La combinaison humide et Techniques de laboratoire sec Guide pratique du Cristallisation de grandes superhélice contenant des protéines

L’objectif global de cette procédure est d’identifier et de tester rapidement les limites de domaine possibles au sein des protéines à grandes bobines enroulées afin d’améliorer la probabilité de trouver un fragment intrinsèque qui cristallisera. Cette méthode peut aider les chercheurs à rationaliser le processus de cristallisation des protéines à grandes bobines, qui peuvent être notoirement difficiles à cristalliser. L’avantage de cette technique est qu’elle intègre à la fois des méthodes expérimentales et informatiques pour identifier et filtrer rapidement les candidats probables à la cristallisation, améliorant ainsi leurs chances de succès.

Jenna Zalewski, étudiante diplômée dans mon laboratoire, et Keith O’Conor, chercheur de premier cycle dans mon laboratoire, feront la démonstration de cette technique. Pour commencer, combinez les résultats d’outils Web établis pour générer des prédictions des limites de domaine possibles de la bobine enroulée, comme décrit dans le protocole texte. Après avoir généré des plasmides d’expression et testé leurs niveaux d’expression comme détaillé dans le texte, commencez la purification de chaque souche qui a réussi à exprimer la protéine marquée Ruby.

Pour lyser les cellules, il faut d’abord remettre en suspension chaque pastille cellulaire décongelée dans 1,5 millilitre de tampon de lyse qui a été complété par des inhibiteurs de protéase. Ajouter 30 microlitres de lysozyme à une concentration de 10 milligrammes par millilitre et incuber à température ambiante pendant 20 minutes, puis soniser en suivant les instructions de l’instrument utilisé. Centrifuger l’échantillon dans une centrifugeuse de table pendant 30 minutes à 14 000 fois G sur une matière insoluble en granulés ou des cellules non lysées.

Conservez le surnageant et la pastille pour une analyse ultérieure via SDS-PAGE. Pour effectuer la purification par affinité de nickel, incubez d’abord 100 microlitres de billes de nickel NTA, prélavées dans un tampon de lyse avec le lysat soluble pendant cinq à 10 minutes. Retournez la suspension plusieurs fois pour mélanger les billes.

Centrifugez l’échantillon à 800 fois G pendant 30 secondes dans une centrifugeuse de table pour granuler les billes. Ensuite, lavez la pastille trois à cinq fois avec un tampon de lyse pour éliminer les contaminants non spécifiques. Enfin, éluez la protéine de fusion Ruby des billes avec un tampon de lyse, complété par une molaire imidazole.

À l’aide d’un spectrophotomètre réglé à 280 nanomètres, on mesure la concentration de la protéine de fusion Ruby, puis on évalue l’homogénéité de l’échantillon en chargeant un à cinq microgrammes de protéine de fusion sur un gel natif de PAGE. Faites fonctionner le gel PAGE 10 % natif à quatre degrés Celsius pendant 140 minutes à 175 volts. Imagez la PAGE native à l’aide d’un imageur équipé pour visualiser la fluorescence, en observant où la fusion marquée Ruby migre dans ce test.

Effectuez une protéolyse limitée pour identifier les domaines repliés de manière stable en incubant d’abord 95 microlitres de fusion Ruby-Shroom SD2 avec cinq microlitres de 0,025 Subtilisine A.Échantillonnez la réaction à des points temporels de zéro, 0,5, deux, cinq, 15, 60 et 120 minutes, en retirant 10 microlitres de la réaction pour chaque point temporel et en visualisant la progression de la réaction via SDS-PAGE à l’aide d’un gel d’acrylamide à 15 %. Teindre le gel avec du bleu Coomassie pour évaluer si une espèce résistante à la protéase peut être identifiée. Intégrez les données de l’efficacité de la purification, du comportement dans la PAGE native et de la protéolyse limitée sur les protéines de fusion mRuby2-Shroom partiellement purifiées dans une évaluation complète du comportement global de ces protéines en solution.

Effectuez des expressions à grande échelle avec des cultures de deux litres de mRuby2-Shroom SD2 dans le but d’obtenir cinq à 20 milligrammes d’échantillon complètement purifié. Après la croissance cellulaire, granulez les cellules par centrifugation à 8 000 fois G pendant 10 minutes. La pastille de cellule résultante peut être stockée à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire.

Ensuite, remettez la pastille en suspension dans environ huit millilitres de tampon de lyse par gramme de pastille cellulaire congelée. Lyser les cellules remises en suspension à l’aide d’un homogénéisateur. Après la lyse cellulaire, granulez les débris cellulaires par centrifugation à 30 000 fois G pendant 30 minutes.

Ensuite, liez la fraction soluble à l’aide de 10 millilitres de résine de nickel NTA prélavée. Versez la suspension de billes dans une colonne de gravité appropriée et laissez les protéines non liées s’écouler, puis lavez la résine trois à cinq fois avec 40 millilitres de tampon de lyse, suivi d’un lavage avec un tampon de lyse complété par une molaire de chlorure de sodium. Effectuez un lavage final de la résine avec 40 millilitres de tampon de lyse complété par 80 millimolaires d’imidazole.

Éluez la protéine de fusion Ruby-Shroom avec 40 millilitres de tampon de lyse contenant une molaire imidazole. Fractionnez manuellement la protéine éluée en fractions de quatre à 10 millilitres. Confirmez les fractions contenant la protéine de fusion Ruby-Shroom à l’aide d’un gel SDS-PAGE à 10 %.

Ajoutez un milligramme de protéase TEV pour 25 à 50 milligrammes de protéine de fusion pour éliminer l’étiquette Ruby. Ensuite, dialysez les fractions appropriées dans le tampon de clivage TEV à l’aide d’une tubulure de dialyse de coupure de poids moléculaire de six à huit kilodaltons. Dialysez les protéines pendant la nuit à température ambiante en agitant lentement.

Après la dialyse, répétez les étapes de purification par affinité de nickel. Le domaine Shroom-SD2 doit s’écouler dans la fraction non liée tandis que l’étiquette Ruby reste liée à la résine. À l’aide d’un concentrateur de spin, concentrez les fractions de pic à environ 10 milligrammes par millilitre, puis effectuez une chromatographie d’exclusion stérique en analysant les fractions de pic via un gel SDS-PAGE à 12 %.

Après avoir regroupé les fractions de pointe, dialysez la solution dans un tampon de cristallisation, puis concentrez la protéine dialysée à 10 milligrammes par millilitre avant la cristallisation. Passez au crible un petit nombre de 12 conditions afin d’identifier une concentration optimale de protéines pour les essais de cristallisation à l’aide de 24 plateaux de cristallisation bien installés. Effectuer des essais de cristallisation à l’aide de la méthode de diffusion de vapeur.

Tout d’abord, pipetez 500 microlitres de chacune des 12 conditions dans des puits séparés. Sur chaque piédestal, faites des gouttes contenant un microlitre de bonne solution et un microlitre d’échantillon de protéines. Scellez rapidement le plateau avec du ruban adhésif transparent, puis déplacez-le dans un environnement approprié à température contrôlée et sans vibrations.

Examinez les gouttes dans les plateaux au cours des trois prochains jours à l’aide d’un microscope à un grossissement allant jusqu’à 100X. À la fin de la période de trois jours, notez chaque goutte comme ne contenant pas de précipitations, de faibles précipitations, de fortes précipitations ou de cristaux. Une concentration appropriée en protéines ne doit pas contenir plus de six fortes précipitations.

À l’aide de la concentration protéique déterminée, cribler une large gamme de tamis de cristallisation disponibles dans le commerce. L’utilisation d’un robot de manipulation ou de cristallisation de liquides accélère considérablement ce processus tout en minimisant les erreurs dans les gouttes. Il nécessite beaucoup moins de protéines, ce qui permet à l’utilisateur de dépister plus de conditions avec un seul échantillon.

Améliorez les conditions initiales identifiées à partir de tamis larges en faisant varier systématiquement chacune des variables de la goutte de cristallisation à l’aide de plateaux de tamis à 24 puits, comme auparavant. La protéolyse limitée est utilisée pour identifier les régions de la protéine qui pourraient être flexibles ou autrement plus accessibles à la protéase. Voici un modèle de dégradation pour un domaine SD2 sensible au point de vue protéolytique et un autre qui est assez stable.

Une protéolyse limitée a été réalisée dans le contexte des protéines de fusion Ruby. Dans ce cas, la séquence de liaison entre Ruby et le domaine SD2 a été rapidement clivée, comme prévu, mais les fragments Ruby et SD2 résultants sont restés largement stables. L’analyse par PAGE natif peut rapidement révéler de bons candidats pour la cristallisation.

Quatre complexes de champignons et de roches avec différentes batteries de protéines ont été exécutés sur des gels PAGE natifs. Le complexe contenant les roches 834 à 913 avait le meilleur comportement et cristallisait facilement, tandis que les autres ne cristallisaient qu’à la dégradation ou ne cristallisaient pas entièrement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer un ensemble de limites de domaine potentielles pour votre grande protéine à bobine enroulée et de la façon d’utiliser le système Ruby pour identifier rapidement et rapidement les meilleurs candidats pour la cristallisation.

Bien que la cristallographie reste une entreprise qui prend du temps, l’utilisation de cette technique concentrera votre recherche de protéines qui cristallisent à l’aide de tests simples pour éliminer les candidats médiocres, ce qui vous permettra de passer plus de temps sur les candidats ayant les meilleures chances de succès. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de n’oubliez pas d’inclure autant d’informations que possible lors de la sélection de vos limites de domaine possibles. Les informations que vous choisissez de sélectionner lors de l’utilisation de cette procédure varieront pour chaque protéine.

Si possible, d’autres méthodes, comme des tests cellulaires ou biochimiques, doivent être effectuées pour s’assurer que les fragments de protéines en question contiennent toujours la fonction d’intérêt biologique. Bien que cette méthode soit axée sur les protéines enroulées, le cadre général pourrait facilement être adapté à presque toutes les protéines. N’oubliez pas que travailler avec certains instruments et réactifs biologiques peut être dangereux, et que des précautions, telles que l’utilisation de gants ou le port de lunettes de protection, doivent toujours être suivies lors de l’exécution de cette procédure.