Cinématique Analyse de la division cellulaire et Expansion: Quantifier la base cellulaire de la croissance et du développement d'échantillonnage Zones dans Zea mays Feuilles

Les objectifs généraux de cette analyse sont de déterminer la base cellulaire de la croissance des feuilles de maïs et d’utiliser ces données pour étudier les mécanismes de régulation de la croissance moléculaire en mettant en œuvre des stratégies d’échantillonnage spécifiques au développement. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé de la biologie du développement des plantes. Comment la division cellulaire et l’expansion cellulaire contribuent-elles aux différences dans la croissance de l’organe entier ?

Cette approche permet l’étude et la cartographie spatiale des processus biochimiques moléculaires et physiologiques, sous-jacents à la croissance de l’ensemble de l’organe de la plante. Bien que ce système puisse donner un aperçu de la croissance des feuilles de maïs, la technique peut être utilisée pour d’autres systèmes. Y compris d’autres espèces de graminées et d’organes.

La démonstration visuelle de ces méthodes est essentielle. Lors de la récolte, les étapes de bi-blation et de mesure des échantillons sont difficiles à réaliser sans cette démonstration. Katrien Sprangers et Viktoriya Avramova feront la démonstration de la procédure.

Deux doctorants de mon laboratoire. Pour effectuer une analyse chenématique complète de la croissance foliaire chez les monocotylédones, cultivez au moins 15 plantes pour chaque traitement et génotype, dans des conditions contrôlées dans une salle de croissance. Lorsqu’une feuille d’intérêt apparaît, utilisez une règle pour mesurer la longueur de la feuille, c’est-à-dire la longueur du sol à l’extrémité de la feuille, quotidiennement jusqu’à ce que la feuille soit complètement déployée.

Au stade de développement d’intérêt, coupez la partie aérienne de la plante à partir d’au moins cinq plantes représentatives aussi près que possible des racines, pour garder la région méristématique intacte. Ensuite, en commençant par les feuilles extérieures, déroulez doucement toutes les feuilles jusqu’à la feuille d’intérêt, une par une. Retirer quelques millimètres supplémentaires de la base pour détacher les feuilles si nécessaire.

Ensuite, retirez l’apex et les petites feuilles entourées de la feuille d’intérêt et coupez un segment de trois centimètres de la feuille, en partant de la base d’un côté de la nervure médiane. Il est crucial de couper la feuille à l’endroit même où elle est reliée à la tige. Comme une coupe trop élevée, conduirait à une sous-estimation de la taille du méristème.

Conservez le segment dans un tube à essai de 1,5 millilitre, rempli de trois deux une solution absolue d’éthanol et d’acide acétique volume par volume, à quatre degrés Celsius pendant 24 heures jusqu’à plusieurs mois. De l’autre côté de la veine, coupez un segment de 11 centimètres à partir de la base et stockez ce segment dans un tube de 15 millilitres rempli d’éthanol absolu, à quatre degrés Celsius pendant au moins six heures pour éliminer les pigments. Après une deuxième série de 24 heures dans de l’éthanol absolu à quatre degrés Celsius, remplacez l’éthanol par de l’acide lactique pur et stockez le segment à quatre degrés Celsius pendant 24 heures supplémentaires, ou jusqu’à une analyse plus approfondie.

Pour mesurer le méristème, transférez d’abord le segment de feuille de trois centimètres dans un tampon de rinçage fraîchement préparé pendant 20 minutes. À la fin de l’incubation, transférez le segment dans un récipient de solution de coloration Dapi, pendant deux à cinq minutes sur de la glace dans l’obscurité. Ensuite, montez rapidement le tissu sur une lame de microscope en verre et couvrez le segment avec un verre de protection.

Confirmez les fluorescences des cellules épidermiques au microscope, en utilisant la fluorescence UV. Ensuite, montez l’échantillon dans une goutte de tampon de rinçage sur une nouvelle lame de microscope avec un nouveau couvercle en verre. À l’aide d’un grossissement de 20 fois, renvoyez le segment au microscope et faites défiler l’échantillon pour localiser les figures mitotiques prolifératives.

Évitez toute division cellulaire formative des stemmes en développement, puis définissez où se trouve la figure mitotique la plus distale. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, mesurez toute la longueur du cadre de l’image. Dans cet exemple, 645 micromètres.

Comptez ensuite le nombre de cadres qui couvrent toute la longueur du méristème, de la figure mitotique la plus distale à la base de la feuille, et multipliez ce nombre par la longueur d’un cadre pour obtenir la longueur totale du méristème. Pour obtenir un profil de longueur cellulaire, transférez le segment de 11 centimètres de l’acide lactique sur le banc et utilisez un scalpel pour couper le tissu en 10 segments d’un centimètre. Montez les segments de feuilles résultants sur une seule lame de microscope et une petite goutte d’acide lactique.

Placez toutes les pièces avec le même côté vers le haut. Ensuite, transférez la lame sous un microscope équipé d’une optique de contraste interférentiel différentiel. En commençant par le segment le plus proche de la base de la feuille, utilisez un logiciel d’analyse d’images approprié pour mesurer la longueur d’au moins 20 cellules épidermiques répliquées et des fichiers directement adjacents aux fichiers stemmataux, afin d’assurer la sélection cohérente du même type de cellule à des positions également espacées le long de chacun des segments.

Prenez la position correspondante pour chaque mesure sur toute la feuille. Déterminez ensuite la longueur moyenne de la cellule à chaque millimètre le long de l’axe de la feuille à l’aide d’une procédure de lissage polynomial local implémentée dans le script R qui est disponible en tant que fichier supplémentaire un. Attention à ne pas trop lisser.

Le lissage doit supprimer le bruit dans les données de plafond, mais ne pas affecter la forme globale de la courbe. Ici, une comparaison entre les plantes bien arrosées et les plantes soumises à des conditions de stress hydrique en termes de croissance foliaire est montrée. La longueur finale des feuilles des plantes témoins était inférieure de 40 % à celle des plantes stressées par la sécheresse, en raison d’un taux d’allongement des feuilles plus faible.

Le taux d’allongement des feuilles des plantes stressées par la sécheresse est inférieur de 73 pour cent à celui des témoins bien arrosés, en raison d’une production cellulaire réduite. Ce qui, chez la sterne, est principalement causé par un taux de division cellulaire réduit. L’analyse cinématique fournit une carte de la localisation de la zone de croissance des feuilles, ce qui permet un échantillonnage avec une résolution sous-zonale pour l’analyse moléculaire et biochimique.

Par exemple, la quantification de la MDA le long de la zone de croissance de la feuille de maïs chez les plantes soumises à des conditions de contrôle et de sécheresse bien arrosées, démontre une augmentation significative de ce produit de la dégradation des lipides dans toute la zone de croissance en réponse aux conditions de rétention d’eau. En raison du raccourcissement des feuilles en réponse à la sécheresse, les zones de développement ne correspondaient pas chez le témoin et chez les plantes stressées dans cette expérience. Cependant, à l’aide du profil de longueur des cellules, la longueur des zones de développement peut être déterminée, ce qui permet de comparer les niveaux de MDA dans les zones individuelles.

Une fois maîtrisé, un seul échantillon peut être traité en quatre heures, si la technique est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder le méristème intact pendant sa récolte. Suite à cette procédure, d’autres techniques peuvent être appliquées, telles que la détermination de paramètres moléculaires et biochimiques, pour étudier leur implication dans la régulation de la croissance.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la division cellulaire et l’expansion cellulaire dans les feuilles de maïs en croissance, de déterminer la taille des différentes zones de croissance et d’interpréter les données moléculaires et biochimiques en conséquence. N’oubliez pas que travailler avec des acides lactique et acétique et de l’EDTA peut être dangereux. Par conséquent, des précautions telles que le port de gants et le nettoyage de chaque étape du microscope après utilisation doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.