Analyse de l'immunodéficience simienne CD8 spécifiques Virus ⁺ T-cellules dans rhésus macaques par Peptide-CMH-I tétramère Coloration

L’objectif global de ce test est de dénombrer et de caractériser les populations de lymphocytes T CD8 positifs spécifiques au virus de l’immunodéficience simienne générés par la vaccination ou la primo-infection. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des lymphocytes T, telles que la fréquence des lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène induites par la vaccination ou l’infection. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier les lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène dans des échantillons biologiques obtenus directement ex vivo sans avoir besoin d’une restimulation in vitro.

Les implications de cette technique s’étendent à l’évaluation des lymphocytes T CD8 spécifiques à l’incision chez le macaque rhésus, et à l’étude des réponses des lymphocytes T CDB dans de multiples contextes pathologiques. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à se rendre en raison des connaissances incomplètes disponibles sur la génétique du CMH du macaque rhésus, et parce que la coloration cytométrique en flux nécessite une application précise d’anticorps. Commencez par remettre en suspension le PBMC rhésus dans le milieu R10.

Ajoutez une concentration de 1,6 fois 10 à la septième cellule par millilitre. Aliquote 50 microlitres de cellules dans le nombre approprié de tubes de cytométrie en flux, et ajoutez 50 microlitres d’inhibiteur de protéine kinase dans chaque tube. Vortex chaque tube et incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

La quantité correcte de tétramère CMH peptidique titré doit être diluée dans suffisamment de mélange maître pour colorer tous les tubes expérimentaux. Par conséquent, il est important de préparer un excédent de 15 % du mixage principal, pour tenir compte des erreurs de pipetage. Pendant l’incubation des cellules, granulez les agrégats de protéines dans la solution de tétramère par centrifugation, afin de minimiser la coloration de fond.

Ensuite, diluez les tétramères dans suffisamment de tampon de coloration, de sorte que 25 microlitres du mélange maître de tétramères puissent être ajoutés à chaque tube de cytométrie en flux. Ensuite, faites tourbillonner les tubes d’échantillon et incubez les solutions de tétramères PBMC dans l’obscurité, à température ambiante pendant 45 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 50 microlitres de mélange maître de coloration dans les tubes d’échantillon appropriés.

Et mélangez les tubes pour le vortex. Après 25 minutes dans l’obscurité à température ambiante, lavez les cellules avec un tampon de lavage, granulez les cellules par centrifugation et décantez soigneusement les surnageants sans déranger les granulés. Vortex les cellules dans le tampon restant dans chaque tube, et fixez les échantillons avec 250 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % par tube.

Vortex immédiatement et incubez les tubes dans l’obscurité, à 4 degrés Celsius. Après 20 minutes, lavez les cellules dans un tampon de lavage frais. Granulez les cellules par centrifugation, et décantez le surnageant sans perturber le granulé.

Remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de perméabilisation, vortex et incubez à température ambiante pendant 10 minutes dans l’obscurité. Ensuite, lavez et granulez les cellules. Transvasez ensuite les surnageants comme décrit précédemment.

Procédez à l’ajout de 50 microlitres de mélange principal de coloration intracellulaire dans les tubes appropriés. Vortex chaque échantillon et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Une fois l’incubation terminée, lavez et granulez les cellules.

Les échantillons sont maintenant prêts à être acquis dans un cytomètre en flux. Les tétramères de Mamu-B017.01 produisent généralement une coloration faible, qui peut être considérablement améliorée par un prétraitement des cellules, avec un inhibiteur de la protéine kinase. Pour éviter les colorations de fond, les cellules appariées de classe un du CMH qui contiennent ou non la population de lymphocytes T CD8 positifs spécifiques de l’antigène d’intérêt, doivent être étiquetées avec le tétramère approprié et des dilutions multiples, afin de déterminer la quantité optimale qui permet la meilleure séparation entre les lymphocytes T CD8 positifs positifs et négatifs.

Dans ces graphiques, la stratégie de déclenchement utilisée pour analyser l’ampleur et le phénotype mémoire des réponses des lymphocytes T positifs CD8 spécifiques de Gag CM9 induits par le vaccin chez un macaque rhésus positif à Mamu-A 01 est présentée. Notez que la population de lymphocytes T CD8 positifs aux tétramères est bien séparée avec une coloration de fond minimale. Et avec les sous-ensembles de mémoire clairement délimités par leur expression CD28, CCR7 et Granzyme B dans la porte tétramère.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures environ si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’ajouter les réactifs appropriés à chaque mélange maître d’anticorps ou de tétramères, et de travailler avec les tubes expérimentaux à chaque fois, comme démontré. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer la spécificité et le phénotype des lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place une coloration du tétramère de classe un du CMH dans le test du modèle de macaque rhésus de la recherche humaine sur le VIH-1 SIDA. N’oubliez pas que le travail avec des échantillons biologiques de macaques rhésus nécessite des précautions particulières, telles que le port d’un équipement de protection individuelle approprié pendant le traitement des échantillons.