Le Colon-26 Carcinome portant une tumeur de la souris comme modèle pour l'étude du cancer cachexie

Les objectifs globaux de ce protocole sont d’exécuter le modèle In Vivo de Colon 26 dans un manoir reproductible, et d’étudier correctement la fonte et la faiblesse musculaires progressives qui se produisent en association avec la croissance tumorale. Ce modèle peut aider à répondre à des questions clés dans un domaine de la cachexie cancéreuse sur la perte musculaire induite par la tumeur, la faiblesse musculaire, l’augmentation du catabolisme musculaire et les niveaux de cytokines hyper-inflammatoires. Le principal avantage de ce modèle expérimental est que le changement est compatible avec un phénotype cachectique qui peut être facilement déclenché dans un manoir dépendant du temps à mesure que la gravité de la perte augmente.

Rafael Barreto, un technicien de mon laboratoire, et Joseph Rupert, un doctorant du groupe de Teresa Zimmer, feront la démonstration de ces procédures. Pour implanter les tumeurs C 26, utilisez une seringue à insuline stérile d’un millimètre, équipée d’une aiguille de calibre 26 pour injecter rapidement une fois 10 à la sixième cellules par voie sous-cutanée et interscapulaire dans les coussinets adipeux de souris individuelles, adultes, CD deux F un. Remettez les animaux dans leur cage après l’injection de la tumeur, avec surveillance.

Vérifier les souris et enregistrer leur poids corporel quotidiennement. Lorsque la perte de poids corporel chez l’hôte tumoral, par rapport aux animaux témoins, atteint 5, 10 ou 15 % par rapport à leur poids corporel initial, prélevez un à un virgule cinq millilitres de sang par ponction cardiaque et transférez les échantillons de sang individuels dans des tubes EDTA de potassium vides de 18 milligrammes. Placez les tubes sur de la glace jusqu’à ce que tout le sang ait été recueilli.

Ensuite, centrifugez les échantillons, en recueillant le plasma et le sérum à la fin de la centrifugation. Pour éviter toute contamination supplémentaire, vaporisez de l’éthanol à 70 % sur l’ensemble du corps. Placez ensuite l’animal sur un lit de dissection en position couchée et fixez un membre postérieur à une burette surélevée pour étendre le membre verticalement.

À l’aide d’une pince Dumont, saisissez la peau superficielle du membre postérieur et utilisez des ciseaux fins incurvés pour retirer doucement la peau et le fascia, exposant ainsi les muscles ventraux sous-jacents du membre inférieur. Identifier le muscle gastrocnémien sur le membre inférieur postérieur par son origine au niveau des condyles latéraux et médiaux du fémur postérieur, et son insertion au niveau du calcanéum, de la fiole du tendon calcanéen. Utilisez la pince pour saisir l’extrémité distale du gastrocnémien et tirez le ventre musculaire vers son origine.

Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez le muscle à son origine, au plus près du fémur et transférez le muscle dans un plat pré-pesé. Pesez immédiatement le plat et transférez le muscle dans un tube cryogénique pré-étiqueté. Ensuite, identifiez le muscle tibial antérieur depuis son origine à la surface antérolatérale du tibia et son insertion dans le cunéiforme médial via son tendon distal.

Ensuite, saisissez le pied par les doigts avec l’index et le pouce, et insérez la pointe de la pince de Dumont immédiatement sous le tendon distal superficiel du tibia. Déplacez la pince de manière à ce que le côté émoussé puisse être utilisé pour détacher le muscle tibial du tissu conjonctif sous-jacent, et utilisez les ciseaux fins et incurvés pour couper le tendon distal. Ensuite, coupez le muscle à l’origine, au plus près du tibia.

Lorsque tous les muscles ont été prélevés, immergez la moitié inférieure d’un bécher en plastique de 50 millilitres contenant de l’isopentane dans de l’azote liquide. Lorsque l’isopentane devient légèrement visqueux, avec une doublure stratifiée blanche solide visible à l’intérieur du bécher, versez quelques gouttes de produit d’enrobage sur un mandrin. Ensuite, prenez un muscle par le tendon et positionnez soigneusement l’extrémité du muscle frais sur le milieu d’enrobage.

En le tenant verticalement, par rapport au bouchon. Ensuite, en gardant le muscle vertical, trempez le mandrin et le muscle attaché dans le bain d’isopentane pendant sept à 15 secondes jusqu’à ce que le tissu soit complètement gelé. Un spécimen bien congelé apparaîtra d’un blanc crayeux.

Ensuite, placez le muscle dans un tube d’échantillon pour un stockage immédiat à moins 80 degrés Celsius. Pour préserver l’ARN et la structure enzymatique ainsi que les échantillons de tibial, il est nécessaire de congeler les tissus musculaires dès que possible après leur extraction. Pour sectionner le tissu musculaire gelé, réglez d’abord la température de fonctionnement de la chambre intérieure du cryostat à moins 23 degrés Celsius.

Laissez l’échantillon négatif de 80 degrés Celsius s’acclimater à la température de travail pendant quelques heures. Ensuite, obtenez plusieurs sections de huit microns d’épaisseur de l’échantillon dans la région médiane du muscle abdominal, perpendiculairement à l’axe de montage. Collecte des sections sur les lames de verre à température ambiante au fur et à mesure de leur coupe.

Conservez les échantillons à l’intérieur de la chambre du cryostat jusqu’à ce que toutes les sections aient été collectées. Ensuite, conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse plus approfondie. La cinétique de croissance tumorale en C26 présente une phase de latence pendant les sept à huit premiers jours après l’injection, suivie d’une croissance cellulaire exponentielle pendant quatre à cinq jours.

La masse tumorale atteignant finalement environ 10 % du poids corporel de l’animal. Les souris porteuses de tumeurs semblent émaciées et présentent une fourrure échevelée à la fin de la période expérimentale. Avec une réduction de 20 à 30 % du poids des muscles squelettiques.

Le muscle cardiaque est également considérablement réduit en poids. Bien que dans une moindre mesure par rapport aux autres muscles. Il est intéressant de noter que l’hépatomégalie et la splénomagilie sont également généralement détectées chez les hôtes tumoraux.

Alors que la masse grasse, similaire à la masse musculaire squelettique, est sévèrement épuisée. La perte de poids des muscles squelettiques est également compatible et proportionnelle à la réduction de la taille des fibres musculaires. Comme observé par l’évaluation morphométrique immunofluorescente des sections transversales des fibres musculaires.

En particulier, l’analyse de la distribution de fréquence démontre un glissement vers des fibres de plus petite taille chez les souris porteuses de C 26. Suggérant que l’ensemble du muscle subit une atrophie en présence d’une tumeur C26. Des résultats similaires peuvent également être observés par l’analyse HNE.

Bien que l’ampleur du changement dans la section transversale musculaire associée à la croissance du cancer soit légèrement différente. L’utilisation appropriée d’un modèle C 26 permet d’étudier la cachexie dérivée de la tumeur. Le modèle ressemble beaucoup à une maladie humaine montrant une réduction globale de la masse ainsi qu’une atrophie des fibres musculaires, une inflammation et un hyper catabolisme.

Lors de la réalisation de cette expérience, la souche de six des souris, la source et le nombre de cellules tumorales et le site d’implantation peuvent être modifiés. De telles modifications peuvent entraîner des différences dans les résultats attendus. Malgré quelques limitations connues, telles que l’environnement de croissance non physiologique, la dépendance à l’action de l’IL six et l’utilisation nécessaire de souris CD deux F one ou Valve C, le modèle C 26 a grandement contribué à la compréhension des mécanismes moléculaires de la cachexie induite par le cancer.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reproduire le modèle de cachexie cancéreuse C26 pour étudier la fonte et la faiblesse musculaires progressives qui se produisent généralement, en même temps que le développement de la tumeur. Sachez que travailler avec le modèle C 26 nécessite une familiarité avec les techniques de manipulation des animaux. Les meilleures pratiques doivent toujours être utilisées pour exécuter ce protocole aussi humainement que possible.