôle dans les réseaux cérébraux.

Le principal avantage de l’utilisation d’une technique de traitement séquentiel, est qu’elle élimine la perte de données due à l’incapacité à récupérer la morphologie. Cela aide donc également à guider les marqueurs neurochimiques à tester dans ces cellules. Bien que cette méthode soit décrite pour la récupération morphologique des cellules en lames épaisses, elle peut également être appliquée aux lames minces et sur des échantillons préalablement colorés et montés.

En général, les neutres novices dans cette méthode peuvent avoir du mal à refermer le soma tout en se détachant de la cellule, et peuvent ne pas laisser suffisamment de temps pour que les remplissages réussissent. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car des techniques spécifiques sont nécessaires pour un remplissage efficace de la biocytine des cellules afin de récupérer la morphologie complète. Pour commencer cette procédure, dans la configuration de la pince de tension, appliquez de petits pas de tension brefs à l’aide de la fonction de test de membrane en mode bain tout en vous approchant de la cellule.

Fixez-le sur la cellule en appliquant une aspiration. Ensuite, maintenez la cellule à moins 70 millivolts. Notez le développement d’un joint gigaohm.

Compensez les transitoires capacitifs, puis appliquez une aspiration contrôlée avec une seringue ou par la bouche pour obtenir une configuration de cellules entières. Estimez la capacité de la cellule entière et la résistance en série, et arrêtez les impulsions de test sur membrane. Une résistance série inférieure à 10 mégaohms est optimale.

Cela garantira l’établissement de conditions d’enregistrement de cellules entières pour permettre le remplissage de la biocytine. Une fois les enregistrements physiologiques terminés, rétablissez la configuration de la pince de patch en déplaçant lentement la pipette d’enregistrement par petits pas, en alternant vers le haut et vers l’extérieur en mode pince de tension. L’étape la plus critique dans la réalisation de la récupération morphologique des cellules est d’assurer la refermeture du soma neuronal tout en détachant la pipette d’enregistrement de la cellule.

À l’aide de la fonction de test membranaire, visualisez la perte de transitoires capacitifs et l’effondrement des réponses de courant à une ligne droite, ce qui indique la réétanchéité de la cellule et l’établissement d’un patch extérieur à l’extrémité de la pipette. En attendant, le maintien de la cellule à un potentiel dépolarisé facilitera le processus de refermeture. Après avoir détaché la pipette de la cellule, conservez la tranche dans la chambre d’enregistrement pendant trois à cinq minutes pour assurer le transport du colorant vers les processus dendritiques et axonaux distaux.

Ensuite, transférez la tranche sur une plaque à 24 puits contenant 4 % de PFA pour la fixation. 24 à 48 heures après la fixation du PFA, transférez toutes les tranches fixées dans le PBS molaire du point zéro pour le stockage avant l’immunomarquage. Dans cette procédure, lavez les mouchoirs trois fois pendant 10 minutes chacune en PBS molaire zéro virgule un.

Ensuite, bloquez les tissus avec 10 % de sérum bloquant pendant une heure à température ambiante. Par la suite, incubez les sections dans les anticorps primaires CB1R à température ambiante pendant la nuit pour identifier l’expression du récepteur cannabinoïde de type 1. Ensuite, lavez les sections de cerveau trois fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 PBS molaire.

La streptavidine et l’anticorps secondaire contre le premier anticorps primaire sont tous deux ajoutés à la plaque du puits et conservés toute la nuit à quatre degrés Celsius. Par la suite, incubez les sections dans un colorant rouge de streptavidine conjugué à quatre degrés Celsius pendant une nuit dans l’obscurité pour révéler la biocytine. Après cela, lavez les sections du cerveau trois fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 molaire PBS.

Pour protéger la fluorescence et faciliter la recoloration à l’avenir, montez les sections sur un support de montage également espacé. Scellez les bords des lamelles avec du vernis à ongles transparent. Dans cette étape, retirez le vernis de la lame de verre avec un coton-tige d’acétone.

Retirez soigneusement la lamelle à l’aide d’une pince à pointe fine et placez quelques gouttelettes de PBS 0,1 molaire sur les sections. Il est essentiel de ne pas endommager le tissu de traitement lors du démontage du tissu du milieu de montage aqueux. Retirez soigneusement les sections de la lame à l’aide d’un pinceau fin et lavez-les à 0,1 molaire PBS pendant 24 à 48 heures sur un agitateur, et à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius.

Pour assurer l’élimination complète du support de montage, lavez les sections une à deux fois le lendemain dans du PBS 0,1 molaire pendant 10 minutes à chaque fois. Ensuite, incubez les sections avec un deuxième anticorps primaire, la cholécystokinine, pendant une journée. Lavez les sections de cerveau trois fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 molaire PBS.

Par la suite, colorez les sections avec un anticorps secondaire conjugué fluorophore chèvre anti-souris. S’assurer que les spectres d’émission d’excitation de l’anticorps secondaire ne chevauchent pas ceux de la streptavidine et des colorations immunofluorescentes antérieures. Ensuite, montez les sections dans un support de montage aqueux.

Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent. Après le remplissage réussi de la biocytine et le premier processus d’immunomarquage, la structure neuronale peut être visualisée et imagée comme le montre l’image confocale obtenue à un grossissement de 60x. La section a également été immuno-colorée pour CB1R avec la biocytine, et l’immunomarquage CB1R dans le soma neuronal exprimant la biocytine est indiqué par la pointe de flèche.

La même section a été traitée pour l’immuno-réactivité de la CCK après une semaine, et l’image montre une récupération réussie de l’immuno-marquage de la CCK dans plusieurs neurones indiqués par l’astérisque. Notez que la cellule marquée à la biocytine indiquée par la pointe de flèche n’exprimait pas la CCK. Une image fusionnée des panneaux A, B et C montre que les trois étiquettes sont visualisées de manière robuste, et la superposition entre la biocytine et CB1R est évidente.

L’image montre que le deuxième processus d’immunocoloration ne compromet pas le signal du processus de coloration précédent. La morphologie de la cellule remplie de biocytine a été obtenue à partir des images confocales antérieures à cette immunocoloration CCK. De manière cruciale, en plus du soma et de la dendrite, les axones peuvent être visualisés, et le co-marquage des processus axonaux marqués par CB1R et la biocytine est observé.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de cibler les cellules saines situées sous la surface de la tranche pour éviter les neurones dont les processus sont sectionnés. Et cela pourrait compromettre la récupération de la morphologie. Une fois maîtrisée, la récupération morphologique des cellules remplies de biocytine peut être obtenue de manière fiable lors de l’enregistrement par patch clamp.

La mise en œuvre réussie de la technique d’immunocoloration en série améliorera l’efficacité de la récupération des données et facilitera la caractérisation neuronale lors des enregistrements standard par patch clamp. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser efficacement les cellules remplies de biocytine pour récupérer la morphologie neuronale et déterminer les marqueurs neurochimiques.