Name: Mesure de la distribution granulométrique en turbides Solutions par Dynamic Light Scattering Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Apprenez la diffusion de la lumière dynamique combinée à la microscopie confocale pour mesurer la distribution granulométrique dans les solutions turbides sans dilution. Cette méthode utilise un laser à état solide et un photodétecteur.

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Ce travail a été soutenu financièrement par des subventions pour la recherche scientifique du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie (n° 25248027 à M.S.).

Préparation 1. Echantillon <ol><li> La purification de monomères sensibles à la température <ol><li> Dissoudre 20 g de N -isopropylacrylamide (NIPA) dans 100 ml de toluène. </li><li> Filtrer la solution sous vide pour éliminer la poussière. </li><li> Mélanger le filtrat avec 500 ml d'éther de pétrole. </li><li> Placer le récipient réactionnel dans un bain d'eau glacée. </li><li> Agiter la solution jusqu'à ce que les monomères sont précipités (généralement 30 minutes). </li><li> Filtrer la solution sous aspiration pour obtenir les monomères précipitées. </li><li> Sécher les monomères sous pression réduite (100 Pa) pendant la nuit. </li></ol></li><li> Préparation de la solution de polymère sensible à la température <ol><li> Dégazer 20 mL d'eau déminéralisée pendant 1,0 min en utilisant une pompe à membrane. </li><li> Dissoudre 780,8 mg du PNIA purifié dans 9,5 ml d'eau dégazée et désionisée. </li><li> Placer le récipient réactionnel dans un bain d'eau glacée. </li><li> Bouclier de la réaction dela lumière en recouvrant l'appareil avec du papier d'aluminium. </li><li> Agiter la solution doucement pendant 10 min tout en introduisant un flux modéré de gaz Ar doucement par une pointe de pipette attachée à la bouteille de gaz avec un tube. </li><li> Ajouter 11,9 ul de N, N, N ', N' -tétraméthyléthylènediamine à la solution via une micropipette. </li><li> Agiter la solution pendant 1,0 min, tout en introduisant du gaz Ar, tel que mentionné à l'étape 1.2.5. </li><li> Tout en agitant l'échantillon, on dissout 4,0 mg de persulfate d'ammonium dans 0,5 ml d'eau dégazée et déionisée. </li><li> Mélanger la solution d'échantillon (étape 1.2.7) et une solution de persulfate d'ammonium (étape 1.2.8). </li><li> Agiter la solution pendant 30 s, tout en introduisant du gaz Ar, tel que mentionné à l'étape 1.2.5. </li><li> Couvrir la solution avec du papier d'aluminium et de le conserver au réfrigérateur (4 ° C) pendant la nuit. </li></ol></li><li> Préparation des supports d'échantillons <ol><li> Placer 60 ul de la solution d'échantillon (à partir deétape 1.2.11) dans une glissière de la cavité. </li><li> Couvrir la solution avec un couvercle en verre circulaire. Veillez à ne pas les bulles d'air de piège. </li><li> Retirer l'excès de solution à l'aide d'une micropipette et de laboratoire lingettes. </li><li> Sceller l'échantillon avec de la colle. Laisser sécher la colle à la température ambiante (typiquement 6 h). </li><li> Préparer une autre lame remplie de 0,1% en poids de latex de polystyrène (diamètre de particule de 100 nm) de suspension en suivant les étapes 1.3.1-1.3.4. Cette diapositive est utilisée comme standard. </li></ol></li></ol> 2. Mesure des particules de taille avec un microscope Scattering Dynamic Light <ol><li> Optimisation de l'instrument <ol><li> Placer la lame de suspension de latex de polystyrène (étape 1.3.5) sur la platine du microscope inversé. Le côté du verre de couverture doit faire face vers le bas. </li><li> Placer un amortisseur de faisceau devant le détecteur (une photodiode à avalanche et d'un autocorrélateur). </li><li> Appliquer un faisceau laser (laser à l'état solide, λ = 488 nm, 30 mW, continueonde) à l'échantillon à travers un objectif (10 ×). Une partie de la lumière réfléchie passe par un miroir de lancement du microscope et est observée par une caméra CCD montée à l'orifice latéral du microscope (Figure 1). </li><li> Réglez la hauteur de lentille d'objectif pour régler le point focal à la suspension de l'échantillon en déplaçant la hauteur de lentille de l'objectif de la position basse à élevée. Au cours de cette procédure, l'image réfléchie est focalisée à trois reprises, à la surface du couvercle en verre, à l'interface entre le verre de protection et l'échantillon, et à l'interface entre l'échantillon et le verre de trous glissière. Réglez le point focal entre les deuxième et troisième points. </li><li> Atténuer l'intensité de la lumière diffusée en modifiant la puissance du laser. </li><li> Introduire la lumière diffusée dans le détecteur en supprimant l'amortisseur de faisceau devant le détecteur. Cette unité mesure la corrélation temporelle de l'intensité lumineuse. </li><li> Définir un sténopé (φ = 50 pm) entreen le microscope et le détecteur pour obtenir l'effet confocale. Ajuster la position du trou d'épingle afin de maximiser l'intensité de la lumière au niveau du détecteur. </li><li> Mesurer la fonction de corrélation temporelle de l'intensité de la lumière diffusée pendant 30 secondes en initiant l'opération de corrélateur par l'intermédiaire d'un ordinateur. La fonction de corrélation mesurée est souvent exprimée en g (2) (t) - 1, où t est le temps de corrélation et 4 <img alt="L'équation 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq1.jpg"> . Ici, I (t) est l'intensité de la lumière diffusée à l'instant t et (•••) T est la moyenne de temps. Le temps de décroissance sera d'environ 0,1 ms. </li><li> Réglez le point focal pour obtenir une large gamme pour l'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle (g (2) (t = 0) - 1). NOTE: L'amplitude initiale est fortement affectée par la quantité de lumière réfléchie. En déplaçant le point focal de remorquageard l'interface entre le verre de protection et l'échantillon, la quantité de lumière réfléchie augmente. Pour les diffuseurs de lumière forte, comme du latex de polystyrène, dont l'amplitude initiale peut être modifiée entre 0 et 1. Cependant, il est difficile de régler l'amplitude initiale proche de 1 pour les solutions de polymères les plus courants, car l'intensité de la lumière réfléchie est beaucoup plus élevé que celle de la lumière diffusée. </li><li> Appliquer la transformation de Laplace inverse ( en utilisant le programme de régularisation contraint CONTIN 13,14) à la fonction de corrélation temporelle obtenue pour obtenir la fonction de distribution de taille. Dans les cas où l'amplitude initiale est fixée à moins de 0,2, la fonction de distribution du rayon hydrodynamique montrera un pic pointu autour de 100 nm, ce qui est deux fois le rayon réel (voir la discussion pour plus de détails). </li></ol></li><li> Mesure de l' échantillon <ol><li> Réglez la température de l'étape à 25 ° C. </li><li> Placez une diapositive préparée avec poly-PNIA (PNIPA) solution (étape 1.3.4) sur la platine du microscope. </li><li> Mesurer la fonction de corrélation temporelle de l'intensité de la lumière diffusée en suivant les étapes 2.1.4-2.1.8. Si l'amplitude initiale est supérieure à 0,2, ajuster le point focal pour rendre l'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle inférieure à 0,2 en suivant l'étape 2.1.9. Une petite amplitude initiale simplifie l'analyse. </li><li> Réglez la température de l'étape à 35 ° C et attendre jusqu'à ce que la solution devient trouble. La température de solution critique inférieure (LCST) de solution de PNIPA est de 32 ° C 15. </li><li> Mesurer la fonction de corrélation temporelle par les étapes suivantes 2.1.4-2.1.8. Si possible, régler la position du point focal pour rendre l'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle inférieure à 0,2. Pour les solutions turbides, leurs amplitudes initiales ont tendance à augmenter, étant donné que l'intensité de la lumière diffusée augmente, tandis que celle de la lumière réfléchie reste constante. </li><li> Appliquer l'inverse de Laplace transformatisur les fonctions de corrélation temporelle obtenue pour obtenir les fonctions de distribution de taille. Notez que la taille est la moitié de la valeur obtenue dans le cas où l'amplitude initiale est inférieur à 0,2. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L'amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle dépend fortement du point focal, comme représenté sur la figure 2 (a). Cela contredit apparemment le fait que la solution soit homogène ( à l' exception de la couche mince à l'interface) 8. Cette variation de l'amplitude initiale est attribuée à une variation de la quantité de lumière réfléchie. Théorie hétérodyne partielle 16 prévoit que l'amplitude initiale, A, l'intensité de la lumière diffusée, je s, et l'intensité de la lumière réfléchie, I r, satisfait l'équation suivante 1 <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq2.jpg"> Cette équation montre que la plus grande I r devient plus petit A devient. Par conséquent, A est réduit en réglant la position du foyer à proximité de l'interface. La diffusion apparente D constante A can est obtenue en ajustant la fonction de corrélation temporelle dans le cas des solutions monodisperses: <img alt="l'équation 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq3.jpg"> où <img alt="l'équation 4" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq4.jpg"> . Ici, n est l'indice de réfraction du solvant (eau, 1,33), θ est l'angle dispersé (180 °) et λ est la longueur d' onde de la lumière (514,5 nm). Depuis , nous avons appliqué la géométrie de rétrodiffusion, la valeur de q est fixé. Toutefois, ce point est résolu en utilisant des longueurs d'onde différentes de la lumière. S'il vous plaît noter que tout type de source laser à onde continue est disponible pour construire le microscope DLS. Merci au petit volume irradié, le facteur de cohérence 17 est estimée à plus de 0,99 et est négligeable. Pour les solutions polydispersées, la fonction de distribution D A est obtenue par la transformation de Laplace inverse. e hétérodynes partielsEory prédit aussi que D A ne soit pas la même que la diffusion effective D constante. Ces deux constantes de diffusion satisfont à l'équation suivante: <img alt="l'équation 5" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq5.jpg"> La constante de diffusion D est converti en le rayon hydrodynamique R h en utilisant l'équation de Stokes-Einstein 4. Lorsque A = 1, cette relation devient D A = D. Dans ce cas, le processus de conversion de données est le même que celui de la diffusion dynamique de la lumière commune. La ligne rouge montre la figure 2 (b) correspond à ce cas. En revanche, cette relation devient D A D = 0,5 à la limite de A → 0. Par conséquent, la taille est estimée être deux fois plus grande que la taille réelle lorsque A est faible ( en pratique, inférieure à 0,2), comme le montre la ligne bleue de la figure 2 (b) A est significativement plus faible, l'axe horizontal peut être déplacé, comme représenté sur la figure 2 (c). En principe, nous pouvons convertir D A en D pour toute valeur de A. Dans la pratique, cependant, il est préférable de définir l'amplitude initiale inférieure à 0,2, puisque simple approximation D A ~ 0,5 D est vrai. Les traits saillants de la technique de diffusion de lumière dynamique microscope ont été démontrées en utilisant une solution de PNIPA. La conformation de PNIPA ci - dessous et au- dessus du LCST a été largement étudiée en utilisant un petit angle de diffusion de neutrons 15,18. En revanche, la diffusion de lumière dynamique n'a pas été utilisée pour l'analyse des PNIPA au- dessus de la LCST en raison de sa turbidité 19. Ce problème est résolu par le microscope de diffusion dynamique de la lumière, comme représenté sur les figures 3 (a) et (b). La taille de ces agrégats est plusieurs &amp;# 181; m, qui ne peut être obtenu soit par un petit angle X-ray / diffusion des neutrons ou des techniques de diffusion de la lumière classiques. Les mesures de résolution temporelle à l'aide de ce système donnent des informations sur le processus d'agrégation au cours du changement de température. L'inconvénient du microscope dynamique de dispersion de la lumière est également illustré sur la figure 3. Pour que le résultat ci - dessous de la LCST, la fonction de corrélation temporelle est fortement affectée par la très petite quantité de poussière présente (les lignes noires en figure 3). Par exemple, la fonction de corrélation de temps ne se dégrade pas complètement, même avec des temps de corrélation de l'ordre de 1,0 s. En effet, le volume irradié avec cet appareil (environ 1,0 um) est nettement plus faible que celle irradiée par le dispositif de diffusion de lumière dynamique habituelle (environ 100 pm). Dans le cas où l'intensité de la lumière dispersée est faible, le signal est masqué par le bruit, telle que celle causée par l'artles montants du centre commercial de la poussière dans la solution. Par conséquent, les trois pics représentés sur la figure 3 (b) peuvent ne pas avoir d' importance quantitative , bien que l'ordre général de la taille est significative. A noter qu'un tel disperseur faible peut être mesurée par un appareil classique de diffusion de lumière dynamique. Nous avons démontré que le microscope dynamique de diffusion de la lumière nous permet de mesurer des échantillons à la fois transparents et turbides avec la même configuration. Etant donné que la longueur du trajet optique dans les échantillons est courte, cette technique peut être appliquée à des échantillons de solides absorbant la lumière, tels que des suspensions de nanotubes de carbone 20. En outre, en raison de sa haute résolution spatiale, cette technique peut être appliquée à des cellules biologiques. Pour son application à la biologie, ce procédé peut également être combiné avec d'autres techniques d'imagerie, telles que la fluorescence et l'imagerie Raman. Ainsi, nous pensons que le microscope dynamique de diffusion de la lumière est un outil puissant pour un large éventail de domaines de recherche.

<classe p='jove_content'>La taille des particules est l’une des propriétés les plus fondamentales des solutions colloïdales et polymères. De nombreuses techniques sont utilisées pour mesurer la taille des particules. Les particules de 1,0 m ou plus peuvent être mesurées directement à l’aide d’un microscope optique. Pour les particules plus petites, d’autres techniques, telles que la diffraction laser, la microscopie électronique ou la microscopie à force atomique, sont utilisées2,3. La diffusion dynamique de la lumière est une technique couramment utilisée pour mesurer les distributions granulométriques dans les solutions4. Les résultats obtenus à l’aide de cette technique ne sont pas dérivés d’images des particules mais du temps caractéristique des fluctuations de l’intensité de la lumière diffusée. Ces fluctuations proviennent du mouvement brownien, qui est caractérisé par une constante de diffusion. La distribution granulométrique est obtenue à partir de la distribution des constantes de diffusion à l’aide de l’équation d’Einstein-Stokes. En raison de sa simplicité, la diffusion dynamique de la lumière est largement utilisée pour l’évaluation de routine de solutions, telles que les peintures et les colloïdes alimentaires.
Un prétraitement est nécessaire pour la plupart des techniques utilisées pour la mesure de la taille des particules d’échantillons de solution. Dans le cas de la microscopie électronique et de la microscopie à force atomique, l’échantillon doit être analysé sous vide. Par conséquent, il est difficile d’observer les échantillons dans leurs formes natives. De plus, pour la diffraction laser et la diffusion dynamique de la lumière, seuls les échantillons dilués exempts de diffusion multiple et d’absorption de lumière peuvent être mesurés. Pour surmonter cette difficulté, plusieurs nouvelles techniques ont été proposées pour la mesure de la diffusion dynamique de la lumière à partir de solutions concentrées non diluées, telles que la spectroscopie de corrélation croisée5,6, la diffusion dynamique de la lumière à faible cohérence7,8, la spectroscopie d’ondes diffusantes9,10 et la microscopie dynamique différentielle11,12.
Nous avons développé un nouvel appareil appelé microscope à diffusion dynamique de la lumière1. Cet appareil nous permet de mesurer des échantillons troubles sans dilution au moyen d’un système optique confocal dans lequel la diffusion multiple est éliminée à l’aide d’un sténopé. Cependant, la procédure de mesure et l’analyse des données sont légèrement plus compliquées que celles des instruments disponibles dans le commerce. Cette vidéo explique en détail la procédure de mesure et l’analyse des données à l’aide de l’analyse du polymère sensible à la température, le poly(N-isopropylacrylamide), à titre d’exemple.

<table><tbody><tr><td>N-isopropylacrylamide, 98 %</td> <td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>I0401</td><td></td></tr><tr><td>toluène, 99 %</td> <td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>201-01876</td><td></td></tr><tr><td>Éther de pétrole, température de distillation 30 ~ 60 &deg ; C</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-22565</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine, 99</td> % Persulfate <td>d’ammonium Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>, 98 %</td> <td>Sigma</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>suspension de latex de polystyrène, 1 % poids %</td><td>Duke Scientific Corporation</td><td>3500A</td><td></td></tr><tr><td>argon</td><td>Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.</td><td></td><td>pureté > 99.999 vol. %</td></tr><tr><td>cavity slide</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>83-0336</td><td></td></tr><tr><td>microscope inversé</td><td>Nikon Instech Co., Ltd.</td><td>ECLIPSE Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate</td><td>Tokai Hit CO.,Ltd</td><td>TP-108R-C</td><td></td></tr><tr><td>Laser à semi-conducteurs</td><td>Cohérent</td><td>OBIS 488LX</td><td></td></tr><tr><td>photodiode d’avalanche</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-High Q.E. Photodiode</td><td></td></tr><tr><td>corrélateur</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-5000/EPP</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la distribution granulométrique en turbides solutions par dynamic light scattering microscopie

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Un protocole de mesure de la polydispersité de solutions de polymères concentrés à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière est décrit. La diffusion dynamique de la lumière est une technique utilisée pour mesurer la distribution granulométrique des solutions de polymères ou des particules colloïdales. Bien que cette technique soit largement utilisée pour l’évaluation des solutions polymères, il est difficile de mesurer la taille des particules dans les solutions concentrées en raison de l’effet de diffusion multiple ou de la forte absorption de la lumière. Par conséquent, les solutions concentrées doivent être diluées avant la mesure. La mise en œuvre de la composante optique confocale dans un microscope à diffusion dynamique de la lumière1 permet de surmonter cet obstacle. En utilisant un tel système microscopique, les systèmes transparents et troubles peuvent être analysés dans le même dispositif expérimental sans dilution. À titre d’exemple représentatif, une mesure de la distribution granulométrique d’une solution de polymère sensible à la température a été effectuée. La taille des chaînes polymères dans une solution aqueuse était de plusieurs dizaines de nanomètres à une température inférieure à la température critique inférieure de la solution (LCST). En revanche, les tailles augmentaient à plus de 1,0 μm au-dessus du LCST. Ce résultat est cohérent avec l’observation selon laquelle la solution est devenue trouble au-dessus du LCST.

Les fonctions de temps de corrélation de l' intensité de lumière diffusée pour une suspension de latex de polystyrène (rayon des particules: 50 nm) ont été mesurés à différents points de contact, comme représenté sur la figure 2 (a). Ces fonctions de corrélation ont été transformés en les fonctions de distribution du rayon hydrodynamique par la transformation de Laplace inverse (voir figure 2 (b) et (c)). En utilisant la même procédure, les fonctions de corrélation temporelle et les fonctions de distribution du rayon hydrodynamique de la solution PNIPA ont été obtenus à 25 ° C et 35 ° C, respectivement. Figures 3 (a) et (b) montrent les fonctions de corrélation temporelle de l'intensité de la lumière diffusée et les fonctions de distribution de taille correspondantes de la solution de PNIPA ci - dessous (25 ° C) et au- dessus (35 ° C) la LCST. Les fonctions de distribution granulométrique ont été obtenus par la transformation de Laplace inverse suivie par lacorrection de la hétérodyne partielle. Le rayon hydrodynamique moyen inférieur à la LCST est de plusieurs dizaines de nanomètres, ce qui est typique pour des solutions de polymère. En revanche, le rayon hydrodynamique au-dessus de la LCST est d'environ 1,0 pm. Ce résultat est cohérent avec le fait que la solution est trouble au-dessus de la LCST. Les lignes bleues et rouges sur la figure 3 représentent la répartition granulométrique des solutions obtenues PNIPA immédiatement après et 20 minutes après que la solution devienne turbide, respectivement. La figure 3 (b) montre clairement la croissance de l'agrégat. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig1.jpg"> Figure 1. Schéma du microscope dynamique de diffusion de lumière. Sténopé (PH), diviseur de faisceau (BS), polariseur (Pol), et photodiode à avalanche (APD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir</a>une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig2.jpg"> Figure 2. Les résultats représentatifs pour une suspension de latex de polystyrène. (A) fonctions temps de corrélation de l'intensité de la lumière diffusée pour la suspension de latex de polystyrène. Le rayon nominal est de 50 nm et la concentration est de 0,1% en poids. Deux ensembles de données ont été obtenues à partir de différents points de diffusion. (B), (c) les fonctions de distribution de taille correspondante de la suspension de latex de polystyrène obtenus par la transformation de Laplace inverse de (a). La ligne rouge correspond à la fonction de corrélation temporelle, dont l'amplitude initiale est d'environ 1,0, et la ligne bleue correspond à celle d'une amplitude initiale qui est d'environ 0,2. L'axe horizontal a été calculé sans (b) et (c) compte tenu de l'effet de hétérodynage partiel (PHD) lorsque A &lt;&lt; ; 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig3.jpg"> Figure 3. Les résultats représentatifs pour une solution de PNIPA. (A) les fonctions Temps de corrélation d'intensité de la lumière diffusée pour la solution de PNIPA. (B) des fonctions de distribution de dimensions correspondantes pour la solution de PNIPA obtenue par la transformation de Laplace inverse de (a). L'axe horizontal a été calculée en tenant compte de l'effet de hétérodynage partielle pour chaque ensemble de données. La ligne noire représente les données obtenues à 25 ° C. La ligne rouge représente les données obtenues juste après que la solution devienne turbide (35 ° C). La ligne bleue représente les données obtenues après une mesure de 20 min de la ligne rouge./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "&gt; S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Un protocole pour la mesure directe de la distribution des tailles des particules dans des solutions concentrées en utilisant la microscopie de diffusion dynamique de la lumière est présenté.

Mesure de la distribution granulométrique en turbides Solutions par Dynamic Light Scattering Microscopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

L’objectif général de cette expérience est de démontrer que la diffusion dynamique de la lumière et la microscopie confocale peuvent être utilisées pour mesurer la distribution granulométrique dans des solutions troubles sans dilution. Il s’agit de la configuration du microscope à diffusion dynamique de la lumière. Il dispose d’un laser à semi-conducteurs capable d’un fonctionnement en ondes continues de 30 milliwatts à 488 nanomètres.Il y a aussi une photodiode d’avalanche, un autocorrélateur connecté à un ordinateur pour les mesures. Le microscope inversé de la configuration est doté d’une platine avec un régulateur de température. La boîte contient les éléments optiques restants nécessaires à l’expérience.Ce schéma fournit une vue plus complète de la mise en page pour la configuration. Après avoir façonné le profil du faisceau, le faisceau est introduit dans le microscope. La diffusion de la lumière est obtenue à l’aide d’une géométrie de rétrodiffusion et guidée vers un détecteur.Un miroir de lancement permet d’observer une partie de la lumière réfléchie via une caméra CCD. Les échantillons pour l’expérience doivent être préparés un jour à l’avance. La préparation des échantillons nécessite 20 millilitres d’eau dégazée et déminéralisée ainsi que du NIPA purifié.De plus, il nécessite de petites quantités de TMEDA et de persulfate d’ammonium. Les étapes de préparation utilisent également un bain d’eau glacée sur un agitateur, deux récipients de réaction, une feuille d’aluminium et une source de flux de gaz argon. Commencez par mesurer 9,5 millilitres d’eau dégazée et déminéralisée dans un récipient de réaction.Ajoutez le NIPA à l’eau. Ensuite, déplacez le récipient de réaction dans le bain d’eau glacée sur l’agitateur et ajoutez la tige d’agitation. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir le bain et le récipient pour protéger la réaction de la lumière.Utilisez une pointe de pipette connectée à la source d’argon pour organiser un écoulement modéré d’argon dans la solution. Allumez l’agitateur pour remuer doucement la solution pendant 10 minutes. Ensuite, utilisez une micropipette pour mesurer 11,9 microlitres de TMEDA.Brièvement, tirez la feuille pour ajouter le TMEDA à la solution, puis continuez à remuer sous le gaz argon pendant encore une minute. Pendant que l’échantillon est agité, travaillez avec le deuxième récipient de réaction. Placez 4 milligrammes de persulfate d’ammonium dans le récipient.Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre d’eau dégazée et déminéralisée. Lorsque le persulfate d’ammonium s’est dissous, ajoutez la solution à la solution de l’échantillon et continuez à agiter pendant 30 secondes sous un flux d’argon. Après 30 secondes, retirez le récipient de réaction du bain de glace et de l’agitateur.En préparation du stockage, couvrez le récipient avec du papier d’aluminium, déplacez la solution dans un réfrigérateur pour une conservation à quatre degrés Celsius pendant la nuit avant de l’utiliser. Après avoir récupéré la solution d’échantillon, préparez-la pour l’utilisation au microscope. Préparez deux lames de cavité, deux couvercles circulaires en verre et de la colle appropriée, afin de fabriquer un échantillon et une lame de référence standard.Pour la lame d’échantillon, mesurez 60 microlitres de la solution d’échantillon. Placez la solution dans l’une des lames de la cavité. Couvrez la solution avec un couvercle circulaire, en prenant soin de ne pas piéger les bulles d’air.Retirer l’excédent de solution à l’aide d’un micropipette et de lingettes de laboratoire. Ensuite, appliquez de la colle sur le périmètre du couvercle afin de sceller la lame de solution. Ensuite, créez une référence standard.Pour cela, utilisez une solution de latex de polystyrène à 0,1 % en poids. Dans la deuxième lame de cavité, ajoutez 60 microlitres de solution de latex de polystyrène, couvrez-la d’un couvercle en verre et assurez-vous qu’aucune bulle n’est piégée. Après avoir retiré tout excès de solution, appliquez de la colle pour sceller la solution dans la lame.Pour les deux diapositives, laissez la colle sécher à température ambiante. À ce stade, apportez la lame de référence au microscope inversé équipé d’une lentille 10 fois l’objectif et placez-la sur la platine du microscope. La vitre de protection doit être orientée vers le bas.Continuez en plaçant un amortisseur de faisceau devant le détecteur. Ensuite, appliquez le faisceau laser sur l’échantillon à travers la lentille de l’objectif. Passez au travail avec l’objectif.Ajustez la hauteur de l’objectif pour définir le point focal. Vu avec le CCD, lorsque l’objectif s’élève de sa position la plus basse, l’image réfléchie se concentre d’abord sur la surface du verre de protection. Il se concentrera ensuite sur l’interface entre le verre de protection et l’échantillon.Il se concentrera une troisième fois sur l’interface entre l’échantillon et le verre de la lame. Définissez le point focal entre l’interface de l’échantillon de couverture et l’interface de la diapositive d’échantillon. Atténuez la lumière diffusée en réduisant la puissance du laser.Ensuite, retirez le bloc de faisceau pour introduire la lumière diffusée dans le détecteur. Lorsque vous êtes prêt, lancez une mesure de corrélation temporelle de 30 secondes via l’ordinateur de contrôle. Ensuite, ajustez le point focal du microscope avant de répéter la mesure.Utilisez plusieurs points focaux pour obtenir une large plage pour l’amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle. Lorsque suffisamment de données ont été collectées, placez un amortisseur de faisceau devant le détecteur. Au microscope, retirez la lame de référence standard.Démarrez le processus de mesure de l’échantillon avec une platine de microscope vide et réglez la température à 25 degrés Celsius. Ensuite, placez la lame d’échantillon préparée sur la scène avec le couvercle vers le bas. Ajustez la hauteur de la lentille de l’objectif pour identifier l’interface de l’échantillon de couverture.Ajustez-le davantage pour trouver l’interface de l’exemple de diapositive. Pour la mesure, réglez le point focal entre ces deux positions. Retirez l’amortisseur de faisceau situé devant le détecteur.Sur l’ordinateur, effectuez une mesure de corrélation temporelle de 30 secondes. Ensuite, réglez la température de la scène sur 35 degrés Celsius. Étant donné que cette température tempérée est supérieure à la température critique inférieure de la solution, la solution passera de claire à trouble.Effectuez une autre mesure de la fonction de corrélation temporelle. Voici les fonctions de corrélation temporelle pour la suspension en latex de polystyrène standard à deux points focaux différents. La courbe rouge correspond à une fonction de corrélation temporelle dont l’amplitude initiale est d’environ un.La courbe bleue correspond à une amplitude initiale d’environ 0,2. Il s’agit de la distribution de taille obtenue par la transformée de Laplace inverse des données avec une amplitude initiale de 0,2. Le calcul prend en compte l’effet de l’hétérodynation partielle.Le rayon nominal des particules est de 50 nanomètres. Ces fonctions de corrélation temporelle sont pour le poly(NIPA) au-dessous et au-dessus de la température critique inférieure de la solution. La courbe noire correspond à une mesure à 25 degrés Celsius.La courbe rouge correspond à une mesure à 35 degrés Celsius, et immédiatement après, la solution est devenue trouble. La courbe bleue correspond à une mesure à 35 degrés Celsius, 20 minutes après que la solution soit devenue trouble. Voici les distributions de taille associées à chacune des conditions de mesure.En dessous de la température critique inférieure de la solution, le rayon hydrodynamique moyen est de plusieurs dixièmes de nanomètres. Au-dessus de la température critique, la taille est d’environ 1 micromètre. Le décalage des courbes avec tempéré et temporel suggère la croissance de l’agrégation.

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Chemistry

Chimie

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

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