Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier Drosophila Larvaire Ramper Comportement

L’objectif global de cette procédure est d’observer la drosophile au stade larvaire rampant dans un canal d’agarose linéaire pour étudier le développement des circuits neuronaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la neuroéthologie et de la biologie du développement, telles que la compréhension des codes neuronaux qui génèrent des modèles moteurs et l’identification des processus génétiques et cellulaires clés qui définissent les circuits neuronaux pour le contrôle du mouvement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle restreint le répertoire de comportement larvaire afin que les chercheurs puissent étudier en détail un seul motif multiple.

La démonstration de la procédure sera assurée par Zarion Marshall, un technicien de mon laboratoire. Tout d’abord, il est important d’évaluer la santé de la larve. Trois à quatre jours avant l’enregistrement, remplacez la plaque de collecte de la cage des adultes.

Procédez à cette opération quotidiennement et à la même heure de la journée. Comptez les œufs et les larves nouvellement écloses sur l’assiette. Le nombre d’œufs attendu se situe entre 500 et 2 000.

Ajustez le nombre d’adultes dans la cage au besoin. Nous examinons la plaque 24 heures plus tard pour déterminer si les larves sont en bonne santé. La plupart des œufs auraient dû éclore en larves, et les larves auraient dû ramper dans la pâte de levure.

Les signes d’une mauvaise santé comprennent un grand nombre d’œufs non éclos, des corps larvaires morts loin de la pâte de levure et des larves avec des taches inhabituellement sombres dans l’abdomen qui sont un indicateur d’une réaction immunitaire. Si les larves semblent malsaines, changez la cage à l’aide d’assiettes fraîchement préparées et vérifiez le génotype des adultes. Pour l’expérience, prélever des larves de deuxième stade nouvellement écloses dans des assiettes âgées d’un à deux jours.

Toutes ces étapes peuvent être utilisées dans l’analyse. Pour ce protocole, disposez d’un moule de coulée PDMS à canal linéaire. Nettoyez le moule de coulée avec de l’alcool isopropylique.

Une fois sec, placez le moule dans un couvercle de dix centimètres ou un récipient similaire. Remplissez ensuite le moule avec trois pour cent d’agarose refroidi à 55 degrés Celsius. Versez l’agarose avec précaution pour éviter de piéger des bulles d’air dans le moule.

Le moule doit être juste recouvert par l’agarose. Une fois solidifié, retirez les canaux d’agarose du moule. Coupez les bords des canaux en forme de disque, puis plongez les canaux dans l’eau.

Ils peuvent être conservés dans de l’eau à quatre degrés Celsius jusqu’à sept jours. Avant d’utiliser les canaux, laissez-les se réchauffer à température ambiante. Sélectionnez un canal qui correspond à la largeur de la larve.

Les canaux ont une largeur de 100 à 300 microns et une profondeur de 150 microns. Ensuite, utilisez une lame de rasoir propre pour couper un seul canal du disque préparé. À l’aide d’une pince, transférez le canal sur un couvercle en verre de taille appropriée, glissez-le ou glissez-le avec le côté rainuré vers le haut.

Ensuite, à l’aide d’une pince fine, prélevez doucement une larve sans la presser. Un pinceau à pointe fine fonctionne également bien. Si elle est pressée, des réflexes de douleur tels que le roulement ou la courbure peuvent dominer le comportement de la larve dans le canal.

Maintenant, lavez la larve en la plongeant brièvement dans l’eau, puis placez-la dans le canal coupé en la taquinant doucement en position. Une fois dans le canal, ajustez l’orientation de la larve pour faciliter l’imagerie de la structure d’intérêt. Placez ensuite une ou deux gouttes d’eau à chaque extrémité du canal pour remplir le canal d’eau.

Si des bulles d’air sont piégées, soulevez doucement les côtés du canal pour les retirer. Pour ajuster davantage l’orientation de la larve, poussez doucement le canal pour faire rouler la larve. La larve est maintenant prête à être photographiée.

Les larves dans les canaux linéaires effectuent des épisodes soutenus de rampement rythmique. Les sondes fluorescentes sont facilement examinées. Par exemple, les larves exprimant la GFP dans leurs neurones à partir du pilote GAL4 montrent des changements dynamiques dans les intensités fluorescentes émanant du cordon nerveux pendant le cycle de rampement.

Le SNC se déplace vers l’avant presque en même temps que la tête et la queue des larves alors qu’une vague de contraction musculaire passe le long de l’axe du corps, le SNC se déplace vers l’intérieur et vers l’extérieur du plan de foyer, provoquant une modification de la fluorescence du cordon nerveux. Les changements de fluorescence ont été quantifiés à partir de trois foulées rampantes pour trois larves. La dynamique de la fluorescence du cordon nerveux au cours du cycle de foulée a suivi un modèle reproductible qui a pu être utilisé pour le phénotypage.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension de la façon de collecter les larves pour leur comportement, de préparer des canaux d’agarose et de charger les larves dans les canaux pour visualiser le comportement linéaire d’exploration. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de manipuler les larves avec douceur.