Name: Analyse de limmunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus + T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour quantifier les lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus SIV chez le macaque rhésus par cytométrie en flux. Cette technique permet d'analyser directement les échantillons ex vivo sans stimulation in vitro.

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Nous tenons à remercier David Watkins pour soutenir les expériences qui ont permis l&#39;optimisation de la méthodologie actuelle. La recherche rapportée dans la présente publication a été financée en partie par une subvention pilote fourni par le Centre de Miami for AIDS Research des National Institutes of Health sous le numéro d&#39;attribution P30AI073961. Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Les échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) utilisés dans ce manuscrit ont été obtenus à partir de macaques rhésus indiens logés au National Primate Research Center Wisconsin. Ces animaux ont été pris en charge en conformité avec le rapport Weatherall en vertu d&#39; un protocole approuvé par l&#39;Université du Wisconsin Graduate School Animal Care et utilisation Comité 33. Toutes les procédures animales ont été réalisées sous anesthésie et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance potentielle. 1. Traitement PKI NOTE: Cette option est facultative, mais recommandée pour Mamu-B * 017: 01 tétramères. Résultats et discussion Sections. <ol><li> Remettre en suspension les PBMC dans du milieu R10 à une concentration de 1,6 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Ajouter 50 ul de cette suspension cellulaire à l&#39;écoulement correspondant cytométrie tubes. Ajouter 50 ul d&#39;une solution 100 nM de l&#39;ICP à chaque tube. </li><li> Vortex chaque tube. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. À la fin de cettel&#39; étape, chaque tube doit avoir 100 ul d&#39;une suspension de cellules contenant 8,0 x 10 5 PBMC et 50 nM de PKI. </li><li> Passez à l&#39;étape tétramère coloration pMHC-I. </li></ol> 2. La coloration avec un fluorochrome marqués pMHC-I tétramères <ol><li> Avant de préparer le pMHC-I tétramère mélange maître, centrifuger les tubes tétramère pMHC-I à 20 000 xg pendant au moins 15 min à 4 ° C. Le but de cette étape est de sédimenter des agrégats de protéines dans la solution de tétramère pMHC-I qui peut augmenter la coloration de fond. Une fois que l&#39;étape de centrifugation est effectuée, d&#39;éviter un pipetage à partir du fond du tube, où les agrégats de protéines se sont accumulés. </li><li> Préparer assez maître tétramère mélange pMHC-I pour colorer tous les tubes expérimentaux. Préparer un excès de 15% du volume total de ce mélange maître pour tenir compte de pipetage erreur. </li><li> Diluer tétramères pMHC-I dans la tache tampon (par exemple, le tampon Stain Brilliant) de telle sorte que 25 pi de la pMHC-I tétramère master mix sont added à chaque test. <ol><li> Étiquette PBMC avec deux tétramères pMHC-I par test; un conjugué à l&#39;allophycocyanine (APC), et l&#39;autre au violet brillant (BV) 421. </li></ol></li><li> Ajouter 8,0 x 10 5 PBMC à l&#39;écoulement correspondant cytométrie tubes dans un volume final de 100 ul. Si les cellules ont été soumises au traitement de l&#39;ICP décrit ci-dessus, ils devraient déjà être remises en suspension dans 100 pi à cette étape. </li><li> Ajouter 25 pi de pMHC-I tétramère mélange maître à l&#39;écoulement correspondant cytométrie tubes. À la fin de cette étape, le volume final dans chaque tube doit être de 125 ul. </li><li> Vortexer chaque tube afin d&#39;homogénéiser la suspension cellulaire. </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 45 min. Préparer le cocktail de surface de coloration de mAb pendant cette 45 minutes d&#39;incubation. </li></ol> La coloration de la surface 3. <ol><li> Préparer suffisamment mélange maître mAb pour colorer tous les tubes expérimentaux. Préparer un excès de 15% du volume total de ce mélange maître pour tenir comptepour le pipetage d&#39;erreurs. </li><li> Réglez le volume du mélange maître avec un tampon de tache de telle sorte que 50 ul sont ajoutés par test. </li><li> Pour une bonne exclusion des lymphocytes T CD8 + non et la délimitation des sous - ensembles de mémoire, on utilise des quantités de mAb dirigés contre les molécules suivantes dans le mélange maître de coloration de la surface titrée. NOTE: Les fluorochromes conjugués à chaque mAb sont fournis à titre de référence: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8a BV 785, CD28 PE Cy7 et CCR7 FITC. Notez que les mAb contre CD14, CD16 et CD20 sont conjugués à la même fluorochrome (ie, BV 510) , car ils seront inclus dans la porte &quot;dump&quot;. </li><li> Inclure un colorant pouvant être fixé pour distinguer les cellules mortes dans le mélange maître de coloration de la surface [ie, colorant réactif amine (ARD)]. Assurez-vous que le réactif d&#39;ARD est conjugué à un fluorochrome avec un spectre d&#39;émission similaire à ceux utilisés dans la porte &quot;dump&quot;. Dans ce cas, utilisez ARD Aqua. </li><li> Ajouter 50 pi dele maître de coloration mélange décrit dans 3,1-3,4 à l&#39;écoulement correspondant cytométrie tubes. À la fin de cette étape, le volume final dans chaque tube doit être de 175 ul. </li><li> Vortex chaque tube. Incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 25 min. </li><li> Laver les cellules avec du tampon de lavage (solution de PBS contenant 0,1% de sérum - albumine bovine et 0,45 g / L NaN3). ATTENTION: L&#39;azoture de sodium est une substance toxique. L&#39;exposition à des quantités infimes peut provoquer des symptômes. Manipuler cette substance selon les directives spécifiées par la santé environnementale et de bureau (EHS) de sécurité de l&#39;établissement où ces expériences sont effectuées. </li><li> Tubes à centrifuger à 510 g pendant 5 min. Décanter avec soin le surnageant dans un conteneur à déchets séparé. Veillez à ne pas perturber le culot. ATTENTION: Ne pas transvaser lavage surnageant tampon dans des réservoirs contenant l&#39; eau de Javel car il peut réagir avec l&#39;azoture de sodium présent dans le tampon de lavage et entraîner la formation d&#39;un gaz toxique 34. Contactez l&#39;Office EHS dans l&#39;établissement où ces expériences sont effectuées pour les lignes directrices sur la façon de disposer de l&#39;azoture de sodium. </li><li> Après décantation, les cellules vortex dans le liquide retenu dans les restes de chaque tube. </li></ol> 4. Cellule de fixation <ol><li> Ajouter 250 ul de 2% de paraformaldehyde (PFA), une solution à tous les tubes pour fixer les cellules. ATTENTION: PFA est une substance toxique. L&#39;exposition à des quantités infimes peut provoquer des symptômes. Manipuler cette substance selon les directives spécifiées par le Bureau EHS dans l&#39;établissement où ces expériences sont effectuées. <ol><li> Etant donné que la solution de PFA 2% doit être isotonique aux cellules, en utilisant du PBS pour préparer cette solution. Cent millilitres d&#39;une solution PFA 2% est suffisant pour des expériences multiples. vortex à fond tous les tubes immédiatement après l&#39;addition de 2% de PFA, afin d&#39;éviter la formation d&#39;agrégats cellulaires. </li></ol></li><li> Incuber dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Wcellules de cendres en répétant les étapes 3,7-3,9. Une fois cette étape terminée, les cellules peuvent être stockés dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 24-48 h. Avant de passer à la phase de perméabilisation, vortex à fond les tubes. </li></ol> 5. La perméabilisation de cellules <ol><li> Ajouter 500 pi de tampon de perméabilisation. Tourbillonnaire tous les tubes. </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Laver les cellules en répétant les étapes 3,7-3,9. </li></ol> 6. intracellulaires Coloration <ol><li> Préparer suffisamment mélange maître mAb pour colorer tous les tubes expérimentaux. </li><li> Réglez le volume avec du PBS ou le tampon de tache de telle sorte que 50 ul du mélange intracellulaire maître mAb sont ajoutés par test. </li><li> Préparer le mélange maître mAb décrit dans 6.1 et 6.2 en utilisant des quantités de mAb dirigés contre CD3 et GZM B. titrée NOTE: TCR engagement par tétramères pMHC-I peut se traduire par CD3 intériorisation, qui peut interférer avec la détection de tétramère + CD3 + CD8 +Les cellules T si le mAb anti-CD3 est ajouté au mélange maître de coloration de la surface. Pour éviter cela, ajouter le mAb anti-CD3 à ce stade, qui est, après que les cellules sont perméabilisées. Les fluorochromes conjugués à chaque mAb sont répertoriés comme une référence: CD3 PerCP Cy5.5 et GZM B PE. </li><li> Ajouter 50 ul de mAb cocktail aux tubes correspondants. Incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Laver les cellules en répétant les étapes 3,7-3,9. Les tubes sont prêts à être acquis dans un cytomètre de flux. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Quelques étapes de cette procédure mérite discussion car ils sont essentiels pour produire des résultats optimaux. Premièrement, étant donné la qualité des échantillons biologiques est un puissant prédicteur de la réussite de toute cytométrie de flux dosage 38, tous les soins doivent être prises pour veiller à ce que les cellules sont viables et en suspension au cours de la procédure de coloration. Ceci est particulièrement vrai lorsque l&#39;on travaille avec des échantillons cryoconservés car elles sont plu...

Les lymphocytes T CD8 + comprennent une composante essentielle du système immunitaire adaptatif car ils participent à la surveillance immunitaire de la tumeur et contribuent à l&#39;élimination des agents pathogènes intracellulaires 1. En termes simples, les lymphocytes T CD8 + expriment des récepteurs de cellules T (TCR) qui reconnaissent spécifiquement le peptide majeur d&#39; histocompatibilité de classe I (I) pMHC-molécules présentes sur la membrane plasmique des cellules hôtes. Étant donné que ces peptides sont dérivés de la protéolyse des protéines synthétisées de manière endogène, les complexes pMHC-I de surface cellulaire fournissent une fenêtre dans l&#39;environnement intracellulaire. Lors de l&#39; infection par le virus, par exemple, les cellules infectées présenteront des molécules du CMH-I , contenant des peptides dérivés de virus qui peuvent servir de ligands pour les TCR exprimés par les patrouilles des lymphocytes T CD8 +. Dans le cas d&#39; une CD8 + des cellules T spécifiques du virus rencontre une cellule infectée présentant son ligand pMHC-I, l&#39; engagement du TCR entraînera l&#39; activation CD8 + et des lymphocytes T ultiron conduire à cibler la lyse cellulaire. Étant donné la nature critique de ces interactions TCR / pMHC-I, la détermination de l&#39;ampleur, la spécificité et le phénotype de répondre lymphocytes T CD8 + peuvent souvent révéler des indices importants sur les maladies humaines. Jusqu&#39;au début des années 1990, la quantification des cellules T Ag spécifiques CD8 + appuyé sur la limitation de dosage de dilution exigeant techniquement (LDA) 2,3. Non seulement la LDA ne nécessite plusieurs jours pour être achevé, il a également échoué à détecter des cellules qui ne disposaient pas de potentiel prolifératif. Par conséquent, le LDA largement sous - estimer la fréquence réelle de l&#39; antigène (Ag) , les cellules T CD8 + spécifique de participant à une réponse immunitaire. Bien que le développement de dosages ELISPOT et intracellulaire des cytokines de coloration a grandement amélioré la capacité à mesurer l&#39; immunité cellulaire, ces procédés restent nécessaires stimulation in vitro pour la quantification des lymphocytes T spécifiques d&#39; Ag-4. Ce ne fut pas avant 1996 que Altman, Davis et colleagues publié leur article historique des rapports du développement de la technologie de tétramère pMHC-I 5. Cruciale pour le succès de cette technique était la multimérisation des molécules pMHC-I, qui étendent la demi-vie des interactions TCR / pMHC-I, ce qui réduit la probabilité de tétramères pMHC I tombant au cours des étapes de lavage des tests de cytométrie de flux. Le principal avantage de tétramères pMHC-I au cours des essais mentionnés ci - dessus est la possibilité de détecter avec précision les cellules T spécifiques d&#39; Ag CD8 + ex vivo directement sans la nécessité d&#39; une stimulation in vitro nouveau dans. En outre, la combinaison de pMHC-I coloration tétramère avec multi-couleurs cytométrie en flux a permis des analyses détaillées du stade de différenciation, phénotype mémoire, et l&#39; état d&#39;activation de + cellules T CD8 Ag spécifiques 2-4. À la lumière des récents progrès techniques pour la caractérisation des répertoires CD8 + T-cell par pMHC-I multimère coloration 6, l&#39;étendue des applications for cette méthodologie est susceptible de continuer à développer. Peu de domaines de la recherche biomédicale ont plus bénéficié de pMHC-I coloration tétramère que le domaine de l&#39; immunologie du VIH 7. Bien que les lymphocytes T CD8 + ont été temporellement associée au contrôle initial de la virémie VIH au moment de la publication par Altman, Davis et ses collègues 8,9, l&#39;utilisation de tétramères pMHC-I dans les années qui ont suivi considérablement élargi notre compréhension de la réponse spécifique au VIH des cellules T CD8 +. Par exemple, pMHC-I coloration tétramère permis de confirmer la taille robuste de CD8 + réponses de cellules T spécifiques du virus dans la plupart des individus infectés par le VIH 10-12. Cette méthodologie a également facilité la caractérisation des VIH- et CD8 + réponses SIV spécifiques de lymphocytes T restreinte par les molécules du CMH-I associés au contrôle de la réplication virale spontanée en l&#39;absence de thérapie antirétrovirale, un phénomène connu sous le nom &quot;contrôle de l&#39; élite&quot; <sup&gt; 13-15. En outre, les tétramères pMHC-I ont joué un rôle dans l&#39; établissement de l&#39;axe de la mort programmée 1 (PD-1) / PD ligand 1 (PD-L1) en tant que voie réversible pour le phénotype dysfonctionnel de CD8 spécifiques au VIH + des cellules T dans l&#39; infection chronique incontrôlée 16,17. Collectivement, ces études soulignent l&#39;utilité de tétramères pMHC-I pour la surveillance CD8 + réponses des lymphocytes T contre le virus du sida. Infection SIV expérimentale de macaques rhésus (Macaca mulatta) reste le meilleur modèle animal pour évaluer les interventions immunitaires contre le VIH / SIDA 18,19. Au cours des 25 dernières années, des progrès substantiels ont été réalisés dans l&#39;identification et la caractérisation des cellules T SIV-CD8 + spécifiques de cette espèce de singe, y compris la découverte d&#39;allèles du CMH-I et la définition de liaison peptidiques motifs 13,20-27 . Par conséquent, les tétramères pMHC-I ont été mis au point pour l&#39;analyse de SIV CD8 + spécifiques des lymphocytes Tles réponses dans ce modèle animal 28. La plupart de ces réactifs sont constitués des produits géniques de quatre macaques rhésus alleles du CMH-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, et Mamu-B * 017: 01. Fait à noter, les macaques rhésus n&#39;expriment un locus MHC-C 29. La grande majorité des tétramères pMHC-I utilisés dans les présentes expériences ont été produites à l&#39;installation NIH tétramère de base à l&#39;Université Emory. Néanmoins, certains de ces réactifs, y compris Mamu-A1 * 001 tétramères liés à l&#39;épitope immunodominant Gag CM9, ne peut être obtenu auprès de sources commerciales en raison d&#39;accords de licence. Utilisation de tétramères pMHC-I des quatre allèles de macaques rhésus énumérés ci - dessus, nous avons énuméré avec succès des cellules T CD8 + contre un total de 21 épitopes SIV (tableau 1), qui ont été induites par la vaccination ou une infection SIV primaire 30,31 (Martins et al., observations non publiées). Le présent manuscrit fournit uneoptimisé pMHC-I tétramère protocole de coloration pour déterminer la fréquence et de la mémoire phénotype des cellules T spécifiques du SIV CD8 + chez les macaques rhésus. L&#39;essai commence par un stage de 30 minutes d&#39; incubation avec un inhibiteur de la protéine kinase (PKI, ici, dasatinib est utilisé) afin de diminuer TCR intériorisation et ainsi améliorer pMHC-I tétramère coloration 32. Comme cela est décrit ci-après, ce traitement est particulièrement utile lors de l&#39;utilisation Mamu-B * 017: 01 tétramères. Instructions sur la façon d&#39;étiqueter les cellules avec tétramères pMHC-I fluorochrome conjugué et les anticorps monoclonaux (mAb) sont également fournis. Ce protocole comprend en outre une étape de perméabilisation cellulaire pour la détection intracellulaire de la molécule associée à la cytolyse granzyme B (MGZ B). Le mAb contre CD3 est ajouté à cette étape aussi bien pour améliorer la détection de cette molécule de signalisation TCR. À titre de référence, tous les fluorochromes utilisés dans ce panneau de coloration sont répertoriés.

<table><tbody><tr><td>Dasatinib</td><td>Axon medchem</td><td>Axon&nbsp ; 1392</td><td>Doit être remis en suspension dans DMSO et immédiatement stocké à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>RPMI avec Glutamax</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Doit être stocké à 4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Doit être stocké à 4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycinp-Amphotéricine B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Doit être conservé à 4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrus</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène à fond rond de 5 ml</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Tétramères pMHC-I conjugués au fluorochrome</td><td>NIH Tetramer Core ou MBL, Inc.</td><td></td><td>Doit être stocké et entretenu à 4 °C. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 15 min avant utilisation. Ne pas congeler.</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome</td><td>Diverses entreprises</td><td></td><td>Doivent être stockés et entretenus à 4 &deg ;C. Ne pas congeler.</td></tr><tr><td>VIVANT/MORT&nbsp ; Aqua fixable&nbsp ; Mort&nbsp ; Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td><td>Doit être stocké à -20 &deg ;C. Remettre en suspension chaque aliquote dans 50 &mu ; l de DMSO avant utilisation.</td></tr><tr><td>Tampon à taches brillantes</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td><td>Doit être stocké à&nbsp ; 4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Albumine Bovine</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>Doit être conservé à&nbsp ; 4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>Conserver à température ambiante. Substance toxique. Ne pas mélanger avec de l’eau de Javel.</td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Produit chimique corrosif, ne peut pas être mélangé avec de l’azoture de sodium. Manipuler avec précaution</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714-S</td><td>Réactif inflammable, corrosif et toxique. Manipuler avec précaution</td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween-20)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>Conserver à température ambiante</td></tr><tr><td>Solution de perméabilisation 2&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>340973</td><td>Réactif toxique et corrosif. Manipuler avec précaution</td></tr><tr><td>Sarsdet Tubes 1,5 ml à vis</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml DNA/ARN Tubes à faible liaison</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td>L’utilisation de microtubes stériles est privilégiée&nbsp ;</td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>À la discrétion du scientifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet&nbsp ;</td><td>À la discrétion du scientifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli Q Système de purification de l’eau Intergral</td><td>EMD Millipore</td><td>ZRXQ010WW</td><td>Biologie moléculaire L’eau de qualité de n’importe quel fournisseur peut être utilisée</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>À la discrétion du scientifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>À la discrétion du scientifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg ; C&nbsp ; réfrigérateur</td><td>À la discrétion du scientifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Le cytomètre en flux doit contenir des lasers et des filtres compatibles avec le panneau de coloration utilisé.</td></tr><tr>Eau <td></td><td></td><td></td><td>déminéralisée</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>L’incubateur</td><td></td><td></td><td>doit être capable de maintenir 37 &deg ; C&nbsp ; température interne</td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo software version 9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>Utilisé pour analyser les fichiers FCS générés par le logiciel</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> FACS Diva</tbody></table>

analyse de l'immunodéficience simienne cd8 spécifiques virus + t-cellules dans rhésus macaques par peptide-cmh-i tétramère coloration

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-majeur d&#39; histocompatibilité de classe I (pMHC-I) tétramères ont été un outil précieux pour étudier CD8 + réponses des lymphocytes T. Du fait que ces réactifs se lient directement aux récepteurs des cellules T à la surface des lymphocytes T CD8 + des lymphocytes, des tétramères fluorochrome marqué pMHC-I permettent la détection précise de l&#39; antigène (Ag) spécifique de cellules CD8 + des cellules T sans le besoin de re in vitro -stimulation. En outre, lorsqu&#39;il est combiné avec multi-couleurs cytométrie en flux, pMHC-I coloration de tétramère peut révéler des aspects clés de cellules T Ag-spécifiques CD8 +, y compris l&#39; étape de différenciation, phénotype mémoire, et l&#39; état d&#39;activation. Ces types d&#39;analyses ont été particulièrement utiles dans le domaine de l&#39; immunologie du VIH où les lymphocytes T CD8 + peuvent affecter la progression du sida. L&#39;infection expérimentale de macaques rhésus avec le virus de l&#39;immunodéficience simienne (SIV) fournit un outil précieux pour étudier l&#39;immunité cellulaire contre le virus du sida. Par conséquent, PROGRE considérabless a été faite dans la définition et la caractérisation des réponses des lymphocytes T dans ce modèle animal. Nous présentons ici un protocole optimisé pour dénombrer les cellules T SIV spécifiques CD8 + dans macaques rhésus par pMHC-I coloration tétramère. Notre test permet la quantification et la mémoire simultanée phénotypage de deux populations pMHC-I tétramère + CD8 + T-cellules par test, qui pourraient être utiles pour le suivi des réponses des lymphocytes T CD8 + spécifique du SIV générés par la vaccination ou infection SIV. Compte tenu de l&#39;importance des primates non humains dans la recherche biomédicale, cette méthode est applicable pour l&#39; étude des réponses des CD8 + des cellules T dans de multiples contextes pathologiques.

Le protocole décrit ici a été utilisé pour déterminer l'amplitude et de la mémoire de phénotype CD8 +, les réponses des lymphocytes T spécifiques de Gag-CM9 induits par le vaccin dans une Mamu-A1 * 001 + macaque rhésus. Pour cette analyse, un tétramère Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 APC-conjugué a été utilisé dans un panneau de coloration cytométrie de flux 8 couleurs. Figure 1A - F montre la stratégie de déclenchement utilisé pour analyser ...

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour le dénombrement et la caractérisation des cellules macaques rhésus T CD8 + contre le virus du sida. Cet article est utile non seulement dans le domaine de l&#39; immunologie du VIH, mais aussi à d&#39; autres domaines de la recherche biomédicale où les réponses des lymphocytes T CD8 + sont connus pour affecter les résultats de la maladie.

Analyse de l'immunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus + T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

L’objectif global de ce test est de dénombrer et de caractériser les populations de lymphocytes T CD8 positifs spécifiques au virus de l’immunodéficience simienne générés par la vaccination ou la primo-infection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des lymphocytes T, telles que la fréquence des lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène induites par la vaccination ou l’infection. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier les lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène dans des échantillons biologiques obtenus directement ex vivo sans avoir besoin d’une restimulation in vitro.Les implications de cette technique s’étendent à l’évaluation des lymphocytes T CD8 spécifiques à l’incision chez le macaque rhésus, et à l’étude des réponses des lymphocytes T CDB dans de multiples contextes pathologiques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à se rendre en raison des connaissances incomplètes disponibles sur la génétique du CMH du macaque rhésus, et parce que la coloration cytométrique en flux nécessite une application précise d’anticorps. Commencez par remettre en su

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette procédure montre la purification et l'expansion in vitro des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T du sang périphérique entier et leur visualisation en utilisant des tétramères CMH de classe II. Tétramères permettent la visualisation directe des cellules T avec une spécificité antigénique unique et défini CMH de classe II restriction.

Antigène spécifique de CD4 + Visualisation cellules T à l&#39;aide du CMH de classe II tétramères

Une technique combinant la coloration tétramère situ et l'hybridation in situ (ISTH) permet la visualisation, la cartographie et l'analyse de la proximité spatiale des virus spécifiques des cellules T CD8 + à leurs infectées par le virus cibles, et la détermination des relations quantitatives entre ces effecteurs du système immunitaire et les cibles aux résultats de l'infection.

Une technique pour visualiser simultanément spécifiques du virus de cellules CD8 + T et les cellules infectées In situ</em

Nous démontrons l'utilité de la cytométrie en flux multicouleur pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle détaillée du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes CD4 + et CD8 + T dans les macaques rhésus, le modèle idéal pour les études de vaccin contre le VIH / SIDA.

Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

Ce protocole décrit l'utilisation du peptide: CMH tétramères et les microbilles magnétiques pour isoler des populations de basse fréquence de cellules T spécifiques d'épitopes et les analyser par cytométrie en flux. Cette méthode permet l'étude directe des populations de cellules T endogènes d'intérêt...

Peptide: CMH tétramère basée sur l&#39;enrichissement des cellules T spécifiques d&#39;épitopes

Cette vidéo présente une méthode de caractérisation des lymphocytes T CD8+ mémoires spécifiques du virus de l’immunodéficience simienne (VIS) à l’aide de tétramères du complexe d’histocompatibilité peptide-majeur de classe I (pMHC-I). Un tétramère du pMHC-I est un complexe de quatre molécules du CMH-I liées à des peptides spécifiques du SIV et conjuguées à un fluorophore. Ces tétramères se lient sélectivement aux récepteurs des lymphocytes T (TCR) des lymphocytes T CD8+ spécifiques du SIV,...

Technique de coloration peptide-CMH-I tétramère pour analyser les lymphocytes T mémoires CD8+ spécifiques du SIV

Nous décrivons ici une méthode qui combine in situ MHC-tétramère de coloration avec l’immunohistochimie pour déterminer la localisation, phénotype et la quantité de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les tissus. Ce protocole est utilisé pour déterminer les caractéristiques spatiales et phénotypiques des cellules CD8 T antigène-spécifiques par rapport à d’autre type de cellule et de structures dans les tissus.

In Situ MHC-tétramère de coloration et d’analyse Quantitative pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les tissus

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV+ T cellules isolées de macaques rhésus.

Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Nous présentons ici un protocole pour l’ex vivo détection qualitative de l’antigène-spécifiques CD8+ T des cellules. L’analyse est possible grâce à des suspensions de cellules simples d’organes ou de petites quantités de sang. Un large éventail d’études exigent l’analyse des réponses des cellules T cytotoxiques (vaccination et études d’immunothérapie du cancer).

La Quantification simultanée des anti-vecteur et Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I tétramère coloration après une Vaccination avec un vecteur Viral

Nous fournissons un protocole détaillé pour isoler et identifier des populations rares de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons de souris grâce à l’enrichissement des lymphocytes T à base de billes magnétiques et aux tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

Le test de libération du chrome, un dosage commun pour détecter l'activité des cellules T cytotoxiques, présente plusieurs limitations. En utilisant des cellules T CD8 spécifiques de l'antigène et la ligne de tumeur du cancer du sein humain, SKBR3, dans le présent article, une approche à base d'impédance a été examiné pour la capacité de détecter la destruction des cellules.

Détermination de l&#39;activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

Découvrez une méthode optimisée pour quantifier les lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus SIV chez le macaque rhésus par cytométrie en flux. Cette technique permet d'analyser directement les échantillons ex vivo sans stimulation in vitro.

Analyse de limmunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus + T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse de l'immunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus⁺ T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration

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